流通池的制作方法
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序列表的参考
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背景技术
一些可用的核酸测序平台利用边合成边测序方法。利用这种方法，合成新生链，并且以光学和/或电子方式检测生长链中每种单体(例如，核苷酸)的添加。因为模板链指导新生链的合成，人们可根据在合成期间添加到生长链的一系列核苷酸单体推断出模板DNA的序列。在一些示例中，可使用顺序配对末端测序，其中对正向链进行测序和移除，然后对反向链进行构建和测序。在其他示例中，可使用同时配对末端测序，其中同时对正向链和反向链进行测序。
技术实现要素：
本文公开的方法的一些示例和方面生成用于顺序配对末端读段的流通池。本文公开的方法的其他示例和方面生成用于同时配对末端读段的流通池。该方法提供了用于生成各种流通池表面的简化图案化技术。
本文所公开的第一方面是一种流通池，该流通池包括：基部支持物；定位在该基部支持物上方的多层叠堆，该多层叠堆包括：定位在该基部支持物上方的树脂层和定位在该树脂层上方的疏水层；和凹入部，该凹入部通过疏水材料并通过树脂的一部分限定在该多层叠堆中。
第一方面的示例还包括位于该凹入部中的聚合物水凝胶。此示例还可包括附接到聚合物水凝胶的引物。
在第一方面的示例中，该凹入部的第一区域包括：第一聚合物水凝胶和附接到第一聚合物水凝胶的第一引物组；并且该凹入部的第二区域包括：第二聚合物水凝胶和附接到第二聚合物水凝胶的第二引物组，其中第一引物组不同于第二引物组。
应当理解，本文所公开的第一方面的任何特征可以任何期望的方式和/或构型组合在一起，以实现如本公开所述的益处，包括例如被疏水区域包围的凹入部。
本文所公开的第二方面是一种方法，该方法包括通过以下方式限定在树脂层上方包括疏水层的多层叠堆中的凹入部：i)蚀刻穿过该疏水层的深度；或ii)将该疏水层压印并蚀刻穿过该疏水层的深度；或iii)压印穿过该疏水层的深度并穿过该树脂层的深度的一部分；以及在该凹入部的至少一个区域中施加官能化层。
在第二方面的示例中，限定凹入部包括ii)将疏水层压印并蚀刻穿过疏水层的深度，并且疏水层的压印和蚀刻包括：压印穿过该疏水层的深度的一部分；以及蚀刻疏水层的深度的剩余部分，由此树脂层充当蚀刻停止层。
在第二方面的示例中，限定凹入部包括i)蚀刻穿过疏水层的深度，并且在蚀刻穿过疏水层的深度之前，该方法还包括：在疏水层上方施加剥离抗蚀剂(lift-off resist)和附加树脂层；压印所述附加树脂层以在其中形成凹面区域；以及通过选择性地蚀刻附加树脂层和剥离抗蚀剂的部分，将凹面区域延伸到疏水层的表面，由此附加树脂层和剥离抗蚀剂的与凹面区域相邻的其他部分保持完整。在该示例中，在施加官能化层之后，该方法还可包括剥离该剥离抗蚀剂的其他部分。
在第二方面的示例中：在施加官能化层之前，该方法还包括：在凹入部的第一部分上方施加牺牲层，由此凹入部的第二部分被暴露；其中将官能化层施加在牺牲层和凹入部的第二部分上方；并且在施加官能化层之后，该方法还包括：去除牺牲层以暴露凹入部的第一部分，并且在凹入部的第一部分上方施加第二官能化层。
应当理解，第二方面的任何特征可以任何期望的方式组合在一起。此外，应当理解，第一方面和/或第二方面的特征的任何组合可一起使用，并且/或者可与本文所公开的任何示例组合以实现如本公开所述的益处，包括例如用于图案化各种流通池表面的简化方法。
本文所公开的第三方面是一种方法，该方法包括在限定在基底中的凹入部的第一部分上方施加牺牲层，由此凹入部的第二部分保持暴露；在所述牺牲层和所述凹入部的所述第二部分上方施加第一官能化层；去除施加在其上的所述牺牲层和所述第一官能化层，从而暴露所述凹入部的所述第一部分；在所述凹入部的所述第二部分上方施加第二官能化层；以及将相应引物组附接到第一官能化层和第二官能化层。
在第三方面的示例中，基底包括在基部支持物上方的树脂层；并且凹入部通过树脂层的一部分来限定。
在第三方面的示例中，在第一部分上方施加牺牲层之前，该方法还包括使用纳米压印光刻在树脂层中形成凹入部。
在第三方面的示例中，在第一部分上方施加牺牲层之前，该方法还包括通过以下方式在树脂层中形成凹入部：将光致抗蚀剂施加到树脂层；使所述光致抗蚀剂显影以限定其中可溶性光致抗蚀剂被去除的凹入部图案和其中不溶性光致抗蚀剂保留在所述树脂层上方的间隙图案；在所述凹入部图案处蚀刻所述树脂层；以及去除不溶性光致抗蚀剂。
应当理解，第三方面的任何特征可以任何期望的方式组合在一起。此外，应当理解，第一方面和/或第二方面和/或第三方面的特征的任何组合可一起使用，并且/或者可与本文所公开的任何示例组合以实现如本公开所述的益处，包括例如用于图案化各种流通池表面的简化方法。
本文公开的第四方面是一种方法，该方法包括压印树脂层以形成包括深部分和由台阶部分限定的浅部分的凹面区域，其中该树脂层定位在多层叠堆上方，该多层叠堆包括具有差分蚀刻速率的至少两个层，该多层叠堆定位在基部支持物上方；选择性地蚀刻所述树脂层和所述至少两个层以形成与所述深部分相邻的凹入部；将第一官能化层施加到所述凹入部；选择性地蚀刻所述树脂层、所述至少两个层或其组合以暴露所述台阶部分下面的区域；以及将第二官能化层施加到该暴露区域。
在第四方面的示例中，所述至少两个层包括定位在附加树脂层上方的牺牲层。在该示例中，选择性蚀刻以形成凹入部包括：蚀刻深部分下面的树脂层的第一部分；蚀刻所述深部分下面的所述牺牲层的一部分，从而暴露所述附加树脂层的一部分；以及蚀刻i)树脂层的第二部分以暴露牺牲层的另一部分，和ii)附加树脂层的暴露部分。在该示例中，选择性蚀刻以暴露台阶部分下面的区域包括，蚀刻牺牲层的第二部分以暴露附加树脂层的第二部分。在该示例中，将第二官能化层施加到附加树脂层的第二部分，并且该方法还包括蚀刻牺牲层的剩余部分。
在第四方面的示例中，所述至少两个层包括定位在牺牲层上方的聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层。在该示例中，选择性蚀刻以形成凹入部包括：蚀刻深部分下面的树脂层的第一部分；蚀刻所述深部分下面的所述聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层的一部分；以及蚀刻深部分下面的牺牲层的一部分，从而在牺牲层中形成凹入部。在该示例中，台阶部分下面的区域是基部支持物的一部分，并且其中选择性地蚀刻以暴露台阶部分下面的区域包括：蚀刻树脂层的台阶部分；蚀刻所述台阶部分下面的所述聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层的第二部分；以及蚀刻台阶部分下面的牺牲层的第二部分。在该示例中，将第二官能化层施加到基部支持物的部分，并且其中该方法还包括：剥离聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层的剩余部分；以及蚀刻牺牲层的剩余部分。
在第四方面的示例中，所述至少两个层包括定位在牺牲层上方的聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层，该牺牲层定位在附加树脂层上方。在该示例中，选择性蚀刻以形成凹入部包括：蚀刻深部分下面的树脂层的第一部分；蚀刻所述深部分下面的所述聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层的一部分；以及蚀刻深部分下面的牺牲层的一部分，从而在牺牲层中形成凹入部。在该示例中，在蚀刻深部分下面的牺牲层的部分之前，该方法还包括蚀刻树脂层以去除台阶部分并暴露聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层的第二部分。在该示例中，台阶部分下面的区域是附加树脂层的一部分，并且其中选择性地蚀刻以暴露台阶部分下面的区域包括：蚀刻聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层的第二部分；以及蚀刻聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层的第二部分下面的牺牲层的第二部分。在该示例中，将第二官能化层施加到附加树脂层的部分，并且其中该方法还包括：剥离聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层的剩余部分；以及蚀刻牺牲层的剩余部分。
应当理解，第四方面的任何特征可以任何期望的方式组合在一起。此外，应当理解，第一方面和/或第二方面和/或第三方面和/或第四方面的特征的任何组合可一起使用，并且/或者可与本文所公开的任何示例组合以实现如本公开所述的益处，包括例如用于图案化各种流通池表面的简化方法。
本文公开的第五方面是一种方法，该方法包括在基底上方施加第一官能化层，该基底包括具有深部分和由台阶部分限定的浅部分的凹面区域；图案化第一官能化层，从而形成由与台阶部分相邻的深部分中的光致抗蚀剂覆盖的第一官能化区域；以及在基底和光致抗蚀剂上方施加第二官能化层。
第五方面的示例还包括干蚀刻基底以去除台阶部分并形成与第一官能化区域相邻的凹入部。在这些示例中的一些示例中，在施加第二官能化层之后，该方法还包括剥离光致抗蚀剂和其上的第二官能化层；以及去除第二官能化层的一部分，从而形成与第一官能化区域相邻的第二官能化区域。在这些示例中的一些示例中，图案化第一官能化层包括：将光致抗蚀剂施加在第一官能化层上方；以及干蚀刻光致抗蚀剂和第一官能化层，直到台阶部分被暴露。在该示例中，基底的干蚀刻或光致抗蚀剂的干蚀刻包括反应离子蚀刻。
如所提及的，第五方面的示例还包括干蚀刻基底以去除台阶部分并形成与第一官能化区域相邻的凹入部。在这些示例中的一些示例中，基底是多层叠堆，该多层叠堆包括在基部支持物上方的树脂层；在施加第一官能化层之前，该方法还包括压印树脂层以形成凹面区域并且选择性地蚀刻树脂层以在深部分处暴露基部支持物；所述基底的干蚀刻包括干蚀刻所述树脂层；并且基部支持物用作干蚀刻期间的蚀刻台阶。在这些示例中的一些示例中，在施加第二官能化层之后，该方法还包括剥离光致抗蚀剂和其上的第二官能化层；以及去除第二官能化层的一部分，从而形成与第一官能化区域相邻的第二官能化区域。在这些示例中的一些示例中，图案化第一官能化层包括：将光致抗蚀剂施加在第一官能化层上方；以及干蚀刻光致抗蚀剂和第一官能化层，直到台阶部分被暴露。
应当理解，第五方面的任何特征可以任何期望的方式组合在一起。此外，应当理解，第一方面和/或第二方面和/或第三方面和/或第四方面和/或第五方面的特征的任何组合可一起使用，并且/或者可与本文所公开的任何示例组合以实现如本公开所述的益处，包括例如用于图案化各种流通池表面的简化方法。
本文所公开的第六方面是一种方法，该方法包括压印附加树脂层以在其中形成凹面区域，其中该附加树脂层定位在聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层上方，该聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层定位在第一树脂层上方；通过蚀刻所述附加树脂层的第一部分和所述聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层的第一部分来暴露所述凹面区域下面的所述第一树脂层的一部分；蚀刻i)所述附加树脂层以暴露所述聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层的第二部分和ii)所述第一树脂层的所述暴露部分以在所述第一树脂层中形成凹入部；在所述凹入部和所述聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层的第二部分上方施加官能化层；以及去除聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层的第二部分和其上的官能化层。
应当理解，第六方面的任何特征可以任何期望的方式组合在一起。此外，应当理解，第一方面和/或第二方面和/或第三方面和/或第四方面和/或第五方面和/或第六方面的特征的任何组合可一起使用，并且/或者可与本文所公开的任何示例组合以实现如本公开所述的益处，包括例如用于图案化各种流通池表面的简化方法。
本文所公开的第七方面是一种方法，该方法包括压印树脂层以形成凸面区域，其中该树脂层定位在多层叠堆上方，该多层叠堆包括在基底上方的官能化层上方的剥离抗蚀剂；选择性地蚀刻所述树脂层、所述剥离抗蚀剂和所述官能化层的部分以暴露所述基底的部分，由此所述剥离抗蚀剂和所述官能化层的与所述凸面区域相邻的其他部分保持完整；以及剥离该剥离抗蚀剂的其他部分。
在第七方面的示例中，基底包括基部支持物和该基部支持物上方的附加树脂层。
应当理解，第七方面的任何特征可以任何期望的方式组合在一起。此外，应当理解，第一方面和/或第二方面和/或第三方面和/或第四方面和/或第五方面和/或第六方面和/或第七方面的特征的任何组合可一起使用，并且/或者可与本文所公开的任何示例组合以实现如本公开所述的益处，包括例如用于图案化各种流通池表面的简化方法。
本文公开的第八方面是一种方法，该方法包括：压印树脂以形成凸面区域，其中树脂定位在多层叠堆上方，该多层叠堆包括基底上方的牺牲层；选择性地蚀刻所述树脂和所述牺牲层的围绕所述凸面区域的部分，以暴露所述基底的一部分；图案化光致抗蚀剂以覆盖所述基底的所述暴露部分；暴露所述牺牲层下面的所述基底的第二部分；在所述基底的所述暴露的第二部分上方施加官能化层；以及剥离光致抗蚀剂。
在第八方面的示例中，基底包括在基部支持物上方的附加树脂层。在该示例中，选择性蚀刻还包括选择性地蚀刻穿过附加树脂层的深度的一部分，以在具有凸面区域的形状的附加树脂层中形成突起部。在该示例中，选择性蚀刻暴露附加树脂层的表面。
应当理解，第八方面的任何特征可以任何期望的方式组合在一起。此外，应当理解，第一方面和/或第二方面和/或第三方面和/或第四方面和/或第五方面和/或第六方面和/或第七方面和/或第八方面的特征的任何组合可一起使用，并且/或者可与本文所公开的任何示例组合以实现如本公开所述的益处，包括例如用于图案化各种流通池表面的简化方法。
附图说明
通过参考以下具体实施方式和附图，本公开的示例的特征将变得显而易见，其中类似的附图标号对应于类似但可能不相同的部件。为了简洁起见，具有先前描述的功能的附图标号或特征可结合或可不结合它们出现的其他附图来描述。
图1A至图1C是一起说明所公开的方法的一个示例的示意图；
图2A是流通池的实施例的顶视图；
图2B是流通池的泳道的示例的放大局部剖面图，该流通池包括凹入部的阵列；
图3A和图3B是一起说明本文所公开的方法的另一个示例的示意图；
图4A至图4D是一起说明本文所公开的方法的又一个示例的示意图；
图5A至图5E是一起说明本文所公开的方法的又一个示例的示意图；
图6A至图6C是一起说明本文所公开的方法的另一个示例的示意图；
图7A至图7N是说明本文所公开的方法的两个附加示例的示意图；
图8A至图8D是附接到基底上方的第一官能化层和第二官能化层的第一引物组和第二引物组的不同示例的示意图；
图9A至图9F是一起说明本文所公开的方法的另一个示例的示意图；
图10是描绘了用于在树脂层中形成凹入部的一个示例的示意图；
图11是描绘了用于在树脂层中形成凹入部的另一个示例的示意图；
图12A至图12H是一起说明本文所公开的方法的又一个示例的示意图；
图13A至图13H是一起说明本文所公开的方法的又一个示例的示意图；
图14A至图14J是一起说明本文所公开的方法的另一个示例的示意图；
图15A至图15K是一起说明本文所公开的方法的两个附加示例的示意图；
图16A至图16I是一起说明本文所公开的方法的又一个示例的示意图；并且
图17A和图17B是原始彩色照片的黑白复印件，描绘了根据本文所公开的示例沉积以形成相邻贴片/垫的聚合物水凝胶的示例。
具体实施方式
本文所公开的流通池的示例可用于核酸测序。
一些流通池包括附接到流通池基底的不同区域的不同引物组。在这些示例中，可控制引物组，使得切割(线性化)化学物质在不同区域中正交。正交切割化学物质可通过与不同组中的不同引物附接的相同切割位点或通过与不同组中的不同引物附接的不同切割位点来实现。这使得能够在基底的一个区域中生成正向链的簇，并在基底的另一区域中生成反向链的簇。在一个示例中，这些区域彼此直接相邻。在另一个示例中，这些区域之间的任何空间足够小，使得成簇可跨越两个区域。利用本文所公开的一些流通池构型，正向链和反向链在空间上是分开的，这将来自两个读段的荧光信号分开，同时允许对每个读段的同时碱基检出。因此，本文所公开的流通池的一些示例使得能够获得同时配对末端读段。描述了生成这些流通池的几种示例性方法。
流通池中的其他流通池包括附接到流通池基底的不同区域的相同引物组。在这些示例中，引物组在每个区域中包括两种不同的引物。这至少提供了以下益处：i)正向链的簇将在基底的每个区域中生成、测序和移除；和ii)反向链的簇将在基底的每个区域中生成、测序和移除。因此，本文所公开的流通池的其他示例使得能够获得顺序配对末端读段。描述了生成这些流通池的几种示例性方法。
定义
应当理解，除非另外指明，否则本文所用的术语将理解为具有其在相关领域中的普通含义。下面列出本文所用的若干术语及其含义。
除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。
术语包含、包括、含有和这些术语的各种形式彼此同义，并且意在是同样宽泛的。
术语顶部、底部、下部、上部、上等在本文中用于描述流通池和/或流通池的各个部件。应当理解，这些方向术语并非意在暗示特定取向，而是用于指定部件之间的相对取向。方向术语的使用不应被解释为将本文所公开的示例限制于任何特定取向。
术语第一、第二等也并非意在暗示特定的取向或顺序，而是用于将一个部件与另一个部件区分开来。
应当理解，本文提供的范围包括规定范围和规定范围内的任何值或子范围，如同此类值或子范围被明确列举一样。例如，约400nm至约1μm(1000nm)的范围应被解释为不仅包括明确列举的约400nm至约1μm的限值，而且还包括单个值，诸如约708nm、约945.5nm等，以及子范围，诸如约425nm至约825nm，约550nm至约940nm等。此外，当利用“约”和/或“基本上”来描述值时，它们意在涵盖与所述值的微小变化(高达+/-10％)。
