用于固定生物标本以进行显微成像的方法和系统与流程

本专利申请要求于2019年5月30日提交的美国临时申请序列号62/854,763的优先权权益，其通过引用整体并入本文。

技术领域

本公开内容的实施方案一般地涉及用于固定生物标本以进行显微成像的方法和系统。更特别地，本公开内容的实施方案涉及将生物标本在凝胶组合物中固定延长的图像捕获时间以使得能够进行多种显微成像技术。一些非限制性实例可包括流式成像(flow imaging)或湿封固显微术(wet-mount microscopy)。

背景技术

常规地，将生物标本涂抹在载片上并在显微镜下观察/分析。在自动化操作中，标本被涂抹在载片上并置于显微镜载物台上。载片沿载物台上的不同位置被自动化操作、扫描和定向，以捕获标本的静止图像。随后，使用表征和识别样品中图案的图像处理技术来处理静止图像，以检测样品中的分析物。

然而，前述自动化程序耗时且需要复杂的机器。这些自动化过程不能实现高通量应用，至少因为必须为每个样品创建载片。另外，该过程产生大量具有生物危害性的固体废物，因为每个样品都会产生载玻片。此外，在载片上涂抹生物标本会使细胞破裂或从其天然状态改变。

为了提高成像标本的效力，已经开发了专注于改进图像处理以产生高分