“丙烯酰胺单体”是具有结构的单体或包含丙烯酰胺基团的单体。包含丙烯酰胺基团的单体的示例包括叠氮基乙酰氨基戊基丙烯酰胺：和N-异丙基丙烯酰胺：可使用其他丙烯酰胺单体。
如本文所用，醛是包含具有结构-CHO的官能团和R基团诸如烷基或其他侧链的有机化合物，结构-CHO包括碳原子也与氢键合的羰基中心(即，与氧双键键合的碳)。醛的通式结构是：
如本文所用，“烷基”是指完全饱和(即，不包含双键和三键)的直链或支链烃链。烷基基团可具有1至20个碳原子。典型的烷基基团包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基等。作为示例，名称“C1-C4烷基”指示烷基链中存在一至四个碳原子，即烷基链选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。
如本文所用，“烯基”是指包含一个或多个双键的直链或支链烃链。烯基基团可具有2至20个碳原子。示例性烯基基团包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基等。
如本文所用，“炔烃”或“炔基”是指包含一个或多个三键的直链或支链烃链。炔基基团可具有2至20个碳原子。
如本文所用，“芳基”是指在环骨架中仅包含碳的芳族环或环系(即，共用两个相邻碳原子的两个或更多个稠环)。当芳基为环系时，该环系中的每个环均为芳族的。芳基基团可具有6至18个碳原子。芳基基团的示例包括苯基、萘基、薁基和蒽基。
“氨基”官能团是指-NRaRb基团，其中Ra和Rb各自独立地选自氢(例如)、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C7碳环基、C6-C10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基，如本文所定义。
如本文所用，术语“附接”是指两个事物直接或间接地彼此接合、紧固、粘附、连接或结合的状态。例如，核酸可通过共价键或非共价键附接到官能化聚合物。共价键的特征在于原子之间共享电子对。非共价键是不涉及共享电子对的物理键，并且可包括例如氢键、离子键、范德华力、亲水相互作用和疏水相互作用。
“叠氮化物”或“叠氮基”官能团是指-N3。
如本文所用，“粘结区域”是指基底的要粘结到另一材料的区域，该另一材料可例如为间隔层、盖、另一基底等或其组合(例如，间隔层和盖，或间隔层和另一基底)。在粘结区域形成的粘结可以是化学粘结(如上所述)或机械粘结(例如，使用紧固件等)。
如本文所用，“碳环基”意味着在环系主链中仅含有碳原子的非芳族环状环或环系。当碳环基为环系时，两个或更多个环可以以稠合、桥接或螺接的方式接合在一起。碳环基可具有任何饱和度，前提条件是环系中的至少一个环不是芳族的。因此，碳环基包括环烷基、环烯基和环炔基。碳环基团可具有3至20个碳原子。碳环基环的示例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、2,3-二氢-茚、双环[2.2.2]辛烷基、金刚烷基和螺[4.4]壬烷基。
如本文所用，术语“羧酸”或“羧基”是指-COOH。
如本文所用，“亚环烷基”是指完全饱和的碳环或环系，其通过两个连接点连接到分子的其余部分。
如本文所用，“环烯基”或“环烯烃”是指具有至少一个双键的碳环或环系，其中该环系中没有环是芳族的。示例包括环己烯基或环己烯以及降冰片烯基或降冰片烯。也如本文所用，“杂环烯基”或“杂环烯烃”是指在环主链中具有至少一个杂原子且具有至少一个双键的碳环或环系，其中该环系中没有环是芳族的。
如本文所用，“环炔基”或“环炔烃”是指具有至少一个三键的碳环或环系，其中该环系中没有环是芳族的。一个示例为环辛炔。另一个示例为双环壬炔。也如本文所用，“杂环炔基”或“杂环炔烃”是指在环主链中具有至少一个杂原子且具有至少一个三键的碳环或环系，其中该环系中没有环是芳族的。
如本文所用，术语“沉积”是指任何合适的施加技术，其可为手动的或自动的，并且在一些情况下，导致表面特性的改性。一般来讲，可使用气相沉积技术、涂覆技术、接枝技术等进行沉积。一些具体示例包括化学气相沉积(CVD)、喷涂(例如，超声喷涂)、旋涂、厚涂或浸涂、刮涂刀涂覆、搅打分配、流动通过涂覆(flow through coating)、气溶胶印刷、丝网印刷、微接触印刷、喷墨印刷等。
如本文所用，术语“凹入部”是指基底中的离散凹面特征部，该离散凹面特征部具有至少部分地被基底的间隙区域包围的表面开口。凹入部可在其表面中的开口处具有多种形状中的任一种，包括例如圆形、椭圆形、正方形、多边形、星形(具有任何数量的顶点)等。与该表面正交截取的凹入部的横截面可为弯曲的、正方形、多边形、双曲线形、圆锥形、角形等。例如，凹入部可以是一个孔或两个互连的孔。凹入部还可具有更复杂的结构，诸如脊、台阶特征部等。
当参考项目的集合使用时，术语“每个”旨在识别集合中的单个项目，但不一定是指集合中的每个项目。如果明确公开或上下文另有明确规定，则可能会出现例外情况。
如本文所用，术语“环氧基”(也称为缩水甘油基或环氧乙烷基)是指
如本文所用，术语“流通池”旨在表示具有其中可进行反应的流动通道、用于将试剂递送到流动通道的入口以及用于从流动通道中移除试剂的出口的容器。在一些示例中，流通池适于检测在该流通池中发生的反应。例如，流通池可包括允许对阵列、光学标记分子等进行光学检测的一个或多个透明表面。
如本文所用，“流动通道”可为限定在两个粘结部件之间的区域，该区域可选择性地接纳液体样品。在一些示例中，流动通道可限定在基底的图案化树脂与盖之间，并且因此可与限定在图案化树脂中的一个或多个凹入部流体连通。在其他示例中，流动通道可限定在两个基底之间(其中的每个基底均具有其上的测序化学物质)。
如本文所用，“杂芳基”是指在环主链中含有一个或多个杂原子(即，除碳之外的元素，包括但不限于氮、氧和硫)的芳族环或环系(即，共用两个相邻原子的两个或更多个稠环)。当杂芳基是环系时，该环系中的每个环均是芳族的。杂芳基基团可具有5-18个环成员。
如本文所用，“杂环基”是指在环主链中含有至少一个杂原子的非芳族环状环或环系。杂环可以稠合、桥接或螺接的方式接合在一起。杂环可具有任何饱和度，前提条件是环系中的至少一个环不是芳族的。在环系中，杂原子可存在于非芳族环或芳族环中。杂环基团可具有3至20个环成员(即，构成环主链的原子数，包括碳原子和杂原子)。在一些示例中，杂原子是O、N或S。
如本文所用，术语“肼”或“肼基”是指-NHNH2基团。
如本文所用，术语“腙”或“肼基”是指基团，其中Ra和Rb各自独立地选自氢、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C7碳环、C6-C10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环，如本文所定义。
如本文所用，“羟基”是指-OH基团。
如本文所用，术语“间隙区域”是指例如基底、图案化树脂或其他支持物的分开凹入部或突起部的区域。例如，间隙区域可将阵列的一个凹入部与阵列的另一个凹入部分开。彼此分开的两个凹入部或突起部可以是离散的，即彼此缺乏物理接触。在许多示例中，间隙区域是连续的，而凹入部或突起部是离散的，例如，如限定在其他连续表面中的多个凹入部或突起部的情况。在其他示例中，间隙区域和特征部是离散的，例如，由相应间隙区域分开的沟槽形状的多个凹入部的情况就是如此。由间隙区域提供的分离可以是部分分离或完全分离。间隙区域可具有与凹入部或突起部的表面材料不同的表面材料。例如，凹入部可在其中具有聚合物和第一引物组，并且间隙区域可在其上具有聚合物和第二引物组。又如，阵列的凹入部可在其中具有小珠，而间隙区域在其上不具有小珠。
如本文所用，“负性光致抗蚀剂”是指其中暴露于特定波长的光的部分变得不溶于显影剂的光敏材料。在这些示例中，不溶性负性光致抗蚀剂在显影剂中具有小于5％的溶解度。对于负性光致抗蚀剂，曝光会改变化学结构，从而使材料的暴露部分在显影剂中变得更难溶解(相比于未暴露部分)。虽然不溶于显影剂，但不溶性负性光致抗蚀剂可至少95％可溶于不同于显影剂的去除剂。去除剂可以是例如在剥离过程中使用的溶剂或溶剂混合物。
与不溶性负性光致抗蚀剂相比，不暴露于光的负性光致抗蚀剂的任何部分至少95％可溶于显影剂。在一些示例中，不暴露于光的负性光致抗蚀剂的部分至少98％，例如99％、99.5％、100％可溶于显影剂。
如本文所用，“腈氧化物”是指“RaC≡N+O-”基团，其中Ra在本文定义。制备腈氧化物的示例包括通过用氯酰胺-T处理或通过碱基在酰亚胺氯[RC(Cl)＝NOH]上的作用或通过羟胺与醛之间的反应由醛肟原位生成。
如本文所用，“硝酮”是指基团，其中R1、R2和R3可以是本文定义的Ra基团和Rb基团中的任一者。
如本文所用，“核苷酸”包括含氮杂环碱基、糖以及一个或多个磷酸基团。核苷酸是核酸序列的单体单元。在RNA中，糖是核糖，并且在DNA中，糖是脱氧核糖，即在核糖中缺少存在于2'位置处的羟基基团的糖。含氮杂环碱基(即，核碱基)可为嘌呤碱基或嘧啶碱基。嘌呤碱基包括腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)以及它们的修饰衍生物或类似物。嘧啶碱基包括胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)以及它们的修饰衍生物或类似物。脱氧核糖的C-1原子与嘧啶的N-1或嘌呤的N-9键合。核酸类似物可具有改变的磷酸主链、糖或核碱基中的任一者。核酸类似物的示例包括例如通用碱基或磷酸-糖主链类似物，诸如肽核酸(PNA)。
在一些示例中，术语“在……上方”可表示一个部件或材料直接位于另一个部件或材料上。当一个直接在另一个上时，两个彼此接触。在图1A中，将树脂层18施加在基础基底22上方，使得其直接在基础基底22上并与其接触。
在其他示例中，术语“在……上方”可表示一个部件或材料间接位于另一个部件或材料上。所谓间接地，表示间隙或另外的部件或材料可位于两个部件或材料之间。在图1A中，疏水层16定位在基础基底22上方，使得两者间接接触。更具体地，疏水层16间接在基础基底22上，因为树脂层18位于两个部件16和22之间。
“图案化树脂”是指可具有限定于其中的凹入部和/或突起部的任何聚合物。树脂以及用于使树脂图案化的技术的具体示例将在下文中进一步描述。
如本文所用，“正性光致抗蚀剂”是指其中暴露于特定波长的光的部分变得可溶于显影剂的光敏材料。在这些示例中，暴露于光的正性光致抗蚀剂的任何部分至少95％可溶于显影剂。在一些示例中，暴露于光的正性光致抗蚀剂的部分至少98％，例如99％、99.5％、100％可溶于显影剂。对于正性光致抗蚀剂，曝光会改变化学结构，从而使材料的暴露部分在显影剂中变得更易溶解(相比于未暴露部分)。
与可溶性正性光致抗蚀剂相比，不暴露于光的正性光致抗蚀剂的任何部分不溶于(少于5％可溶于)显影剂。虽然不溶于显影剂，但不溶性正性光致抗蚀剂可至少95％可溶于不同于显影剂的去除剂。在一些示例中，不溶性正性光致抗蚀剂至少98％，例如99％、99.5％、100％可溶于去除剂。去除剂可以是在剥离过程中使用的溶剂或溶剂混合物。
如本文所用，“引物”被定义为单链核酸序列(例如，单链DNA或单链RNA)。本文称为扩增引物的一些引物用作模板扩增和簇生成的起点。本文称为测序引物的其他引物用作DNA或RNA合成的起点。引物的5'末端可被修饰以允许与聚合物的官能团进行偶联反应。引物长度可以是任何数目的碱基长度并且可包括多种非天然核苷酸。在一个示例中，测序引物为短链，范围为10至60个碱基，或20至40个碱基。
如本文所用，“间隔层”是指将两个部件粘结在一起的材料。在一些示例中，间隔层可以是有助于粘结的辐射吸收材料，或者可与有助于粘结的辐射吸收材料接触。
术语“基底”是指其上可添加流通池的各个部件(例如，聚合物、引物等)的结构。基底可以是晶片、面板、矩形片材、管芯或任何其他合适的构型。基底通常为刚性的并且不溶于水性液体。基底可对用于改性凹入部或存在于凹入部中的化学物质呈惰性。例如，基底可对用于形成聚合物、附接引物等的化学物质呈惰性。该基底可为单层结构(例如，基部支持物)或多层结构(例如，包括基部支持物和基部支持物上方的一个或多个层)。合适的基底的示例将在下文中进一步描述。
“硫醇”官能团是指-SH。
如本文所用，术语“四嗪”和“四嗪基”是指包含四个氮原子的六元杂芳基基团。四嗪可为任选取代的。
如本文所用，“四唑”是指包含四个氮原子的五元杂环基团。四唑可为任选取代的。
当参考基部支持物或层时，术语“透明”是指例如呈基底或层的形式的材料，该材料对特定波长或波长范围是透明的。例如，该材料可对用于化学改变正性或负性光致抗蚀剂的波长透明。可使用透射率来量化透明度，即，落在主体上的光能与透过主体的光能的比率。透明基部支持物或透明层的透射率将取决于基部支持物或层的厚度和光的波长。在本文所公开的示例中，透明基部支持物或透明层的透射率可在0.25(25％)至1(100％)的范围内。基部支持物或层的材料可以是纯材料、具有一些杂质的材料或材料的混合物，只要所得基部支持物或层能够具有期望的透射率即可。此外，取决于基部支持物或层的透射率，曝光的时间和/或光源的输出功率可以增加或减少，以通过透明基部支持物和/或层递送合适剂量的光能，从而实现期望的效果(例如，产生可溶性或不溶性光致抗蚀剂)。
用于顺序配对末端测序的方法和流通池
用于顺序配对末端测序的流通池的示例通常包括：基底；在该基底的至少一部分上方的官能化层；和附接到该官能化层的引物组。流通池的各个部件的构型可部分地根据用于生成流通池的方法而变化。现在将描述几个示例性方法。
图1A至图1C一起示出了用于制造流通池10A的方法的一个示例。该示例性方法包括通过压印并蚀刻疏水层16，并且在凹入部12的至少一个区域中施加官能化层20，在多层叠堆14中限定凹入部12，该多层叠堆包括树脂层18上方的疏水层16。
在图1A所示的示例中，多层叠堆14定位在基部支持物22上方。合适的基部支持物材料的示例包括：环氧硅氧烷、玻璃和改性的或官能化的玻璃、塑料(包括丙烯酸、聚苯乙烯以及苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、聚四氟乙烯(诸如得自Chemours的)、环烯烃/环烯烃聚合物(COP)(诸如得自Zeon的)、聚酰亚胺等)、尼龙、陶瓷/陶瓷氧化物、二氧化硅、熔融的二氧化硅或基于二氧化硅的材料、硅酸铝、硅和改性的硅(例如，硼掺杂的p+硅)、氮化硅(Si3N4)、氧化硅(SiO2)、五氧化二钽(Ta2O5)或其他氧化钽(TaOx)、氧化铪(HfO2)、碳、金属、无机玻璃等。基部支持物22也可为多层结构。多层结构的一些示例包括玻璃或硅，在表面处具有氧化钽或另一种陶瓷氧化物的涂层。多层结构的其他示例可包括绝缘体上硅(SOI)基底。
在一个示例中，基部支持物22可具有在约2mm至约300mm范围内的直径，或者为最大尺寸高达约10英尺(约3米)的矩形片材或面板。在一个示例中，基部支持物22为直径在约200mm至约300mm范围内的晶片。在另一个示例中，基底是宽度在约0.1mm至约10mm范围内的管芯。虽然已经提供了示例性尺寸，但应当理解，可使用具有任何合适尺寸的基部支持物22。又如，可使用作为矩形支持物的面板，该面板具有比300mm圆形晶片更大的表面积。
树脂层18可使用任何合适的沉积技术(包括本文所公开的示例)沉积在基部支持物22上方，并且使用适合树脂的条件固化。合适树脂的一些示例选自：基于多面体低聚倍半硅氧烷树脂(POSS)的树脂、环氧树脂、聚(乙二醇)树脂、聚醚树脂、丙烯酸树脂、丙烯酸酯树脂、甲基丙烯酸酯树脂以及它们的组合。虽然已经提供了若干示例，但是据信可使用可以固化的任何树脂。
如本文所用，术语“多面体低聚倍半硅氧烷”(作为从Hybrid Plastics商购获得)是指作为二氧化硅(SiO2)和有机硅(R2SiO)之间的杂交中间体(例如，RSiO1.5)的化学组合物。多面体低聚倍半硅氧烷的示例可以是如Kehagias等人在Microelectronic Engineering 86(2009)第776-778页中所述的，该文献以引用方式全文并入。在一个示例中，组合物为具有化学式[RSiO3/2]n的有机硅化合物，其中R基团可以是相同或不同的。多面体低聚倍半硅氧烷的示例性R基团包括环氧基、叠氮化物/叠氮基、硫醇、聚(乙二醇)、降冰片烯、四嗪、丙烯酸酯和/或甲基丙烯酸酯，或另外例如烷基、芳基、烷氧基和/或卤代烷基基团。本文所公开的树脂组合物可包括一个或多个不同的笼或芯结构作为单体单元。多面体结构可为T8结构，诸如：并且由下式表示：该单体单元通常具有八个官能团臂R1至R8。
单体单元可具有带有10个硅原子和10个R基团的笼结构，被称为T10，诸如：或者单体单元可具有带有12个硅原子和12个R基团的笼结构，被称为T12，诸如：基于多面体低聚倍半硅氧烷的材料可另选地包括T6、T14或T16笼结构。平均笼含量可在合成期间加以调节，并且/或者通过纯化方法控制，并且单体单元的笼尺寸分布可用于本文所公开的示例中。
在本文所公开的示例中的一些示例中，R1至R8或R10或R12中的至少一者包含环氧基。R1至R8或R10或R12可以相同或不同，并且在一些示例中，R1至R8或R10或R12中的至少一者包含环氧基，而R1至R8或R10或R12中的至少另一者为非环氧官能团。非环氧官能团可以是(a)与环氧基团正交反应(即，在与环氧基团不同的条件下反应)的反应性基团，其用作将树脂偶联到扩增引物、聚合物或聚合剂的手柄；或(b)调节树脂的机械或功能特性(例如，表面能调节)的基团。在一些示例中，非环氧官能团选自叠氮化物/叠氮基、硫醇、聚(乙二醇)、降冰片烯、四嗪、氨基、羟基、炔基、酮、醛、酯基、烷基、芳基、烷氧基和卤代烷基。
根据所使用的树脂层18，可使用硅烷化或等离子体灰化来活化树脂层18，以产生可与随后沉积在其上的官能化层20反应的表面基团(参见图1C)。
硅烷化可使用任何硅烷或硅烷衍生物来完成。硅烷或硅烷衍生物的选择可部分地取决于待形成的官能化层20，因为可能期望在硅烷或硅烷衍生物与官能化层20之间形成共价键。一些示例性硅烷衍生物包括环烯烃不饱和部分，诸如降冰片烯、降冰片烯衍生物(例如，包含代替碳原子之一的氧或氮的(杂)降冰片烯)、反式环辛烯、反式环辛烯衍生物、反式环戊烯、反式环庚烯、反式环壬烯、双环[3.3.1]壬-1-烯、双环[4.3.1]癸-1(9)-烯、双环[4.2.1]壬-1(8)-烯和双环[4.2.1]壬-1-烯。这些环烯烃中的任一者可例如用R基团取代，诸如氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环、芳烷基或(杂脂环)烷基。降冰片烯衍生物的示例包括[(5-双环[2.2.1]庚-2-烯基)乙基]三甲氧基硅烷。其他示例性硅烷衍生物包括环炔烃不饱和部分，诸如环辛炔、环辛炔衍生物或双环壬炔(例如，双环[6.1.0]壬-4-炔或其衍生物、双环[6.1.0]壬-2-炔或双环[6.1.0]壬-3-炔)。这些环炔烃可用本文所述的任何R基团取代。
用于连接硅烷或硅烷衍生物的方法可根据所使用的硅烷或硅烷衍生物而变化。合适的硅烷化方法的示例包括气相沉积(例如，YES方法)、旋涂或其他沉积方法。
在其他示例中，可使用等离子体灰化而不是硅烷化来活化树脂层18。等离子体灰化可产生表面活化剂(例如，羟基(C-OH或Si-OH)和/或羧基)，该表面活化剂可使随后沉积的官能化层20附着到凹入部12中的暴露树脂层18。在这些示例中，选择官能化层20，使得其与由等离子体灰化产生的表面基团反应。
可使用任何合适的沉积技术将疏水层16沉积在树脂层18上方，包括本文公开的示例。
疏水层16的示例可选自氟化聚合物、全氟化聚合物、硅聚合物以及它们的混合物。例如，疏水层16可包含无定形含氟聚合物(其可商购获得的示例包括得自AGC Chemicals的系列中的那些，其具有以下末端官能团之一：A型：-COOH、M型：-CONH-Si(OR)n或S型：-CF3)、聚四氟乙烯(其可商购获得的示例为得自Chemours的)、聚对二甲苯、氟化烃、氟丙烯酸共聚物(其可商购获得的示例包括得自Cytonix的)。
然后将疏水层16压印(图1A)并蚀刻(图1B)以形成凹入部12。因此，在该示例中，凹入部12限定在疏水层16中。如图1B所示，凹入部12的底部由树脂层18限定，并且凹入部12的壁由疏水层16限定。虽然图1A至图1C中示出了单个凹入部12，但是应当理解，可形成若干凹入部12，其中每个凹入部12通过疏水层16的间隙区域26与每个其他凹入部12隔开(参见图2B)。
在该示例性方法中，穿过疏水层16的深度的一部分进行压印；并且蚀刻去除疏水层16的深度的剩余部分，其中树脂层18充当蚀刻停止层。
可使用纳米压印光刻压印疏水层16。将纳米压印光刻模具或工作印模24(图1A)在疏水层16是软的时压入该疏水层中，这在疏水层16中产生工作印模特征的印记。然后疏水层16可在工作印模24就位的情况下被固化。在使用可辐射固化的疏水材料时，可通过暴露于光化辐射(诸如可见光辐射或紫外线(UV)辐射)来实现固化；或在使用可热固化的疏水材料时，可通过暴露于热量来实现固化。固化可促进聚合和/或交联。作为示例，固化可包括多个阶段，包括软烘烤(例如，去除溶剂)和硬烘烤。软烘烤可在较低的温度下进行，范围为约50℃至约150℃。硬烘烤的持续时间可在约100℃至约300℃的温度范围内持续约5秒至约10分钟。可用于软烘烤和/或硬烘烤的装置的示例包括热板、烘箱等。
固化后，释放工作印模24。这在疏水层16中产生形貌特征。在该示例性方法中，工作印模24不延伸穿过疏水层16的整个深度，并且因此在压印过程之后形成部分凹入部12'。如图1A所示，疏水层部分16'保留在部分凹入部12'中。
然后可蚀刻疏水层16以从部分凹入部12'去除剩余的疏水层部分16'。疏水层16的任何暴露区域可在该过程期间蚀刻，如由图1B中的向下箭头所示。因此，除了疏水层部分16'之外，可蚀刻限定间隙区域26的疏水层16的区域。然而，疏水层16和树脂层18具有不同的蚀刻速率，并且因此当去除疏水层部分16'时，树脂层18充当部分凹入部12'中的蚀刻停止层。当树脂层18暴露时，可停止蚀刻。这形成凹入部12。对于该蚀刻过程，可使用空气或氧气(O2)气体进行等离子体蚀刻。又如，可使用氧气(O2)气体进行干蚀刻。
虽然图1A至图1C示出了单个凹入部12的形成，但是应当理解，凹入部12的阵列可例如沿着流通池10A的泳道形成。图2A描绘了流通池10A的顶视图，例如，不具有与其粘结的盖或其他基底，该流通池包括八个泳道28。图2B描绘了在一个泳道28中形成的凹入部12的阵列的剖视图和透视图。
可设想凹入部12的阵列的许多不同布局，包括规则的、重复的和非规则的图案。在一个示例中，凹入部12设置在六边形网格中，以便紧密堆积和改善密度。其他布局可包括例如直线(矩形)布局、三角形布局等。在一些示例中，布局或图案可以为呈行和列形式的凹入部12的x-y格式。在一些其他示例中，布局或图案可以为凹入部12和/或间隙区域26的重复布置。在另外的其他示例中，布局或图案可以是凹入部12和/或间隙区域26的随机布置。图案可包括点、条、漩涡、线、三角形、矩形、圆形、弧形、格纹、格子、对角线、箭头、正方形和/或交叉影线。
凹入部12的布局或图案可相对于限定区域中的凹入部12的密度(凹入部12的数量)来表征。例如，凹入部12可以大约2百万个/mm2的密度存在。可将密度调整为不同的密度，包括例如约100个/mm2、约1,000个/mm2、约0.1百万个/mm2、约1百万个/mm2、约2百万个/mm2、约5百万个/mm2、约1千万个/mm2、约5千万个/mm2或更大或更小的密度。还应当理解，疏水层16中(或本文所述的其他层中)的凹入部12的密度可以介于选自上述范围的下限值中的一个值与上限值中的一个值之间。例如，高密度阵列可被表征为具有间隔小于约100nm的凹入部12，中密度阵列可被表征为具有间隔约400nm至约1μm的凹入部12，并且低密度阵列可被表征为具有间隔大于约1μm的凹入部12。虽然已提供示例性密度，但应当理解，可使用任何合适的密度。凹入部12的密度可部分地取决于凹入部12的深度。在一些情况下，可期望凹入部12之间的间距甚至大于本文所列的示例。
凹入部12的布局或图案也可根据或另选地根据从凹入部12的中心到相邻凹入部12的中心的平均节距或间距(中心到中心间距)或从一个凹入部12的左边缘到相邻凹入部12的右边缘的平均节距或间距(边缘到边缘间距)来表征。图案可以是规则的，使得围绕平均节距的变异系数较小，或者图案可以是非规则的，在这种情况下变异系数可以相对较大。在任一种情况下，平均节距可为例如约50nm、约0.1μm、约0.5μm、约1μm、约5μm、约10μm、约100μm或更大或更小。凹入部12的特定图案的平均节距可以介于选自上述范围的下限值中的一个值与上限值中的一个值之间。在一个示例中，凹入部12具有约1.5μm的节距(中心到中心间距)。虽然已经提供了示例性平均节距值，但应当理解，可使用其他平均节距值。
每个凹入部12的尺寸可通过其体积、开口面积、深度和/或直径来表征。
每个凹入部12可具有能够限制流体的任何体积。可以选择最小或最大体积，例如以适应流通池10A下游使用所期望的通量(例如复用度)、分辨率、标记核苷酸或分析物反应性。例如，体积可为至少约1×10-3μm3、至少约1×10-2μm3、至少约0.1μm3、至少约1μm3、至少约10μm3、至少约100μm3或更大。另选地或除此之外，体积可为至多约1×104μm3、至多约1×103μm3、至多约100μm3、至多约10μm3、至多约1μm3、至多约0.1μm3或更小。
每个凹入部开口所占据的面积可基于与上文针对体积所述的标准类似的标准来选择。例如，每个凹入部开口的面积可为至少约1×10-3μm2、至少约1×10-2μm2、至少约0.1μm2、至少约1μm2、至少约10μm2、至少约100μm2或更大。另选地或除此之外，面积可为至多约1×103μm2、至多约100μm2、至多约10μm2、至多约1μm2、至多约0.1μm2、至多约1×10-2μm2或更小。每个凹入部开口所占据的面积可以大于、小于上文指定的值或介于它们之间。
每个凹入部12的深度可大到足以容纳一些官能化层20。在一个示例中，深度可以为至少约0.1μm、至少约0.5μm、至少约1μm、至少约10μm、至少约100μm或更大。另选地或除此之外，深度可以为至多约1×103μm、至多约100μm、至多约10μm或更小。在一些示例中，深度为约0.4μm。每个凹入部12的深度可以大于、小于上文指定的值或介于它们之间。
在一些情况下，每个凹入部12的直径或长度和宽度可以为至少约50nm、至少约0.1μm、至少约0.5μm、至少约1μm、至少约10μm、至少约100μm或更大。另选地或除此之外，直径或长度和宽度可以为至多约1×103μm、至多约100μm、至多约10μm、至多约1μm、至多约0.5μm、至多约0.1μm或更小(例如，约50nm)。在一些示例中，直径或长度和宽度中的每一者为约0.4μm。每个凹入部12的直径或长度和宽度可以大于、小于上文指定的值或介于它们之间。
重新参见图1C，在压印并蚀刻疏水层16以形成凹入部12之后，可沉积官能化层20。
官能化层20可以是任何凝胶材料，当吸收液体时该凝胶材料可溶胀，当例如通过干燥去除液体时该凝胶材料可收缩。在一个示例中，凝胶材料是聚合物水凝胶。在一个示例中，聚合物水凝胶包括丙烯酰胺共聚物，诸如聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(PAZAM)。PAZAM和丙烯酰胺共聚物的一些其他形式由以下结构(I)表示：
其中：
RA选自叠氮基、任选地取代的氨基、任选地取代的烯基、任选地取代的炔烃、卤素、任选地取代的腙、任选地取代的肼、羧基、羟基、任选地取代的四唑、任选地取代的四嗪、腈氧化物、硝酮、硫酸盐和硫醇；
RB为H或任选地取代的烷基；
RC、RD和RE各自独立地选自H和任选地取代的烷基；
-(CH2)p-中的每一者可任选地被取代；
p为在1至50范围内的整数；
n为在1至50,000范围内的整数；以及
m为在1至100,000范围内的整数。
本领域的普通技术人员将认识到，结构(I)中反复出现的“n”和“m”特征的布置是代表性的，并且单体亚单元可以任何顺序存在于聚合物结构中(例如，无规、嵌段、图案化或它们的组合)。
丙烯酰胺共聚物的其他形式和PAZAM的分子量可在约5kDa至约1500kDa或者约10kDa至约1000kDa的范围内，或者在一个具体示例中可为约312kDa。
在一些示例中，丙烯酰胺共聚物的其他形式和PAZAM为直链聚合物。在一些其他示例中，丙烯酰胺共聚物的其他形式和PAZAM为轻度交联的聚合物。
在其他示例中，初始聚合物水凝胶可以是结构(I)的变型。在一个示例中，丙烯酰胺单元可用N,N-二甲基丙烯酰胺替换。在该示例中，结构(I)中的丙烯酰胺单元可用替换，其中RD、RE和RF各自为H或C1-C6烷基，并且RG和RH各自为C1-C6烷基(而不是H，如丙烯酰胺的情况)。在该示例中，q可为1至100,000范围内的整数。在另一个示例中，除了丙烯酰胺单元之外，还可使用N,N-二甲基丙烯酰胺。在该示例中，除了反复出现的“n”和“m”特征之外，结构(I)还可包括其中RD、RE和RF各自为H或C1-C6烷基，并且RG和RH各自为C1-C6烷基。在该示例中，q可为1至100,000范围内的整数。
作为聚合物水凝胶的另一个示例，结构(I)中重复出现的“n”特征可用包括具有结构(II)的杂环叠氮基基团的单体替换：
其中R1为H或C1-C6烷基；R2为H或C1-C6烷基；L为包括直链的连接基，其具有2至20个选自碳、氧和氮的原子以及链中的碳和任何氮原子上的10个任选取代基；E为直链，其包括1至4个选自由碳、氧和氮组成的组的原子以及链中的碳和任何氮原子上的任选取代基；A为具有附接到N上的H或C1-C4烷基的N取代的酰胺；并且Z为含氮杂环。Z的示例包括作为单个环状结构或稠合结构存在的5至10个含碳环成员。Z的一些具体示例包括吡咯烷基、吡啶基或嘧啶基。
作为又一个示例，初始聚合物水凝胶可包含结构(III)和(IV)中的每一者的重复单元：
其中R1a、R2a、R1b和R2b中的每一者独立地选自氢、任选地取代的烷基或任选地取代的苯基；R3a和R3b中的每一者独立地选自氢、任选地取代的烷基、任选地取代的苯基或任选地取代的C7-C14芳烷基；并且每个L1和L2独立地选自任选地取代的亚烷基连接基或任选地取代的杂亚烷基连接基。
应当理解，其他分子可用于形成官能化层20，只要它们被官能化为将寡核苷酸引物接枝到其上。合适的官能化层的其他示例包括具有胶态结构的那些，诸如琼脂糖；或具有聚合物网状结构的那些，诸如明胶；或具有交联聚合物结构的那些，诸如聚丙烯酰胺聚合物和共聚物、不含硅烷的丙烯酰胺(SFA)或SFA的叠氮化版本。合适的聚丙烯酰胺聚合物的示例可由丙烯酰胺和丙烯酸或含有乙烯基基团的丙烯酸合成，或由形成[2+2]光环加成反应的单体合成。合适的初始聚合物水凝胶的其他示例包括丙烯酰胺和丙烯酸酯的混合共聚物。含有丙烯酸类单体(例如，丙烯酰胺、丙烯酸酯等)的多种聚合物架构可用于本文所公开的示例中，诸如支链聚合物，包括星型聚合物、星形或星型嵌段聚合物、树枝状体等。例如，可将单体(例如，丙烯酰胺、包含催化剂的丙烯酰胺等)无规或以嵌段掺入星形形状聚合物的支链(臂)中。
可使用任何合适的共聚过程形成官能化层20的凝胶材料。还可使用本文公开的任何方法沉积官能化层20。
官能化层20与树脂层18的活化(例如，硅烷化或等离子体灰化)表面的附接可通过共价键合进行。在各种使用过程期间，共价连接有助于在形成的流通池10A的整个寿命期间将引物组30(图2B)保持在凹入部12中。相比之下，官能化层20不附接(例如，共价键合)到疏水层16。相反，疏水层16的疏水性质排斥官能化层20的凝胶材料，并且因此不会沉积在间隙区域26上方或松散地施加在间隙区域26上方。由于凹入部12中和间隙区域26处的不同相互作用，官能化层20保留在凹入部12中，并且可容易地从间隙区域26去除(例如，通过超声处理、洗涤、擦拭等)。
在示例性流通池10A中，引物组30在凹入部12的每个凹入部中接枝到官能化层20。该示例性引物组30包括两个不同引物32、34。期望引物32、34固定到官能化层20。在一些示例中，固定可通过在相应引物32、34的5'端与官能化层20的单点共价附接进行。可使用本领域已知的任何合适的共价附接方式。在一些示例中，固定可通过强非共价附接进行。
可使用的封端引物的示例包括炔烃封端的引物、四嗪封端的引物、叠氮基封端的引物、氨基封端的引物、环氧基或缩水甘油基封端的引物、硫代磷酸酯封端的引物、硫醇封端的引物、醛封端的引物、肼封端的引物、亚磷酰胺封端的引物、三唑啉二酮封端的引物和生物素封端的引物。在一些具体示例中，琥珀酰亚胺(NHS)酯封端的引物可与官能化层20的表面的胺反应，醛封端的引物可与官能化层20的表面的肼反应，或者炔烃封端的引物可与官能化层20的表面的叠氮化物反应，或者叠氮化物封端的引物可与官能化层20的表面的炔烃或DBCO(二苯并环辛炔)反应，或者氨基封端的引物可与官能化层20的表面的活化的羧酸酯基团或NHS酯反应，或者硫醇封端的引物可与官能化层20的表面的烷基化反应物(例如，碘乙酰胺或马来酰亚胺)反应，或者亚磷酰胺封端的引物可与官能化层20的表面的硫醚反应，或者生物素修饰的引物可与官能化层20的表面的链霉抗生物素蛋白反应。
引物32、34中的每个引物具有用于捕获和/或扩增目的的通用序列。引物32、34的示例包括P5和P7引物，其示例在Illumina Inc.销售的商业流通池的表面上使用，以例如在HiSeqTM、HiSeqXTM、MiSeqTM、MiSeqDXTM、MiNISeqTM、NextSeqTM、NextSeqDXTM、NovaSeqTM、iSEQTM、Genome AnalyzerTM和其他仪器平台上进行测序。在一个示例中，P5和P7引物包括以下引物：
P5:5'→3'
AATGATACGGCGACCACCGA(SEQ.ID.NO.1)
P7:5'→3'
CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQ.ID.NO.2)
对于顺序配对末端测序，这些引物32、34中的每个引物还可包括切割位点。引物32、34的切割位点可彼此不同，使得引物32、34的切割不会同时发生。合适的切割位点的示例包括酶促可切割的核碱基或化学可切割的核碱基、修饰的核碱基或接头(例如，在核碱基之间)。酶促可切割的核碱基可易于通过与糖基化酶和核酸内切酶或核酸外切酶反应来切割。可切割的核碱基的一个具体示例是脱氧尿嘧啶(dU)，其可被USER酶靶向。在一个示例中，尿嘧啶碱基可掺入从P5引物(P5U)或P7引物(P7U)的3'端起的第7个碱基位置处。也可使用其他无碱基位点。化学可切割的核碱基、修饰的核碱基或接头的示例包括8-氧代鸟嘌呤、邻二醇、二硫化物、硅烷、偶氮苯、可光裂解的基团、烯丙基T(具有烯丙基官能团的胸腺嘧啶核苷酸类似物)、烯丙基醚或叠氮基官能醚。
引物组30可预接枝到(官能化层20的)凝胶材料，并且因此一旦施加官能化层20，该引物组就可存在于凹入部12中。
在其他示例中，引物32、34未预接枝到官能化层20。在这些示例中，引物32、34可在施加官能化层20之后接枝。接枝可通过流经沉积(例如，使用暂时性结合的盖)、泡涂、喷涂、搅打分配或通过将引物32、34附接到官能化层20的另一种合适方法来实现。这些示例性技术中的每一种技术可利用引物溶液或混合物，该引物溶液或混合物可包括引物32、34、水、缓冲液和催化剂。利用任一种接枝方法，引物32、34附接到官能化层20的反应性基团，并且对疏水层16不具有亲和力。
现在参考图3A和图3B，描绘了用于制造流通池10B的方法的另一示例。该示例性方法包括通过压印穿过疏水层16的深度(或厚度)并穿过树脂层18的深度(或厚度)的一部分，并且在凹入部12的至少一个区域中施加官能化层20，以在多层叠堆14中限定凹入部12，该多层叠堆包括树脂层18上方的疏水层16。
在图3A所示的示例中，多层叠堆14定位在基部支持物22上方。本文所述的基部支持物22、树脂层18和疏水层16的任何示例可用于该示例中。
可使用任何合适的沉积技术将树脂层18沉积在基部支持物22上方，包括本文公开的示例。然而，与图1A至图1C中的示例不同，树脂层18尚未固化。相反，使用任何合适的沉积技术将疏水层16沉积在树脂层18上方。
然后压印疏水层16和树脂层18以形成凹入部12，如图3A所示。在该示例性方法中，穿过疏水层16的整个深度(或厚度)并穿过树脂层18的深度(或厚度)的一部分进行压印。如图3A所示，将工作印模24在疏水层16和树脂层18是软的时压入该疏水层和树脂层中，这在层16、18中产生工作印模特征的印记。压印会置换一些疏水材料和树脂材料，但两种材料不混合。这确保树脂层18将位于凹入部12的底部表面处。
然后疏水层16和树脂层18可在工作印模24就位的情况下被固化。固化可如本文所述使用对疏水层16和树脂层18均合适的条件进行。
固化后，释放工作印模24。这在疏水层16和树脂层18中产生形貌特征。更具体地，在该示例中，凹入部12限定在疏水层16中和树脂层18的一部分中。如图3A所示，凹入部12的底部由树脂层18限定，并且凹入部12的壁由疏水层16和树脂层18限定。虽然图3A至图3C中示出了单个凹入部12，但是应当理解，可形成若干凹入部12，其中每个凹入部12通过疏水层16的间隙区域26与每个其他凹入部12隔开(类似于图2B中所示的示例)。
在该示例性方法中，然后可使用硅烷化或等离子体灰化来活化暴露的树脂层18。期望随后施加的官能化层20附接到暴露的树脂层18并且不附接到疏水层16。因此，在该示例性方法中使用的任何等离子体灰化应活化暴露的树脂层18而不是疏水层16。
然后可使用本文所述示例中的任一个示例来施加官能化层20和引物组30。
现在参考图4A至图4D，描绘了用于制造流通池10C的方法的另一示例。该示例性方法包括通过压印穿过疏水层16的深度(或厚度)，并且在凹入部12的至少一个区域中施加官能化层20，以在多层叠堆14中限定凹入部12，该多层叠堆包括剥离抗蚀剂36上方的附加树脂层38，该剥离抗蚀剂位于疏水层16上方，该疏水层位于(第一)树脂层18上方。
本文所述的基部支持物22、树脂层18和疏水层16的任何示例可用于图4A所示的示例中。
在该示例中，树脂层18可如本文所述沉积在基部支持物22上方、固化并活化(例如，通过硅烷化或等离子体灰化)。然后可将疏水层16沉积在树脂层18上方并固化。
然后可将剥离抗蚀剂36施加到疏水层16。合适的剥离抗蚀剂36的示例包括可从Kayaku Advanced Materials,Inc.(以前为MicroChem)商购获得的基于聚甲基戊二酰亚胺平台的那些剥离抗蚀剂。剥离抗蚀剂36可以旋涂或以其他方式沉积、固化，并且随后在过程中的期望时间去除(参见图4D)。
然后可将附加树脂层38施加到剥离抗蚀剂36。附加树脂层38可以是本文所述的树脂层18的任何示例。还可使用任何合适的沉积技术来沉积附加树脂层38。
然后压印附加树脂层38以在附加树脂层38中形成凹面区域40。如图4A所示，将工作印模24在附加树脂层38是软的时压入该附加树脂层中，这在附加树脂层38中产生工作印模特征的印记。然后附加树脂层38可在工作印模24就位的情况下被固化。如本文所述，可通过暴露于光化辐射或热来实现固化。
固化后，释放工作印模24。这在附加树脂层38中产生形貌特征。在该示例性方法中，工作印模24不延伸穿过附加树脂层38的整个深度(或厚度)，并且因此附加树脂层38的部分38'形成凹面区域40的底部。
然后通过选择性地蚀刻附加树脂层部分38'、剥离抗蚀剂36的一部分和疏水层16的一部分，凹面区域40被向下延伸到树脂层18的表面。这些层38和36中的每个层被选择为具有不同的蚀刻速率，并且因此当蚀刻直接施加于其上的层时，一个层可充当蚀刻停止层(例如，当蚀刻附加树脂层38时，剥离抗蚀剂36充当蚀刻停止层)。层36和16可具有相同的蚀刻速率，并且这可使用相同的技术来蚀刻。下面的树脂层18可充当用于蚀刻层36和16的技术的蚀刻停止层。
对于附加树脂层38，可使用各向异性氧等离子体或使用90％CF4和10％O2进行蚀刻。附加树脂层38的任何暴露区域可在该过程期间蚀刻，如由图4B中的向下箭头所示。然而，当去除附加树脂层部分38'时，剥离抗蚀剂36充当凹面区域40中的蚀刻停止层。当剥离抗蚀剂36暴露于凹面区域40中时，可停止该第一蚀刻过程。
对于剥离抗蚀剂36的与凹面区域40相邻的部分，可使用100％O2等离子体蚀刻。剥离抗蚀剂36的暴露于凹面区域中的任何区域可在该过程期间蚀刻，如由图4B中的向下箭头所示。该蚀刻过程还将去除疏水层16的与凹面区域40相邻的部分。另选地，采用空气的等离子体蚀刻或采用氧气(O2)气体的干蚀刻可用于去除疏水层16的部分。疏水层16的暴露于凹面区域中的任何区域可在该过程期间蚀刻，如由图4B中的中心向下箭头所示。然而，当去除疏水层部分时，树脂层18充当凹面区域40中的蚀刻停止层。
如图4B中所描绘的，在进行各种蚀刻过程之后，附加树脂层38、剥离抗蚀剂36和疏水层16的与凹面区域40相邻的其他部分保持完整。
然后可使用本文所述的任何示例施加官能化层20，如图4C所示。在该示例中，官能化层20沉积在凹面区域40中的树脂层18上方并且沉积在剩余的附加树脂层38上方。
然后可进行剩余剥离抗蚀剂36的剥离。如图4D所示，剥离过程去除例如附加树脂层38和覆盖剩余剥离抗蚀剂36的官能化层20的至少99％。该剥离过程可在二甲基亚砜(DMSO)中使用超声处理，或在丙酮中，或使用基于NMP(N-甲基-2-吡咯烷酮)的剥离剂进行。然后暴露剩余的疏水层16，并且形成凹入部12。官能化层20在凹入部12中保持完整。
虽然在图4A至图4D中未示出，但是应当理解，在该示例中，引物组30(图2B)可预接枝到官能化层20，或者可在施加官能化层之后接枝(图4C)，或者可在剥离并形成凹入部12之后接枝(图4D)。如果在剥离后施加，则应当理解，引物组30的引物32、34(图2B)对疏水层16不具有亲和力，并且因此选择性地接枝到凹入部12中的官能化层20。
虽然图4A至图4D示出了单个凹入部12的形成，但是应当理解，可形成凹入部12的阵列，例如，其中每个凹入部12通过疏水层16的间隙区域26与每个其他凹入部12隔开(类似于图2B中所示的示例)。
现在参考图5A至图5E，描绘了用于制造流通池10D的方法的另一示例。该示例性方法利用在基部支持物22上方的多层叠堆14，其中多层叠堆14包括树脂层18、聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42和附加树脂层38。
本文所述的基部支持物22和树脂层18的任何示例可用于图5A所示的示例中。
在该示例中，树脂层18可如本文所述沉积在基部支持物22上方、固化并活化(例如，通过硅烷化或等离子体灰化)。
然后聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42可使用任何合适的技术沉积在树脂层18上方，并且使用热来固化。聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42为聚(甲基丙烯酸甲酯)的层。虽然用聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42描述了该示例性方法，但是应当理解，该层可以是另一种类型的剥离抗蚀剂。可使用用于层36的示例性剥离抗蚀剂中的任一种剥离抗蚀剂代替聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42。
然后可将附加树脂层38施加到聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42。附加树脂层38可以是本文所述的树脂层18的任何示例。还可使用任何合适的沉积技术来沉积附加树脂层38。
然后压印附加树脂层38以在附加树脂层38中形成凹面区域40。如图5A所示，将工作印模24在附加树脂层38是软的时压入该附加树脂层中，这在附加树脂层38中产生工作印模特征的印记。然后附加树脂层38可在工作印模24就位的情况下被固化。如本文所述，可通过暴露于光化辐射或热来实现固化。
固化后，释放工作印模24。这在附加树脂层38中产生形貌特征。在该示例性方法中，工作印模24不延伸穿过附加树脂层38的整个深度(或厚度)，并且因此附加树脂层38的部分38'形成凹面区域40的底部。
然后通过选择性地蚀刻附加树脂层部分38'和聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42的一部分，凹面区域40被向下延伸到树脂层18的表面。这些层38和42中的每个层被选择为具有不同的蚀刻速率，并且因此当蚀刻附加树脂层38时，聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42充当蚀刻停止层。
对于附加树脂层38，可使用各向异性氧等离子体进行蚀刻。附加树脂层38的任何暴露区域可在该过程期间蚀刻，如由图5B中的向下箭头所示。如所提及的，当去除附加树脂层部分38'时，聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42充当凹面区域40中的蚀刻停止层。当聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42暴露于凹面区域40中时，可停止该第一蚀刻过程。
对于聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42的与凹面区域40相邻的部分，可使用反应离子蚀刻(例如，在O2或O2/CHF3中)或CF4/O2等离子体蚀刻或100％O2等离子体蚀刻。聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42的暴露于凹面区域40中的任何区域可在该过程期间蚀刻，如由图5B中的向下箭头所示。当去除聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42时，树脂层18充当凹面区域40中的蚀刻停止层。
如图5B中所描绘的，在进行各种蚀刻过程之后，附加树脂层38和聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42的与凹面区域40相邻的其他部分保持完整。
然后，该示例性方法包括同时蚀刻附加树脂层38和暴露于凹面区域40中的树脂层18。因此，在该示例中，附加树脂层38和树脂层18可以是相同的材料或具有相同蚀刻速率的不同材料。可蚀刻层38、18直到去除附加树脂层38，如图5C所示。聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42用作蚀刻过程的蚀刻停止层。如图5C所示，将去除树脂层18的一部分，其在树脂层18中形成凹入部12。可使用各向异性氧等离子体或使用90％CF4和10％O2蚀刻树脂层38、18。
在替代方法中，附加树脂层38和树脂层18可具有不同的蚀刻速率。在该示例中，可蚀刻附加树脂层38以暴露下面的聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42，然后可蚀刻树脂层18以形成凹入部12。
然后可使用本文所述的任何示例施加官能化层20，如图5D所示。在该示例中，官能化层20沉积在凹入部12中的树脂层18上方，并且沉积在剩余的聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42上方。
然后可进行剩余聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42的剥离。如图5E所示，剥离过程去除例如聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42和覆盖剩余聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42的官能化层20的至少99％。该剥离过程可在二甲基亚砜(DMSO)中使用超声处理，或在丙酮中，或使用基于NMP(N-甲基-2-吡咯烷酮)的剥离剂进行。去除聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42暴露树脂层18的间隙区域26。官能化层20在凹入部12中保持完整，部分是因为该官能化层共价附接到树脂18。
虽然在图5A至图5E中未示出，但是应当理解，在该示例中，引物组30(图2B)可预接枝到官能化层20，或者可在施加官能化层20之后接枝(图5D)，或者可在剥离之后接枝(图5E)。如果在剥离后施加，则应当理解，引物组30的引物32、34(图2B)对树脂层18不具有亲和力，并且因此选择性地接枝到凹入部12中的官能化层20。
虽然图5A至图5E示出了单个凹入部12的形成，但是应当理解，可形成凹入部12的阵列，例如，其中每个凹入部12通过树脂层18的间隙区域26与每个其他凹入部12隔开(类似于图2B中所示的示例)。
现在参考图6A至图6C，描绘了用于制造流通池10E的方法的另一示例。该示例性方法利用在基部支持物22上方的多层叠堆14，其中多层叠堆14包括定位在剥离抗蚀剂36上方的附加树脂层38，该附加树脂层定位在官能化层20上方，该官能化层定位在树脂层18上方。
本文所述的基部支持物22和树脂层18的任何示例可用于图6A所示的示例中。
在该示例中，树脂层18可如本文所述沉积在基部支持物22上方、固化并活化(例如，通过硅烷化或等离子体灰化)。
然后可使用本文所述的任何示例施加官能化层20，如图6A所示。在该示例中，官能化层20沉积在树脂层18上并附接到该树脂层。
然后可将剥离抗蚀剂36施加到官能化层20。可使用本文公开的任何剥离抗蚀剂。剥离抗蚀剂36可例如被旋涂并固化。
然后可将附加树脂层38施加到剥离抗蚀剂36。附加树脂层38可以是本文所述的树脂层18的任何示例。还可使用任何合适的沉积技术来沉积附加树脂层38。
如图6A所示，然后压印附加树脂层38以在附加树脂层38中形成凸面区域44。如图6A所示，将工作印模24在附加树脂层38是软的时压入该附加树脂层中，这在附加树脂层38中产生工作印模特征的印记。然后附加树脂层38可在工作印模24就位的情况下被固化。如本文所述，可通过暴露于光化辐射或热来实现固化。
固化后，释放工作印模24。这在附加树脂层38中产生形貌特征。在该示例性方法中，工作印模24不延伸穿过附加树脂层38的整个深度(或厚度)，并且因此附加树脂层38的部分38'保持与凸面区域44相邻。
然后进行顺序蚀刻过程，以暴露位于附加树脂层38的部分38'下面的树脂层18的部分。图6B中的箭头通常示出可在这些过程期间蚀刻的区域。
蚀刻过程中的第一蚀刻过程去除凸面区域44中的附加树脂层38的部分38'和一些附加树脂层(例如，在凸面区域44的顶表面处)。下面的剥离抗蚀剂36充当蚀刻停止层(例如，当去除部分38'时)，这是因为其蚀刻速率不同于附加树脂层38的蚀刻速率。附加树脂层38的蚀刻可包括各向异性氧等离子体。
然后通过选择性地蚀刻剥离抗蚀剂36和官能化层20，凸面区域44被向下延伸到树脂层18的表面。选择性蚀刻过程去除了不位于凸面区域44下面的剥离抗蚀剂36和官能化层20的部分。
对于剥离抗蚀剂36和官能化层20的被去除的部分，可使用100％O2等离子体蚀刻。在该过程期间，可蚀刻剥离抗蚀剂36和官能化层20的暴露的任何区域，例如，与凸面区域44相邻的区域。在该示例中，树脂层18充当剥离抗蚀剂蚀刻过程的蚀刻停止层。这使得官能化层20的一部分在凸面区域44下方保持完整(图6B)。
然后可进行剩余剥离抗蚀剂36的剥离。如图6C所示，剥离过程去除例如剩余剥离抗蚀剂36和覆盖剩余剥离抗蚀剂36的附加树脂层38的至少99％。该剥离过程可在二甲基亚砜(DMSO)中使用超声处理，或在丙酮中，或使用基于NMP(N-甲基-2-吡咯烷酮)的剥离剂进行。剥离抗蚀剂36的去除暴露树脂层18的间隙区域26。官能化层20(其已在凸面区域44下方)在树脂层18的表面上方保持完整。
流动池10E的该示例不包括凹入部12。相反，官能化层20形成由相邻间隙区域26隔开的贴片或垫46。
虽然在图6A至图6C中未示出，但是应当理解，在该示例中，引物组30(图2B)可预接枝到官能化层20，或者可在施加官能化层20之后(例如，在施加剥离抗蚀剂36之前)接枝，或者可在剥离之后接枝(图6C)。如果在剥离后施加，则应当理解，引物组30的引物32、34(图2B)对树脂层18不具有亲和力，并且因此选择性地接枝到官能化层20。
虽然图6A至图6C示出了单个官能化层20的形成，但是应当理解，可形成贴片或垫46的阵列，例如，其中每个贴片或垫46通过树脂层18的间隙区域26与每个其他贴片或垫46隔开。
用于形成流通池10F(图7H)和流通池10G(图7N)的示例的方法的两个其他示例示出于图7A至图7N中。一个示例性方法示出于图7A至图7H中，并且其他示例性方法示出于图7A、图7B和图7I至图7A中。这些示例性方法利用在基部支持物22上方的多层叠堆14，其中多层叠堆14包括定位在牺牲层48上方的附加树脂层38，该附加树脂层定位在树脂层18上方。
本文所述的基部支持物22和树脂层18的任何示例可用于图7A所示的示例中。在该示例中，树脂层18可如本文所述沉积在基部支持物22上方、固化并活化(例如，通过硅烷化或等离子体灰化)。
然后可施加牺牲层48。用于牺牲层48的合适材料的示例包括半金属诸如硅，或金属诸如铝、铜、钛、金、银等，或者负性或正性光致抗蚀剂。在一些示例中，半金属或金属可至少基本上是纯的(<99％纯)。在其他示例中，可使用所列元件的分子或化合物，因为它们在特定方法中提供期望的蚀刻停止层或其他功能。例如，任何列出的半金属的氧化物(例如，二氧化硅)或金属的氧化物(例如，氧化铝)可以单独使用或与列出的半金属或金属组合使用。这些材料可使用本文公开的任何合适的技术来沉积。
然后可将附加树脂层38施加到牺牲层48。附加树脂层38可以是本文所述的树脂层18的任何示例。还可使用任何合适的沉积技术来沉积附加树脂层38。
如图7A所示，然后压印附加树脂层38以在附加树脂层38中形成凸面区域44。如图7A所示，将工作印模24在附加树脂层38是软的时压入该附加树脂层中，这在附加树脂层38中产生工作印模特征的印记。然后附加树脂层38可在工作印模24就位的情况下被固化。如本文所述，可通过暴露于光化辐射或热来实现固化。
固化后，释放工作印模24。这在附加树脂层38中产生形貌特征。在该示例性方法中，工作印模24不延伸穿过附加树脂层38的整个深度(或厚度)，并且因此附加树脂层38的部分38'保持与凸面区域44相邻。
然后进行顺序蚀刻过程，以暴露位于附加树脂层38的部分38'下面的树脂层18的部分。图7B中的箭头通常示出可在这些过程期间蚀刻的区域。
蚀刻过程中的第一蚀刻过程去除凸面区域44中的附加树脂层38的部分38'和一些附加树脂层(例如，在凸面区域44的顶表面处)。下面的牺牲层48充当蚀刻停止层(例如，当去除部分38'时)，这是因为其蚀刻速率不同于附加树脂层38的蚀刻速率。附加树脂层38的蚀刻可包括各向异性氧等离子体。
然后通过选择性地蚀刻牺牲层48的暴露部分，凸面区域44被向下延伸到树脂层18的表面。例如，可在酸性或碱性条件下去除铝牺牲层48，可使用FeCl3去除铜牺牲层48，可使用有机溶剂诸如丙酮或在碱性(pH)条件下去除光致抗蚀剂牺牲层48；并且可在碱性(pH)条件下去除硅牺牲层48。在该示例中，树脂层18充当牺牲层蚀刻过程的蚀刻停止层。
该方法的一个示例从图7B进行到图7C。该示例性方法包括同时蚀刻附加树脂层38(在凸面区域44中)和暴露的(例如，围绕凹面区域44的)一些树脂层18。图7C中的箭头通常示出可在该过程期间蚀刻的区域。
在一些示例中，附加树脂层38和树脂层18可以是相同的材料或具有相同蚀刻速率的不同材料。可使用各向异性氧等离子体或使用90％CF4和10％O2同时蚀刻树脂层38、18。可蚀刻层38、18直到去除附加树脂层38，如图7C所示。牺牲层48用作蚀刻过程的蚀刻停止层。通过树脂层18的深度(或厚度)的一部分来进行这种选择性蚀刻，形成具有凸面区域44的形状的突起部51。作为这种蚀刻过程的结果，凸面区域44被向下延伸到树脂层18的一部分中，并且树脂层18的其他部分18'被暴露。
在替代方法中，附加树脂层38和树脂层18可具有不同的蚀刻速率。在该示例中，可蚀刻附加树脂层38以暴露下面的牺牲层48，然后可蚀刻树脂层18以将凸面区域44向下延伸到树脂层18的一部分中，并且使得树脂层18的其他部分18'被暴露。
然后可在牺牲层48的剩余部分和树脂层18的暴露部分18'上方施加光致抗蚀剂50。光致抗蚀剂50可被图案化，使得不溶性区域50'保留在树脂层18的部分18'上方，如图7E所示。在一个示例中，光致抗蚀剂50是负性光致抗蚀剂(暴露区域不溶于显影剂)。合适的负性光致抗蚀剂的示例包括系列光致抗蚀剂(得自Futurrex)。其他合适的负性光致抗蚀剂包括SU-8系列和系列(两者均得自Kayaku Advanced Materials,Inc.)或UVNTM系列(得自杜邦公司(DuPont))。当使用负性光致抗蚀剂时，该负性光致抗蚀剂选择性地暴露于某些波长的光以形成不溶性区域50'，并且暴露于显影剂溶液以去除可溶性部分。在该示例中，曝光可穿过基部支持物22和树脂层18(其对所使用的光是透明的)，其中牺牲层48阻挡光。在另一个示例中，光致抗蚀剂50是正性光致抗蚀剂(暴露区域在显影剂中变得可溶)。合适的正性光致抗蚀剂的示例包括S1800系列或1500系列，两者均得自Kayaku Advanced Materials,Inc.。合适的正性光致抗蚀剂的另一个示例为SPRTM-220(来自杜邦公司)。当使用正性光致抗蚀剂时，该正性光致抗蚀剂选择性地暴露于某些波长的光以形成可溶性区域(例如，其至少95％可溶于显影剂)，并且暴露于显影剂溶液以去除可溶性部分。
在图7F所示的示例中，牺牲层48的剩余部分可被蚀刻掉。牺牲层48可如本文所述那样进行蚀刻。光致抗蚀剂50的不溶性区域50'可具有与牺牲层48不同的蚀刻速率，并且因此当牺牲层48被蚀刻掉时该不溶性区域可保持完整。此外，树脂层18可具有与牺牲层48不同的蚀刻速率，并且因此牺牲层48下面的树脂层18的部分可充当牺牲层蚀刻过程的蚀刻停止层。如图7F所示，牺牲层48的去除暴露树脂层18的作为凸面区域44的一部分的部分。
然后可使用本文所述的任何示例施加官能化层20，如图7G所示。在该示例中，官能化层20沉积在凸面区域44中的树脂层18上方并且沉积在光致抗蚀剂50的不溶性部分50'上方。
然后可进行光致抗蚀剂50的不溶性部分50'的剥离。如图7H所示，剥离过程去除了覆盖不溶性部分50'的官能化层20。该剥离过程可在二甲基亚砜(DMSO)中使用超声处理，或在丙酮中，或使用基于NMP(N-甲基-2-吡咯烷酮)的剥离剂进行。
在此流通池10F中，官能化层20在突起部51(例如，在树脂层18中限定的凸面区域44的部分)上保持完整。在阵列中，应当理解，每个突起部51通过间隙区域26与每个其他突起部51隔开。间隙区域26也限定在树脂层18中，但具有比突起部51更小的高度。
虽然在图7A至图7H中未示出，但是应当理解，在该示例中，引物组30(图2B)可预接枝到官能化层20，或者可在施加官能化层之后接枝(图7G)，或者可在剥离并形成突起部51之后接枝(图7H)。如果在剥离后施加，则应当理解，引物组30的引物32、34(图2B)对间隙区域26不具有亲和力，并且因此选择性地接枝到突起部51上方的官能化层20。
该方法的另一个示例从图7B进行到图7I。在该示例性方法中，光致抗蚀剂50可施加在树脂层18的暴露部分上方和凸面区域44上方。光致抗蚀剂50可被图案化，使得不溶性区域50'保留在树脂层18的暴露部分上方，并且使得凸面区域44中的附加树脂层38再次暴露。这在图7J中示出。当在该示例中使用负性光致抗蚀剂时，曝光可穿过基部支持物22和树脂层18，其中牺牲层48阻挡光。基部支持物22和树脂层18对所使用的光的波长是透明的。
在图7K所示的示例中，附加树脂层38的剩余部分可被蚀刻掉。可如本文所述蚀刻附加树脂层38。光致抗蚀剂50的不溶性区域50'可具有与附加树脂层38不同的蚀刻速率，并且因此当附加树脂层38被蚀刻掉时该不溶性区域可保持完整。
在图7L所示的示例中，牺牲层48的剩余部分可随后被蚀刻掉。牺牲层48可如本文所述那样进行蚀刻。光致抗蚀剂50的不溶性区域50'可具有与牺牲层48不同的蚀刻速率，并且因此当牺牲层48被蚀刻掉时该不溶性区域可保持完整。此外，树脂层18可具有与牺牲层48不同的蚀刻速率，并且因此牺牲层48下面的树脂层18的部分可充当牺牲层蚀刻过程的蚀刻停止层。如图7L所示，牺牲层48的去除暴露树脂层18的已在凸面区域44下面的部分。
然后可使用本文所述的任何示例施加官能化层20，如图7M所示。在该示例中，官能化层20沉积在树脂层18上方，该树脂层不被光致抗蚀剂50的不溶性部分50'覆盖。
然后可进行光致抗蚀剂50的不溶性部分50'的剥离。如图7N所示，剥离过程去除了覆盖不溶性部分50'的官能化层20。该剥离过程可如本文所述进行。
在此流通池10G中，官能化层20保持完整，并且形成由相邻间隙区域26隔开的贴片或垫46。在阵列中，应当理解，每个贴片或垫46通过间隙区域26与每个其他贴片或垫46隔开。
虽然在图7A、图7B和图7I至图7N中未示出，但是应当理解，在该示例中，引物组30(图2B)可预接枝到官能化层20，或者可在施加官能化层之后接枝(图7M)，或者可在剥离并形成贴片或垫46之后接枝(图7N)。如果在剥离后施加，则应当理解，引物组30的引物32、34(图2B)对间隙区域26不具有亲和力，并且因此选择性地接枝到贴片或垫46上方的官能化层20。
用于同时配对末端测序的方法和流通池
用于同时配对末端测序的流通池的示例通常包括：基底；在该基底的至少一部分上方的两个官能化层；和附接到这两个官能化层的不同引物组。
在一个示例中，第一引物组包括不可切割的第一引物和可切割的第二引物；并且第二引物组包括可切割的第一引物和不可切割的第二引物。图8A至图8D描绘了附接到官能化层20A、20B的引物组52A、52A'、52B、52B'、52C、52C'和52D、52D'的不同构型。
第一引物组52A、52B、52C和52D中的每个引物组包括不可切割的第一引物54或54'和可切割的第二引物56或56'；并且第二引物组52A'、52B'、52C'和52D'中的每个引物组包括可切割的第一引物58或58'和不可切割的第二引物60或60'。
不可切割的第一引物54或54'和可切割的第二引物56或56'是寡核苷酸对，例如，其中不可切割的第一引物54或54'是正向扩增引物，而可切割的第二引物56或56'是反向扩增引物，或者其中可切割的第二引物56或56'是正向扩增引物，而不可切割的第一引物54或54'是反向扩增引物。在第一引物组52A、52B、52C和52D的每个示例中，可切割的第二引物56或56'包括可切割位点62，而不可切割的第一引物54或54'不包括可切割位点62。
可切割的第一引物58或58'和不可切割的第二引物60或60'也是寡核苷酸对，例如，其中可切割的第一引物58或58'是正向扩增引物，而不可切割的第二引物60或60'是反向扩增引物，或者其中不可切割的第二引物60或60'是正向扩增引物，而可切割的第一引物58或58'是反向扩增引物。在第二引物组52A'、52B'、52C'和52D'的每个示例中，可切割的第一引物58或58'包括可切割位点62'或64，而不可切割的第二引物60或60'不包括可切割位点62'或64。
应当理解，第一引物组52A、52B、52C、52D的不可切割的第一引物54或54'和第二引物组52A'、52B'、52C'和52D'的可切割的第一引物58或58'具有相同的核苷酸序列(例如，两者都是正向扩增引物)，不同的是可切割的第一引物58或58'包括整合到核苷酸序列中或整合到与核苷酸序列附接的接头66'中的可切割位点62'或64。类似地，第一引物组52A、52B、52C、52D的可切割的第二引物56或56'和第二引物组52A'、52B'、52C'和52D'的不可切割的第二引物60或60'具有相同的核苷酸序列(例如，两者都是反向扩增引物)，不同的是可切割的第二引物56或56'包括整合到核苷酸序列中或整合到与核苷酸序列附接的接头66中的可切割位点62。
应当理解，当第一引物54和58或54'和58'是正向扩增引物时，第二引物56和60或56'和60'是反向引物，并且反之亦然。
不可切割的引物54、60或54'、60'的示例包括如本文所述的P5和P7引物。在一些示例中，P5和P7引物是不可切割的引物54、60或54'、60'，因为它们不包括可切割位点62、62'、64。应当理解，任何合适的通用序列可用作不可切割的引物54、60或54'、60'。
可切割引物56、58或56'、58'的示例包括P5和P7引物(或其他通用序列)引物，其中相应的切割位点62、62'、64掺入相应的核酸序列中(例如，图8A和图8C)，或掺入将可切割的引物56、58或56'、58'附接到相应官能化层20A、20B的接头66'、66中(图8B和图8D)。合适的切割位点62、62'、64的示例包括酶促可切割的核碱基或化学可切割的核碱基、修饰的核碱基或接头(例如，在核碱基之间)，如本文所述。
每个引物组52A和52A'或52B和52B'、52C和52C'或52D和52D'均附接到基底上方的相应官能化层20A、20B。在一些示例中，官能化层20A、20B具有相同的表面化学物质，并且本文所述的任何技术可用于将一组引物54、56或54'、56'接枝在官能化层20A上，并将另一组引物58、60或58'、60'接枝在官能化层20B上。在其他示例中，官能化层20A、20B包括可选择性地与相应引物54、56或54'、56'或58、60或58'、60'反应的不同表面化学物质(例如，官能团)。在这些其他示例中，官能化层20A具有第一官能团，并且官能化层20B具有不同于第一官能团的第二官能团。
如上所述，图8A至图8D描绘了附接到官能化层20A、20B的引物组52A、52A'、52B、52B'、52C、52C'和52D、52D'的不同构型。更具体地，图8A至图8D描绘了可使用的引物54、56或54'、56'和58、60或58'、60'的不同构型。
在图8A所示的示例中，引物组52A和52A'的引物54、56和58、60直接附接到官能化层20A、20B，例如，没有接头66、66'。官能化层20A可具有可将末端基团固定在引物54、56的5'端的表面官能团。类似地，官能化层20B可具有可将末端基团固定在引物58、60的5'端的表面官能团。在一个示例中，官能化层20A和引物54、56之间的固定化学物质与官能化层20B和引物58、60之间的固定化学物质可以是不同的，使得引物54、56或58、60选择性地附接到期望层20A或20B。在另一个示例中，层20A或20B和相应引物54、56或58、60的固定化学物质可以是相同的，并且图案化技术可用于一次接枝一个引物组52A和52A'。在又一个示例中，施加以形成官能化层20A、20B的材料可具有预接枝到其上的相应引物54、56或58、60，并且因此固定化学物质可以是相同的或不同的。
在该示例中，固定可通过在相应引物54和56或58和60的5'端与相应官能化层20A、20B的单点共价附接进行。可使用本领域已知的任何合适的共价附接方式，其示例在本文中针对引物32、34进行了阐述。
同样在图8A所示的示例中，可切割引物56、58中的每个可切割引物的可切割位点62、62'掺入引物的序列中。在该示例中，相同类型的可切割位点62、62'用于相应引物组52A、52A'的可切割引物56、58中。作为示例，可切割位点62、62'是尿嘧啶碱基，并且可切割引物56、58是P5U和P7U。在该示例中，寡核苷酸对54、56的不可切割引物54可以是P7，并且寡核苷酸对58、60的不可切割引物60可以是P5。因此，在该示例中，第一引物组52A包括P7、P5U，并且第二引物组52A'包括P5、P7U。引物组52A、52A'具有相反的线性化学物质，其在扩增、簇生成和线性化之后，允许在一个官能化层20A或20B上形成正向模板链，并且在另一个官能化层20B或20A上形成反向链。
在图8B所示的示例中，引物组52B和52B'的引物54'、56'和58'、60'例如通过接头66、66'附接到官能化层20A、20B。官能化层20A可具有可将接头66固定在引物54'、56'的5'端的表面官能团。类似地，官能化层20B可具有可将接头66'固定在引物58'、60'的5'端的表面官能团。在一个示例中，官能化层20A和接头66的固定化学物质与区域16和接头66'的固定化学物质可以是不同的，使得引物18'、20'或19'、21'选择性地接枝到期望的官能化层20A或20B。在另一个示例中，官能化层20A、20B和接头66、66'的固定化学物质可以是相同的，并且本文公开的任何合适的技术可用于一次接枝一个引物组52B和52B'。在又一个示例中，施加以形成官能化层20A、20B的材料可具有预接枝到其上的相应引物54'、56'和58'、60'，并且因此固定化学物质可以是相同的或不同的。合适的接头66、66'的示例可包括核酸接头(例如，10个核苷酸或更少)，或者非核酸接头诸如聚乙二醇链、烷基或碳链、具有邻二醇的脂肪族接头、肽接头等。核酸接头的示例是聚T间隔区，但是也可使用其他核苷酸。在一个示例中，间隔区是6T至10T间隔区。以下是核苷酸的一些示例，包括非核酸接头(其中B是核碱基并且“寡核苷酸”是引物)：
在图8B所示的示例中，引物54'、58'具有相同的序列(例如，P5)以及相同或不同的接头66、66'。引物54'不可切割，而引物58'包括掺入到接头66'中的可切割位点62'。同样在该示例中，引物56'、60'具有相同序列(例如，P7)以及相同或不同的接头66、66'。引物60'不可切割，而引物56'包括掺入到接头66中的可切割位点62。相同类型的可切割位点62、62'用于可切割引物56'、58'中的每个可切割引物的接头66、66'。作为示例，可切割位点62、62'可以是掺入核酸接头66、66'中的尿嘧啶碱基。引物组52B、52B'具有相反的线性化学物质，其在扩增、簇生成和线性化之后，允许在一个官能化层20A或20B上形成正向模板链，并且在另一个官能化层20B或20A上形成反向链。
图8C所示的示例类似于图8A所示的示例，不同的是不同类型的可切割位点62、64用于相应引物组52C、52C'的可切割引物56、58中。例如，可使用两种不同的酶可切割位点，可使用两种不同的化学可切割位点，或者可使用一种酶可切割位点和一种化学可切割位点。可在相应可切割引物56、58中使用的不同可切割位点62、64的示例包括邻二醇、尿嘧啶、烯丙基醚、二硫化物、限制性酶位点和8-氧代鸟嘌呤的任何组合。
图8D所示的示例类似于图8B所示的示例，不同的是不同类型的可切割位点62、64用于与相应引物组52D、52D'的可切割引物56'、58'附接的接头66、66'。可分别在与可切割引物56'、58'附接的接头66、66'中使用的不同可切割位点62、64的示例包括邻二醇、尿嘧啶、烯丙基醚、二硫化物、限制性酶位点和8-氧代鸟嘌呤的任何组合。
在图8A至图8D所示的任何示例中，引物54、56和58、60或54'、56'和58'、60'与官能化层20A、20B的附接使引物54、56和58、60或54'、56'和58'、60'的模板特异性部分自由地与其同源模板退火，而3'羟基自由地用于引物延伸。
官能化层20A、20B代表基底的具有与其附接的不同引物组52A、52A'或52B、52B'或52C、52C'或52D、52D'的不同区域。官能化层20A、20B可包含具有不同官能团的材料。在一些情况下，不同官能团是基底的表面官能团或已引入基底表面的官能团，或者可以是沉积在基底上方的另一部件(例如，聚合物层、小珠等)的官能团。
在一些示例中，官能化层20A、20B在化学上是相同的，并且本文公开的任何技术可用于将相应组52A和52A'或52B和52B'或52C和52C'或52D和52D'的引物54、56和58、60或54'、56'和58'、60'顺序附接到官能化层20A、20B。
在又一个示例中，施加以形成官能化层20A、20B的材料可具有预接枝到其上的相应引物54、56或58、60，并且因此固定化学物质可以是相同的或不同的。
流通池的各个部件的构型可部分地根据用于生成流通池的方法而变化。现在将描述几个示例性方法。
图9A至图9F所示的方法的示例可使用单层基底68(没有基部支持物22)或多层基底，该多层基底包括在其上具有树脂层18的基部支持物22。在这些图中，基部支持物22以虚线示出，因为当使用单层基底68时，该支持物22不存在。
凹入部12限定在单层基底68中或树脂层18中。虽然示出了单个凹入部12，但是应当理解，流通池10H(图9F)可包括多个凹入部12，类似于图2B中所示的凹入部。
凹入部12可使用任何合适的技术在单层基底68中形成，诸如光刻法、纳米压印光刻(NIL)、冲压技术、激光辅助直接压印(LADI)压花技术、模制技术、微蚀刻技术等。所使用的技术部分地取决于所使用的材料的类型。例如，凹入部12可被微蚀刻到玻璃单层基底中。
凹入部12可使用任何合适的技术在多层基底的树脂层18中形成，诸如纳米压印光刻(NIL)或光刻法等。所使用的技术部分地取决于所使用的材料的类型。
在树脂层18中形成凹入部12的一个示例描绘于图10中。在该示例中，将工作印模24在树脂层18是软的时压入该树脂层中，这在树脂层18中产生工作印模特征的印记。然后树脂层18可在工作印模24就位的情况下被固化。如本文所述，可通过暴露于光化辐射或热来实现固化。固化后，释放工作印模24。这在树脂层18中产生凹入部12。
在树脂层18中形成凹入部12的另一个示例利用光致抗蚀剂50。在该示例中，光致抗蚀剂50被施加在树脂层18上方并且被显影(通过曝光和如本文所述的显影剂溶液)以限定其中(显影剂)可溶性光致抗蚀剂被去除的凹入部图案和其中(显影剂)不溶性光致抗蚀剂区域50'保留在树脂层18上方的间隙图案。图11描绘了凹入部图案70和间隙图案72。从顶视图观察，凹入部图案70具有与最终凹入部12相同的形状，并且间隙图案72具有与间隙区域26相同的形状。
然后在凹入部图案70处蚀刻树脂层18(由图11中的箭头指示)。不溶性光致抗蚀剂区域50'充当蚀刻掩模。树脂层18可如本文所述那样进行蚀刻。可进行蚀刻，使得树脂层18的一部分保留在凹入部12的底部中，如图11所描绘的。然后可例如通过剥离技术去除不溶性光致抗蚀剂区域50'。重新参见图9A，去除不溶性光致抗蚀剂区域50'暴露间隙区域26。
取决于所使用的单层基底68或树脂层18，可进行使用硅烷化或等离子体灰化进行的暴露表面的活化，以生成可与官能化层20A、20B反应的表面基团，该官能化层随后沉积在单层基底68或树脂层18上方(参见例如图9E)。
在凹入部12形成于单层基底68或树脂层18中的情况下，该示例性方法继续在凹入部12的一部分上方施加牺牲层48。这在图9B中描绘。可使用本文所公开的牺牲层48的任何示例。
所施加的牺牲层48限定官能化层20B中的一个官能化层的图案，该图案随后被施加到凹入部12的覆盖部分。因此，牺牲层48可被施加，使得其覆盖凹入部12的一部分，包括一些侧壁和一些底部，同时使凹入部12的另一部分74暴露。牺牲层48也可被施加到间隙区域26上方，该间隙区域与被涂覆的侧壁相邻。可能需要涂覆间隙区域26，以确保凹入部侧壁的最顶部部分将可用于官能化层20B的后续沉积。
在一些示例中，牺牲层48可使用光刻过程结合剥离技术或蚀刻技术来制造。在其他示例中，选择性沉积技术(诸如化学气相沉积(CVD))及其变型(例如，低压CVD或LPCVD)、原子层沉积(ALD)和掩蔽技术可用于将牺牲层48沉积在期望区域中。另选地，牺牲层48可施加在单层基底68或树脂层18上(包括在所有凹入部12上方)，然后从部分74选择性地去除(例如，通过掩蔽和蚀刻)以限定官能化层20B中的一个官能化层的图案。
如图9C所示，然后可使用本文阐述的任何沉积技术来施加官能化层20A。在该示例中，官能化层20A沉积在单层基底68的暴露表面上方或树脂层18的暴露表面上方(包括在凹入部12的部分74上方)和牺牲层48上方。
然后去除牺牲层48以暴露凹入部12的已被牺牲层48覆盖的部分76。这在图9D中示出。可将任何合适的蚀刻技术用于牺牲层48。应当理解，官能化层20A共价附接到单层基底68或树脂层18，并且因此在牺牲层蚀刻期间不从单层基底68或树脂层18中去除。然而，将去除牺牲层48上方的官能化层20A。例如，当单层基底68或树脂层18具有与牺牲层48不同的蚀刻速率时，单层基底68或树脂层18可用作牺牲层蚀刻的蚀刻停止层。
如图9E所示，然后可使用本文公开的任何沉积技术来施加官能化层20B。在该示例中，官能化层20B沉积在单层基底68的暴露部分上方或树脂层18的暴露部分上方(包括在凹入部12的部分76上方)。在该示例中，当官能化层20B的沉积在高离子强度(例如，在存在10x PBS、NaCl、KCl等)下进行时，第二官能化层20B不沉积在第一官能化层20A上或附着到该第一官能化层上。因此，官能化层20B不会污染官能化层20A。
在图9F中，去除间隙区域26上方的官能化层20A、20B。这种去除包括从间隙区域26中抛光官能化层20A、20B或将不会从凹入部12去除官能化层20A、20B的另一种合适技术。
抛光过程可用化学浆料(包括例如研磨剂、缓冲剂、螯合剂、表面活性剂和/或分散剂)来进行，该化学浆料可从间隙区域26去除官能化层20A、20B而不会有害地影响那些区域26处的下面的基底68或树脂层18。另选地，可用不含磨粒的溶液进行抛光。
化学浆料可用于化学机械抛光系统以抛光间隙区域26的表面。抛光头/抛光垫或其他抛光工具能够抛光可能存在于间隙区域26上方的官能化层20A、20B，同时使凹入部12中的官能化层20A、20B至少基本上完整。作为示例，抛光头可以是Strasbaugh ViPRR II抛光头。
清洁和干燥过程可在抛光之后进行。清洁过程可利用水浴和超声处理。水浴可维持在约22℃至约30℃范围内的相对低温下。干燥过程可包括旋转干燥，或通过另一种合适技术进行的干燥。
在一些示例中，引物54、56或54'、56'(图9A至图9F中未示出)可预接枝到官能化层20A。类似地，引物58、60或58'、60'(图9A至图9F中未示出)可预接枝到第二官能化层20B。在这些示例中，不进行另外的引物接枝。
在其他示例中，引物54、56或54'、56'未预接枝到官能化层20A。在这些示例中，引物54、56或54'、56'可在施加官能化层20A之后接枝(例如，在图9C中)。在这些示例中，引物58、60或58'、60'可预接枝到第二官能化层20B。或者，在这些示例中，引物58、60或58'、60'可不预接枝到第二官能化层20B。相反，引物58、60或58'、60'可在施加第二官能化层20B之后接枝(例如，在图28E中)，只要i)官能化层20B具有用于附接引物58、60或58'、60'(与官能化层20A相比)不同的官能团，或者ii)官能化层20A的任何未反应官能团已例如使用Staudinger还原为胺或与被动分子诸如己炔酸的加成点击反应来淬灭。
当在该方法期间进行接枝时，可使用任何合适的接枝技术来实现接枝，诸如本文所公开的那些。利用任何接枝方法，引物54、56或54'、56'与官能化层20A的反应性基团反应，或者引物58、60或58'、60'与官能化层20B的反应性基团反应，并且对单层基底68或树脂层18不具有亲和力。
虽然图9A至图9F示出了其中具有官能化层20A、20B的单个凹入部12的形成，但是应当理解，可形成其中具有官能化层20A、20B的凹入部12的阵列，例如，其中每个凹入部12通过单层基底68或树脂层18的间隙区域26与每个其他凹入部隔开(类似于图2B中所示的示例)。
图9B至图9E所示的方法的过程也可结合图1A至1C或图3A和图3B所示的示例性方法进行，以将两个官能化层20A和20B而不是一个官能化层20引入凹入部12中。例如，参考图9B至9E描述的过程可在参考图1B描述的过程之后(并且代替参考图1C描述的过程)进行。又如，参考图9B至9E描述的过程可在参考图3A描述的过程之后(并且代替参考图3B描述的过程)进行。应当理解，两个官能化层20A和20B不会粘附到图1B和图3A的疏水层16，并且因此不会进行抛光。
图12A至图12H、图13A至图13H以及图14A至图14J描绘了产生流通池10I、10J、10K的不同示例的方法的不同示例，所述方法中的每种方法包括官能化层20A和20B。这些方法中的每种方法利用基部支持物22上方的不同多层叠堆14。
通常，这些方法中的每种方法包括压印树脂层18或38以形成包括深部分78和由台阶部分82限定的浅部分80的凹面区域40，其中树脂层18或38定位在多层叠堆14上方，该多层叠堆包括具有差分蚀刻速率的至少两个层(例如，42和48，或48和38，或42、48和38)，该多层叠堆定位在基部支持物22上方；选择性地蚀刻树脂层18或38和所述至少两个层以形成与深部分78相邻的凹入部12；将第一官能化层20A施加到凹入部12；选择性地蚀刻树脂层18或38、所述至少两个层或其组合以暴露台阶部分82下面的区域；以及将第二官能化层20B施加到该暴露区域。现在将参考相应的一组附图描述所述方法中的每种方法。
在图12A至图12H中，多层叠堆14包括基部支持物22上方的牺牲层48、牺牲层48上方的聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42以及聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42上方的树脂层18。
牺牲层48下方的基础基底22的表面可像灰化支持物(ashed support)一样起作用，并且因此可能不进行额外的活化。
可使用本文公开的任何合适的技术将牺牲层48施加到基部支持物22上。用于牺牲层48的合适材料的示例包括本文所述的那些材料中的任一种，诸如硅、铝、负性或正性光致抗蚀剂、铜等。
然后聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42可使用任何合适的技术沉积在牺牲层48上方，并且使用热来固化。
然后可将树脂层18施加到聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42。树脂层18可以是本文阐述的任何示例，并且可使用任何合适的沉积技术沉积。
然后压印树脂层18以形成凹面区域40，该凹面区域在该示例中包括深部分78和浅部分80，该浅部分部分地由树脂层18的台阶部分82限定。如图12A所示，将工作印模24在树脂层18是软的时压入该树脂层中，这在树脂层18中产生工作印模特征的印记。然后树脂层18可在工作印模24就位的情况下被固化。如本文所述，可通过暴露于光化辐射或热来实现固化。
固化后，释放工作印模24。这在树脂层18中产生各种形貌特征。在该示例性方法中，工作印模24在深部分78处不延伸穿过树脂层18的整个深度(或厚度)，并且因此树脂层18的部分18″在深部分78处形成凹面区域40的底部，如图12A所示。
然后通过如下步骤形成凹入部12(如图12C所示)：蚀刻在深部分78下面的树脂层18的第一部分18″；蚀刻深部分78下面的聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42的一部分；以及蚀刻深部分78下面的牺牲层48的一部分，从而在牺牲层48中形成凹入部12。
参见图12B，通过选择性地蚀刻树脂层部分18″和聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42的一部分(在树脂层部分18″下方)，凹面区域40的深部分78被向下延伸到牺牲层48的表面。这些层18和42中的每个层被选择为具有不同的蚀刻速率，并且因此当蚀刻树脂层18时，聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42充当蚀刻停止层。
对于树脂层18，可使用各向异性氧等离子体进行蚀刻。树脂层18的任何暴露区域可在该过程期间蚀刻，如由图12B中的向下箭头所示。如所提及的，当去除树脂层部分18″时，聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42充当凹面区域40中的蚀刻停止层。当聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42暴露于凹面区域40的深部分78中时，可停止该第一蚀刻过程，并且因此整个树脂层18未被蚀刻掉(如图12B所示)。此外，还可在压印之前选择台阶部分82的深度(或厚度)，使得在该第一蚀刻过程期间，聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42的在台阶部分82下面的部分不暴露。因此，台阶部分82的深度(或厚度)可比树脂层部分18″的深度(或厚度)厚。
对于聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42的在树脂层部分18″下方的部分，可使用反应离子蚀刻(例如，在O2或O2/CHF3中)或CF4/O2等离子体蚀刻或100％O2等离子体蚀刻。聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42的暴露于凹面区域40中的任何区域可在该过程期间蚀刻。当去除聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42的该部分时，牺牲层48充当凹面区域40的深部分78中的蚀刻停止层。如图12B所示，在进行该蚀刻过程之后，聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42的任何覆盖部分保持完整。
然后，将深部分78进一步向下延伸到基部支持物22的表面，该表面在与深部分78相邻的牺牲层48中形成凹入部12。这可包括选择性地蚀刻牺牲层48的暴露部分(其与深部分78相邻)。在该示例中，基部支持物22充当牺牲层蚀刻过程的蚀刻停止层。
然后，该示例性方法包括通过选择性地蚀刻台阶部分82和聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42的另一部分(在台阶部分82下方)，将凹面区域40的浅部分80向下延伸到牺牲层48的表面。
对于树脂层18，可再次使用各向异性氧等离子体进行蚀刻。树脂层18的任何暴露区域可在该过程期间蚀刻，如由图12D中的向下箭头所示。当去除台阶部分82时，聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42再次充当凹面区域40中的蚀刻停止层。当聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42暴露于凹面区域40的浅部分80中时，可停止该蚀刻过程，并且因此整个树脂层18未被蚀刻掉(如图12D所示)。
对于聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42的在台阶部分82下方的部分，可使用反应离子蚀刻(例如，在O2或O2/CHF3中)或CF4/O2等离子体蚀刻或100％O2等离子体蚀刻。聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42的暴露于凹面区域40中的任何区域可在该过程期间蚀刻。当去除聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42的浅部分80时，牺牲层48充当凹面区域40的该部分中的蚀刻停止层。如图12D所示，在进行该蚀刻过程之后，聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42的任何覆盖部分保持完整。
如图12E所示，然后可使用任何合适的沉积技术来施加官能化层20A。在该示例中，官能化层20A沉积在凹入部12中的基部支持物22上方、在牺牲层48的任何暴露部分上方和树脂层18的任何暴露部分上方。
然后去除与浅部分80相邻的牺牲层48，以暴露基部支持物22的与基部支持物22上方的官能化层20A相邻的另一部分。这在图12F中描绘。可将任何合适的蚀刻技术用于牺牲层48。应当理解，官能化层20A共价附接到基部支持物22，并且因此不在牺牲层蚀刻期间去除。此外，因为树脂层18不易受到牺牲层蚀刻的影响，因此在牺牲层蚀刻期间，也不会去除树脂层18上方的官能化层20A。然而，将去除牺牲层48上方的官能化层20A。例如，当基部支持物22具有与牺牲层48不同的蚀刻速率时，单个基部支持物22可用作牺牲层蚀刻的蚀刻停止层。
如图12G所示，然后可使用任何合适的沉积技术来施加官能化层20B。在该示例中，官能化层20B沉积在基础基底12的暴露部分上方。在该示例中，当官能化层20B的沉积在高离子强度(例如，在存在10x PBS、NaCl、KCl等)下进行时，第二官能化层20B不沉积在第一官能化层20A上或附着到该第一官能化层上。因此，官能化层20B不会污染官能化层20A。
然后可进行剩余聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42的剥离。如图12G所示，剥离过程去除聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42和树脂层18和覆盖剩余聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42的官能化层20A。该剥离过程可在二甲基亚砜(DMSO)中使用超声处理，或在丙酮中，或使用基于NMP(N-甲基-2-吡咯烷酮)的剥离剂进行。聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42的去除暴露了牺牲层48的任何剩余部分。
如图12H中的向下箭头所示，然后使用适用于特定牺牲层48的蚀刻过程去除牺牲层48的剩余部分。部分因为官能化层20A、20B共价附接到基部支持物22，所以官能化层20A、20B在基部支持物22上方保持完整。
在一些示例中，引物54、56或54'、56'(图12A至图12H中未示出)可预接枝到官能化层20A。类似地，引物58、60或58'、60'(图12A至图12H中未示出)可预接枝到第二官能化层20B。在这些示例中，不进行另外的引物接枝。
在其他示例中，引物54、56或54'、56'未预接枝到官能化层20A。在这些示例中，引物54、56或54'、56'可在施加官能化层20A之后接枝(例如，在图12E中)。在这些示例中，引物58、60或58'、60'可预接枝到第二官能化层20B。或者，在这些示例中，引物58、60或58'、60'可不预接枝到第二官能化层20B。相反，引物58、60或58'、60'可在施加第二官能化层20B之后接枝(例如，在图12G中)，只要i)官能化层20B具有用于附接引物58、60或58'、60'(与官能化层20A相比)不同的官能团，或者ii)官能化层20A的任何未反应官能团已例如使用Staudinger还原为胺或与被动分子诸如己炔酸的加成点击反应来淬灭。
当在该方法期间进行接枝时，可使用任何合适的接枝技术来实现接枝，诸如本文所公开的那些。利用任何接枝方法，引物54、56或54'、56'与官能化层20A的反应性基团反应，或者引物58、60或58'、60'与官能化层20B的反应性基团反应，并且对基部支持物22不具有亲和力。
在流通池10I的该示例中，官能化层20A、20B没有被限制在凹入部12内(如在流通池10H中)。相反，官能化层20A、20B形成由基部支持物22的相邻间隙区域26隔开的相应贴片或垫46A、46B。
虽然图12A至图12H示出了单组官能化层20A、46A和20B、46B的形成，但是应当理解，可形成贴片或垫46A、46B的阵列，例如，其中每组贴片或垫46A、46B通过基部支持物22的间隙区域26与每个其他组的贴片或垫46A、46B隔开。
在图13A至图13H中，多层叠堆14包括牺牲层48上方的树脂层18，该牺牲层在附加树脂层38上方，该附加树脂层在基部支持物22上方。
在基部支持物22上方形成多层叠堆14之前，可使用硅烷化来活化基部支持物22。牺牲层48下面的树脂层38的表面起到灰化表面的作用，因此不进行该树脂层38的活化。
附加树脂层38可使用任何合适的沉积技术(包括本文所公开的示例)沉积在基部支持物22上方，并且使用适合树脂的条件固化。
可使用本文公开的任何合适的技术将牺牲层48施加到附加树脂层38上。用于牺牲层48的合适材料的示例包括硅、铝、负性或正性光致抗蚀剂、铜等。
可使用任何合适的沉积技术将树脂层18沉积在牺牲层48上方，包括本文公开的示例。然后压印树脂层18以形成凹面区域40，该凹面区域在该示例中包括深部分78和浅部分80，该浅部分部分地由树脂层18的台阶部分82限定。如图13A所示，将工作印模24在树脂层18是软的时压入该树脂层中，这在树脂层18中产生工作印模特征的印记。然后树脂层18可在工作印模24就位的情况下被固化。如本文所述，可通过暴露于光化辐射或热来实现固化。
固化后，释放工作印模24。这在树脂层18中产生各种形貌特征。在该示例性方法中，工作印模24在深部分78处不延伸穿过树脂层18的整个深度(或厚度)，并且因此树脂层18的部分18″在深部分78处形成凹面区域40的底部。
然后通过如下步骤形成凹入部12(如图13D所示)：蚀刻在深部分78下面的树脂层18的第一部分18″；蚀刻深部分78下面的牺牲层48的一部分，从而暴露附加树脂层38的一部分；以及同时蚀刻树脂层18的第二部分(例如，台阶部分82)以暴露牺牲层48的另一部分，和ii)附加树脂层38的暴露部分38″。
参见图13B，通过选择性地蚀刻树脂层部分18″，凹面区域40的深部分78被向下延伸到牺牲层48的表面。可使用各向异性氧等离子体进行蚀刻。树脂层18的任何暴露区域可在该过程期间蚀刻，如由图13B中的向下箭头所示。当去除树脂层部分18″时，牺牲层48充当凹面区域40中的蚀刻停止层。当牺牲层48暴露于凹面区域40的深部分78中时，可停止该第一蚀刻过程，并且因此整个树脂层18未被蚀刻掉(如图13B所示)。此外，还可在压印之前选择台阶部分82的深度(或厚度)，使得在该第一蚀刻过程期间，牺牲层48的在台阶部分82下面的部分不暴露。因此，台阶部分82的深度(或厚度)可比树脂层部分18″的深度(或厚度)厚。
然后，深部分78被进一步向下延伸到附加树脂层38的表面，如图13C所示。这可包括选择性地蚀刻牺牲层48的暴露部分(其与深部分78相邻)。在该示例中，附加树脂层38充当牺牲层蚀刻过程的蚀刻停止层。
然后，该示例性方法包括同时蚀刻树脂层18和附加树脂层38的暴露于凹面区域40中的部分38″。因此，附加树脂层38的部分38″和树脂层18可以是相同的材料或具有相同蚀刻速率的不同材料。可蚀刻层18、38，直到暴露牺牲层48的在台阶部分82下面的部分，如图3D所示。在第一蚀刻过程(图13B)之后剩余的台阶部分82的厚度通常比附加树脂层38的厚度更薄。因此，同时蚀刻过程去除台阶部分82以暴露牺牲层48，但不延伸穿过附加树脂层38的深度(或厚度)。如图13D所示，将去除附加树脂层38的一部分，其在附加树脂层38中形成凹入部12。
在替代方法中，附加树脂层38和树脂层18可具有不同的蚀刻速率。在一个示例中，树脂层18的台阶部分82可被蚀刻以暴露下面的牺牲层48，然后可去除附加树脂层38(与深部分78相邻)以形成凹入部12。在另一个示例中，可去除附加树脂层38(与深部分78相邻)以形成凹入部12，然后可蚀刻树脂层18的台阶部分82以暴露下面的牺牲层48。
如图13E所示，然后可使用任何合适的沉积技术来施加官能化层20A。在该示例中，官能化层20A沉积在凹入部12中的附加树脂层38上方、在牺牲层48的任何暴露部分上方和树脂层18的任何暴露部分上方。
然后去除与浅部分80相邻的牺牲层48以暴露附加树脂层38的另一部分38″'(参见图13F)。可将任何合适的蚀刻技术用于牺牲层48。应当理解，官能化层20A共价附接到附加树脂层38，并且因此不在牺牲层蚀刻期间去除。此外，因为树脂层18不易受到牺牲层蚀刻的影响，因此在牺牲层蚀刻期间，也不会去除树脂层18上方的官能化层20A。然而，将去除牺牲层48上方的官能化层20A。例如，当附加树脂层38具有与牺牲层48不同的蚀刻速率时，附加树脂层38可用作牺牲层蚀刻的蚀刻停止层。附加树脂层38的暴露部分38″'尚未被蚀刻，如参考图13D所述的，并且因此与凹入部12的底部相比较高。这在图13F中描绘。
如图13G所示，然后可使用任何合适的沉积技术来施加官能化层20B。在该示例中，官能化层20B沉积在附加树脂层38的暴露部分38″'上方。在该示例中，当官能化层20B的沉积在高离子强度(例如，在存在10x PBS、NaCl、KCl等)下进行时，第二官能化层20B不沉积在第一官能化层20A上或附着到该第一官能化层上。因此，官能化层20B不会污染官能化层20A。
然后可对树脂层18以及对牺牲层48使用合适的蚀刻剂，一次一个地蚀刻剩余树脂层18和牺牲层48。剩余树脂层18(以及其上的任何官能化层20A)和牺牲层48的去除暴露附加树脂层38的任何剩余部分；这在该示例中是间隙区域26。部分由于官能化层20A、20B共价附接到附加树脂层38，因此官能化层20A、20B在附加树脂层38上方保持完整。
在一些示例中，引物54、56或54'、56'(图13A至图13H中未示出)可预接枝到官能化层20A。类似地，引物58、60或58'、60'(图13A至图13H中未示出)可预接枝到第二官能化层20B。在这些示例中，不进行另外的引物接枝。
在其他示例中，引物54、56或54'、56'未预接枝到官能化层20A。在这些示例中，引物54、56或54'、56'可在施加官能化层20A之后接枝(例如，在图13E中)。在这些示例中，引物58、60或58'、60'可预接枝到第二官能化层20B。或者，在这些示例中，引物58、60或58'、60'可不预接枝到第二官能化层20B。相反，引物58、60或58'、60'可在施加第二官能化层20B之后接枝(例如，在图13G中)，只要i)官能化层20B具有用于附接引物58、60或58'、60'(与官能化层20A相比)不同的官能团，或者ii)官能化层20A的任何未反应官能团已例如使用Staudinger还原为胺或与被动分子诸如己炔酸的加成点击反应来淬灭。
当在该方法期间进行接枝时，可使用任何合适的接枝技术来实现接枝，诸如本文所公开的那些。利用任何接枝方法，引物54、56或54'、56'与官能化层20A的反应性基团反应，或者引物58、60或58'、60'与官能化层20B的反应性基团反应，并且对基部支持物22不具有亲和力。
在流通池10J的该示例中，官能化层20A中的一个官能化层被限制在凹入部12内，并且官能化层20B中的另一个官能化层被限定在与凹入部12相邻的间隙区域26的一部分上方。
虽然图13A至图13H示出了单组官能化层20A和20B的形成，但是应当理解，可形成类似官能化层20A和20B的阵列，例如，其中每组通过间隙区域26与每个其他组隔开。
在图14A至图14J中，多层叠堆14包括聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42上方的树脂层18，该树脂层在牺牲层48上方，该牺牲层在附加树脂层38上方，该附加树脂层在基部支持物22上方。
在基部支持物22上方形成多层叠堆14之前，可使用硅烷化来活化基部支持物22。牺牲层48下面的树脂层38的表面起到灰化表面的作用，因此不进行该树脂层38的活化。
附加树脂层38可使用任何合适的沉积技术(包括本文所公开的示例)沉积在基部支持物22上方，并且使用适合树脂的条件固化。
可使用任何合适的技术(诸如本文公开的那些技术)将牺牲层48施加到附加树脂层38上。用于牺牲层48的合适材料的示例包括本文所述的那些材料中的任一种，诸如硅、铝、负性或正性光致抗蚀剂、铜等。
然后聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42可使用任何合适的技术沉积在牺牲层48上方，并且使用热来固化。
然后可将树脂层18施加到聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42。树脂层18可以是本文阐述的任何示例，并且可使用任何合适的沉积技术沉积。
然后压印树脂层18以形成凹面区域40，该凹面区域在该示例中包括深部分78和浅部分80，该浅部分部分地由树脂层18的台阶部分82限定。如图14A所示，将工作印模24在树脂层18是软的时压入该树脂层中，这在树脂层18中产生工作印模特征的印记。然后树脂层18可在工作印模24就位的情况下被固化。如本文所述，可通过暴露于光化辐射或热来实现固化。
固化后，释放工作印模24。这在树脂层18中产生各种形貌特征。在该示例性方法中，工作印模24在深部分78处不延伸穿过树脂层18的整个深度，并且因此树脂层18的部分18″在深部分78处形成凹面区域40的底部。
然后通过如下步骤形成凹入部12(如图14D所示)：蚀刻在深部分78(图14B)下面的树脂层18的第一部分18″；蚀刻深部分78(图14B)下面的聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42的一部分；以及蚀刻深部分78下面的牺牲层48的一部分(图14D)。
现在参见图14B，通过选择性地蚀刻树脂层部分18″和聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42的一部分(在树脂层部分18″下方)，凹面区域40的深部分78被向下延伸到牺牲层48的表面。这些层18和42中的每个层被选择为具有不同的蚀刻速率，并且因此当蚀刻树脂层18时，聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42充当蚀刻停止层。
对于树脂层18，可使用各向异性氧等离子体进行蚀刻。树脂层18的任何暴露区域可在该过程期间蚀刻，如由图14B中的向下箭头所示。如所提及的，当去除树脂层部分18″时，聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42充当凹面区域40中的蚀刻停止层。当聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42暴露于凹面区域40的深部分78中时，可停止该第一蚀刻过程，并且因此整个树脂层18未被蚀刻掉(如图12B所示)。此外，还可在压印之前选择台阶部分82的深度，使得在该第一蚀刻过程期间，聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42的在台阶部分82下面的部分不暴露。因此，台阶部分82的深度可比树脂层部分18″的深度厚。
对于聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42的在树脂层部分18″下方的部分，可使用反应离子蚀刻(例如，在O2或O2/CHF3中)或CF4/O2等离子体蚀刻或100％O2等离子体蚀刻。聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42的暴露于凹面区域40中的任何区域可在该过程期间蚀刻。当去除聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42的该部分时，牺牲层48充当凹面区域40的深部分78中的蚀刻停止层。如图14B所示，在进行该蚀刻过程之后，聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42的任何覆盖部分保持完整。
在蚀刻深部分78中的牺牲层48之前，该示例性方法还可包括蚀刻树脂层18以去除台阶部分82并暴露聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42的第二部分。这在图14C中描绘。树脂层18的蚀刻可如本文所述进行，并且台阶部分82下方的聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42将充当蚀刻停止层。随着暴露的牺牲层48具有与树脂层18不同的蚀刻速率，该牺牲层在该过程期间将不被蚀刻(如图14C所示)。
然后，将深部分78进一步向下延伸到附加树脂层38的表面，该表面在与深部分78相邻的附加树脂层38中形成凹入部12。这在图14D中示出。该过程可包括选择性地蚀刻牺牲层48的暴露部分(其与深部分78相邻)。在该示例中，附加树脂层38充当牺牲层蚀刻过程的蚀刻停止层。
该示例性方法还可包括蚀刻浅部分80中的聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42。这在图14E中描绘。聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42的暴露部分(在浅部分80中)的蚀刻可如本文所述进行，并且下面的牺牲层48将充当蚀刻停止层。随着附加树脂层38的暴露部分38″具有与聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42不同的蚀刻速率，该暴露部分在该过程期间将不被蚀刻(如图14E所示)。
如图14F所示，然后可使用任何合适的沉积技术来施加官能化层20A。在该示例中，官能化层20A沉积在凹入部12中的附加树脂层38的暴露部分38″上方、在牺牲层48的任何暴露部分上方和树脂层18的任何暴露部分上方。
然后去除与浅部分80相邻的牺牲层48，以暴露附加树脂层38的与附加树脂层38上方的官能化层20A相邻的另一部分。这在图14G中描绘。可将任何合适的蚀刻技术用于牺牲层48。应当理解，官能化层20A共价附接到附加树脂层38，并且因此不在牺牲层蚀刻期间去除。此外，因为树脂层18不易受到牺牲层蚀刻的影响，因此在牺牲层蚀刻期间，也不会去除树脂层18上方的官能化层20A。然而，将去除牺牲层48上方的官能化层20A。例如，当附加树脂层38具有与牺牲层48不同的蚀刻速率时，附加树脂层38可用作牺牲层蚀刻的蚀刻停止层。
如图14H所示，然后可使用任何合适的沉积技术来施加官能化层20B。在该示例中，官能化层20B沉积在附加树脂层38的暴露部分上方。在该示例中，当官能化层20B的沉积在高离子强度(例如，在存在10x PBS、NaCl、KCl等)下进行时，第二官能化层20B不沉积在第一官能化层20A上或附着到该第一官能化层上。因此，官能化层20B不会污染官能化层20A。
然后可进行剩余聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42的剥离。如图14I所示，剥离过程去除聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42和树脂层18和覆盖剩余聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42的官能化层20A。该剥离过程可在二甲基亚砜(DMSO)中使用超声处理，或在丙酮中，或使用基于NMP(N-甲基-2-吡咯烷酮)的剥离剂进行。聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层42的去除暴露了牺牲层48的任何剩余部分。
如图14J中的向下箭头所示，然后使用适用于特定牺牲层48的蚀刻过程去除牺牲层48的任何剩余部分。部分由于官能化层20A、20B共价附接到附加树脂层38，因此官能化层20A、20B在附加树脂层38上方保持完整。***
在一些示例中，引物54、56或54'、56'(图14A至图14J中未示出)可预接枝到官能化层20A。类似地，引物58、60或58'、60'(图14A至图14J中未示出)可预接枝到第二官能化层20B。在这些示例中，不进行另外的引物接枝。
在其他示例中，引物54、56或54'、56'未预接枝到官能化层20A。在这些示例中，引物54、56或54'、56'可在施加官能化层20A之后接枝(例如，在图14F中)。在这些示例中，引物58、60或58'、60'可预接枝到第二官能化层20B。或者，在这些示例中，引物58、60或58'、60'可不预接枝到第二官能化层20B。相反，引物58、60或58'、60'可在施加第二官能化层20B之后接枝(例如，在图14H中)，只要i)官能化层20B具有用于附接引物58、60或58'、60'(与官能化层20A相比)不同的官能团，或者ii)官能化层20A的任何未反应官能团已例如使用Staudinger还原为胺或与被动分子诸如己炔酸的加成点击反应来淬灭。
当在该方法期间进行接枝时，可使用任何合适的接枝技术来实现接枝，诸如本文所公开的那些。利用任何接枝方法，引物54、56或54'、56'与官能化层20A的反应性基团反应，或者引物58、60或58'、60'与官能化层20B的反应性基团反应，并且对附加树脂层38不具有亲和力。
在流通池10K的该示例中，官能化层20A、20B没有被限制在凹入部12内(如在流通池10H中)。相反，官能化层20A、20B形成由附加树脂层38的相邻间隙区域26隔开的相应贴片或垫46A、46B。
虽然图14A至图14J示出了单组官能化层20A、46A和20B、46B的形成，但是应当理解，可形成贴片或垫46A、46B的阵列，例如，其中每组贴片或垫46A、46B通过附加树脂层38的间隙区域26与每个其他组的贴片或垫46A、46B隔开。
图15A至图15K中示出了用于制造流通池10L、10M的其他示例的其他示例性方法。一种示例性方法示出于图15A至图15H中，并且其他方法示出于图15A至图15D和图15I至图15K中。这些图描绘了限定在单层基底68中的凹入部12A。应当理解，该方法可与多层基底一起使用，包括例如基部支持物22和其上的树脂层18。
如图15A所示，限定在单层基底68中的凹入部12A包括深部分78和浅部分80，该浅部分部分地由台阶部分82限定。凹入部12A可通过压印、蚀刻等限定，具体取决于所使用的基底68的类型。在形成凹入部12A之后，可使用硅烷化或等离子体灰化来活化单层基底68，以产生可与随后沉积在其上的官能化层20A反应的表面基团。
如图15B所示，第一官能化层20A施加在凹入部12A上方。第一官能化层20A可以是本文公开的任何示例，并且可使用本文所述的任何技术来沉积。
在图15C至图15E中，然后图案化第一官能化层20A以形成由光致抗蚀剂50覆盖的第一官能化区域(图15E中所示的区域84)。可使用任何光致抗蚀剂。在其他示例中，使用剥离抗蚀剂代替光致抗蚀剂。
如图15C所示，首先将光致抗蚀剂50施加到第一官能化层20A。整个光致抗蚀剂50可被显影以形成不溶性部分，使得该光致抗蚀剂可暴露于蚀刻过程。
然后可使用定时干蚀刻过程从单层基底68，包括从表面、浅部分80以及从深部分78的一部分，去除光致抗蚀剂50和官能化层20A的部分。如图15D所示，停止定时干蚀刻，使得第一官能化层20A和光致抗蚀剂50保留在深部分78的紧邻台阶部分82的部分中。在一个示例中，定时干蚀刻可包括反应离子蚀刻(例如，使用CF4)，其中以约17nm/min的速率蚀刻光致抗蚀剂50。在另一个示例中，定时干蚀刻可包括100％O2等离子体蚀刻，其中以约98nm/min的速率蚀刻光致抗蚀剂50。
在蚀刻光致抗蚀剂50期间，也可去除官能化层20A。可发生燃烧反应，其中官能化层20A被转化为二氧化碳和水，并且从蚀刻室中排出。
如图15E中的向下箭头所描绘的，然后可蚀刻单层基底68，i)以产生间隙区域26，该间隙区域与第一官能化层20A和保留在深部分78的部分中的光致抗蚀剂区域50的表面至少基本上共面，以及ii)紧邻第一官能化层20A和保留在深部分78的部分中的光致抗蚀剂区域50产生第二凹入部12B。这是基于单层基底68的材料选择的干蚀刻过程。该蚀刻过程也是定时的。在一个示例中，该定时干蚀刻可包括或使用90％CF4和10％O2，其中以约42nm/min的速率蚀刻单层基底68。在另一个示例中，定时干蚀刻可包括反应离子蚀刻(例如，使用O2)，其中以约4nm/min的速率蚀刻单层基底68。该过程还可去除不被光致抗蚀剂50覆盖的第一官能化层20A。
如图15F所示，然后可使用任何合适的沉积技术来施加官能化层20B。在该示例中，官能化层20B沉积在间隙区域26和光致抗蚀剂50上方。在该示例中，可使用任何合适的沉积技术，部分原因是第一官能化层20A被覆盖。
然后可进行光致抗蚀剂50的去除。如图15G所示，该过程去除了光致抗蚀剂50和覆盖剩余光致抗蚀剂50的官能化层20B。该去除过程可在二甲基亚砜(DMSO)中使用超声处理，或在丙酮中，或使用基于NMP(N-甲基-2-吡咯烷酮)的剥离剂，或特定光致抗蚀剂的另一合适的去除剂进行。这暴露了官能化层20A，并因此暴露了官能化区域84。
在图15H中，去除间隙区域26上方的官能化层20B。这种去除包括从如本文所述的间隙区域26抛光官能化层20B。这留下紧邻官能化区域84的官能化区域86。图15H描绘了流通池10L。
重新参见图15D，停止光致抗蚀剂的定时干蚀刻，使得第一官能化层20A和光致抗蚀剂50保留在深部分78的紧邻台阶部分82的部分中。与图15E所示的示例不同，该示例性方法不包括蚀刻掉台阶部分82。
相反，随后在图15I中继续该示例性方法，其中可随后使用任何合适的沉积技术来施加官能化层20B。在该示例中，官能化层20B沉积在间隙区域26、台阶部分82和光致抗蚀剂50上方。在该示例中，可使用任何合适的沉积技术，部分原因是第一官能化层20A被覆盖。
然后可进行光致抗蚀剂50的去除。如图15J所示，该过程去除了光致抗蚀剂50和覆盖剩余光致抗蚀剂50的官能化层20B。该去除过程可在二甲基亚砜(DMSO)中使用超声处理，或在丙酮中，或使用基于NMP(N-甲基-2-吡咯烷酮)的剥离剂，或光致抗蚀剂50的任何其他合适的去除剂进行。
在图15K中，去除间隙区域26上方的官能化层20B。这种去除包括从如本文所述的间隙区域26抛光官能化层20B。抛光可以或可以不从凹入部12A的侧壁去除官能化层20B。这留下紧邻官能化区域84的官能化区域86。图15K描绘了流通池10M。
在一些示例中，引物54、56或54'、56'(图15A至图15K中未示出)可预接枝到官能化层20A。类似地，引物58、60或58'、60'(图15A至图15K中未示出)可预接枝到第二官能化层20B。在这些示例中，不进行另外的引物接枝。
在其他示例中，引物54、56或54'、56'未预接枝到官能化层20A。在这些示例中，引物54、56或54'、56'可在施加官能化层20A之后接枝(例如，在图15B中)。在这些示例中，引物58、60或58'、60'可预接枝到第二官能化层20B。或者，在这些示例中，引物58、60或58'、60'可不预接枝到第二官能化层20B。相反，引物58、60或58'、60'可在施加第二官能化层20B之后接枝(例如，在图15F、图15G或图15H或在图15I、图15J或图15K中)，只要i)官能化层20B具有用于附接引物58、60或58'、60'(与官能化层20A相比)不同的官能团，或者ii)官能化层20A的任何未反应官能团已例如使用Staudinger还原为胺或与被动分子诸如己炔酸的加成点击反应来淬灭。
当在该方法期间进行接枝时，可使用任何合适的接枝技术来实现接枝，诸如本文所公开的那些。利用任何接枝方法，引物54、56或54'、56'与官能化层20A的反应性基团反应，或者引物58、60或58'、60'与官能化层20B的反应性基团反应，并且对单层基底68不具有亲和力。
在流通池10L、10M的这些示例中，官能化区域84、86被限制在凹入部内。在图15H中，凹入部包括12A和12B的一部分(如在流通池10H中)。在图15K中，凹入部是凹入部12A。在阵列中，凹入部内的相应区域84、86可通过相邻间隙区域26与另一凹入部内的相应区域84、86隔开。
图16A至图16I中示出了用于制造流通池10N的另一示例的又一示例性方法。这些图描绘了限定在多层基底的树脂层18(包括例如基部支持物22和其上的树脂层18)中的凹入部12A。
在图16A至图16I所示方法的开始，可使用硅烷化或等离子体灰化来活化基部支持物22，以产生可与官能化层20A、20B反应的表面基团。
如图16A所示，限定在树脂层18中的凹入部12A包括深部分78和浅部分80，该浅部分部分地由台阶部分82限定。凹入部12A可通过压印、蚀刻等限定，具体取决于所使用的树脂层18的类型。
参见图16B，通过选择性地蚀刻树脂层18(例如，图16A所示的部分18″)，凹入部12A的深部分78被向下延伸到基部支持物22的表面。这些层18和22中的每个层被选择为具有不同的蚀刻速率，并且因此当蚀刻树脂层18时，基部支持物22充当蚀刻停止层。
对于树脂层18，可使用各向异性氧等离子体进行蚀刻。树脂层18的任何暴露区域可在该过程期间蚀刻，如由图16B中的向下箭头所示。如所提及的，当去除树脂层部分18″时，基部支持物22充当凹入部12A中的蚀刻停止层。当基部支持物22暴露于凹入部12A的深部分78中时，可停止该蚀刻过程，并且因此整个树脂层18未被蚀刻掉(如图16B所示)。此外，还可在压印之前选择台阶部分82的深度(或厚度)，使得在该蚀刻过程期间，基部支持物22的在台阶部分82下面的部分不暴露。因此，台阶部分82的深度(或厚度)可比树脂层部分18″的深度(或厚度)厚(图16A)。
如图16C所示，第一官能化层20A施加在凹入部12A上方，并且因此施加在基部支持物22的暴露部分上。第一官能化层20A可以是本文公开的任何示例，并且可使用本文所述的任何技术来沉积。
然后图案化第一官能化层20A以形成由光致抗蚀剂50覆盖的第一官能化区域(区域84)。可使用任何光致抗蚀剂。在其他示例中，使用剥离抗蚀剂代替光致抗蚀剂。
如图16D所示，首先将光致抗蚀剂50施加到第一官能化层20A。整个光致抗蚀剂50可被显影以形成不溶性部分，使得该光致抗蚀剂可暴露于蚀刻过程。
然后可使用定时干蚀刻过程从树脂层18，包括从浅部分80以及从深部分78的一部分，去除光致抗蚀剂50和官能化层20A的部分。如图16E所示，停止定时干蚀刻，使得第一官能化层20A和光致抗蚀剂50保留在深部分78的紧邻台阶部分82的部分中。在一个示例中，定时干蚀刻可包括反应离子蚀刻(例如，使用CF4)，其中以约17nm/min的速率蚀刻光致抗蚀剂50。在另一个示例中，定时干蚀刻可包括100％O2等离子体蚀刻，其中以约98nm/min的速率蚀刻光致抗蚀剂50。
在蚀刻光致抗蚀剂50期间，也可去除官能化层20A。可发生燃烧反应，其中官能化层20A被转化为二氧化碳和水，并且从蚀刻室中排出。
如图16F中的向下箭头所描绘的，然后可再次蚀刻树脂层18，i)以产生间隙区域26，该间隙区域与第一官能化层20A和保留在深部分78的部分中的光致抗蚀剂区域50的表面至少基本上共面，以及ii)紧邻第一官能化层20A和保留在深部分78的部分中的光致抗蚀剂区域50产生第二凹入部12B。这是基于树脂层18的材料选择的干蚀刻过程。该蚀刻过程也是定时的。在一个示例中，该定时干蚀刻可包括或使用90％CF4和10％O2，其中以约42nm/min的速率蚀刻树脂层18。在另一个示例中，定时干蚀刻可包括反应离子蚀刻(例如，使用O2)，其中以约4nm/min的速率蚀刻树脂层18。该过程还可去除不被光致抗蚀剂50覆盖的第一官能化层20A。
如图16G所示，然后可使用任何合适的沉积技术来施加官能化层20B。在该示例中，官能化层20B沉积在间隙区域26和光致抗蚀剂50上方。在该示例中，可使用任何合适的沉积技术，部分原因是第一官能化层20A被覆盖。
然后可进行光致抗蚀剂50的去除。如图16H所示，该过程去除了光致抗蚀剂50和覆盖剩余光致抗蚀剂50的官能化层20B。该去除过程可在二甲基亚砜(DMSO)中使用超声处理，或在丙酮中，或使用基于NMP(N-甲基-2-吡咯烷酮)的剥离剂，或光致抗蚀剂50的任何其他合适的去除剂进行。该过程还暴露了官能化层20A，并因此暴露了官能化区域84。
在图16I中，去除间隙区域26上方的官能化层20B。这种去除包括从如本文所述的间隙区域26抛光官能化层20B。这留下紧邻官能化区域84的官能化区域86。图16I描绘了流通池10N。
在一些示例中，引物54、56或54'、56'(图16A至图16I中未示出)可预接枝到官能化层20A。类似地，引物58、60或58'、60'(图16A至图16I中未示出)可预接枝到第二官能化层20B。在这些示例中，不进行另外的引物接枝。
在其他示例中，引物54、56或54'、56'未预接枝到官能化层20A。在这些示例中，引物54、56或54'、56'可在施加官能化层20A之后接枝(例如，在图16C中)。在这些示例中，引物58、60或58'、60'可预接枝到第二官能化层20B。或者，在这些示例中，引物58、60或58'、60'可不预接枝到第二官能化层20B。相反，引物58、60或58'、60'可在施加第二官能化层20B之后接枝(例如，在图16G、16H或16I中)，只要i)官能化层20B具有用于附接引物58、60或58'、60'(与官能化层20A相比)不同的官能团，或者ii)官能化层20A的任何未反应官能团已例如使用Staudinger还原为胺或与被动分子诸如己炔酸的加成点击反应来淬灭。
当在该方法期间进行接枝时，可使用任何合适的接枝技术来实现接枝，诸如本文所公开的那些。利用任何接枝方法，引物54、56或54'、56'与官能化层20A的反应性基团反应，或者引物58、60或58'、60'与官能化层20B的反应性基团反应，并且对单层基底68不具有亲和力。
在流通池10N的该示例中，官能化区域84、86被限制在包括12A和12B的部分的凹入部内(如在流通池10H中)。在阵列中，凹入部内的相应区域84、86可通过相邻间隙区域26与另一凹入部内的相应区域84、86隔开。
为了进一步说明本公开，本文给出了实施例。应当理解，提供该实施例是出于说明目的，而不应理解为限制本公开的范围。
非限制性工作实施例
参考图12A至图12H描述的方法的实施例用于沉积用P5引物接枝的PAZAM和用P7引物接枝的PAZAM，以形成隔开的贴片/垫对(其中每对类似于图12H所示的贴片/垫46A、46B)。
在该示例中，玻璃用作基部支持物，并且多层叠堆定位在玻璃上方。多层叠堆包括纳米压印光刻树脂的第一层、铝牺牲层、聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层和纳米压印光刻树脂的第二层。
类似于图12A所示，使用工作印模来图案化纳米压印光刻树脂的第二层。使用各向异性氧等离子体(用于纳米压印光刻树脂的第一层和第二层)、CF4/O2等离子体蚀刻(用于聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层)和稀释的基于KOH的光致抗蚀剂显影剂(用于铝牺牲层)来选择性地(以类似于图12B至图12D所示的方式)去除相应层。这些过程形成若干隔开的凹入部，每个凹入部类似于图12D所示的凹入部12。
然后沉积PAZAM。涂覆所有凹入部以及多层叠堆的层的任何暴露部分。然后将P5引物接枝到PAZAM。通过接枝己炔酸淬灭任何未反应的叠氮化物。
进行选择性蚀刻(用KOH)以去除凹入部中与PAZAM(接枝有P5引物)相邻的区域处的铝牺牲层。这暴露了与PAZAM(接枝有P5引物)贴片/垫直接相邻的玻璃区域。
然后将PAZAM在高离子强度下(例如，在存在10x PBS的情况下)沉积。这样形成了与在凹入部中接枝有P5引物的PAZAM相邻的PAZAM的贴片/垫。然后将P7引物接枝到新PAZAM。接枝有P5引物的PAZAM上的淬灭叠氮化物阻止P7引物接枝到其上。
然后使用丙酮剥离剩余的聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层。聚(甲基丙烯酸甲酯)剥离层的去除也去除了位于其上的PAZAM(接枝有P5引物)，并且暴露了与贴片/垫相邻的铝牺牲层的任何剩余部分。使用KOH蚀刻过程去除剩余的铝牺牲层。
然后将与P5和P7中的每一者互补的寡核苷酸引入到其上形成有垫/贴片的玻璃基底中。互补的P5寡核苷酸(P5')具有与其附接的Alexa FluorTM488染料(得自Thermo Fisher Scientific)，并且互补的P7寡核苷酸(P7')具有与其附接的Alexa FluorTM647染料(得自Thermo Fisher Scientific)。将相应的寡核苷酸与相应引物杂交。将表面暴露于488nm激光器，并拍摄显微图像。该图像在图17A中以黑白显示。然后将表面暴露于647nm激光器，并拍摄显微图像。该图像在图17B中以黑白显示。
图17A和图17B中的每个图中的灰色区域表示相应的水凝胶贴片/垫。在图17A中，激发Alexa FluorTM488染料(得自Thermo Fisher Scientific)。图17A中的灰色区域(在原始图像中为绿色)对应于接枝有P5引物的PAZAM的贴片/垫(具有与其杂交的Alexa fluorTM488染料标记的寡核苷酸)。在图17B中，激发Alexa FluorTM647染料(得自Thermo Fisher Scientific)。图17B中的灰色区域(在原始图像中为紫色)对应于接枝有P7引物的PAZAM的贴片/垫(具有与其杂交的Alexa fluorTM647染料标记的寡核苷酸)。
图17A和图17B中的图像显示该方法导致形成隔开的贴片/垫，其中在每个贴片/垫内，接枝有P5引物的PAZAM位于右侧，接枝有P7引物的PAZAM位于左侧。这些方法可用于选择性地定位不同的引物组，这可能特别适合于同时配对末端测序。
附加说明
应当理解，前述概念和下文更详细讨论的附加概念(假设此类概念不相互矛盾)的所有组合都被设想为是本文所公开的发明主题的一部分。具体地讲，出现在本公开末尾的要求保护的主题的所有组合都被设想为是本文所公开的发明主题的一部分。还应当理解，本文明确采用的也可出现在以引用方式并入的任何公开中的术语应被赋予与本文所公开的特定概念最一致的含义。
本说明书通篇提及的“一个示例”、“另一个示例”、“一种示例”等意指结合该示例描述的特定元素(例如，特征、结构和/或特性)包括在本文所述的至少一个示例中，并且可存在于或不存在于其他示例中。此外，应当理解，用于任何示例的所述元素可以任何合适的方式组合在各种示例中，除非上下文另有明确说明。
虽然已经详细描述了若干示例，但是应当理解，可以对所公开的示例进行修改。因此，上述说明应被认为是非限制性的。
序列表
<110> 因美纳有限公司
<120> 流通池
<130> IP-1910-PCT
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 1
aatgatacgg cgaccaccga 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 2
caagcagaag acggcatacg a 21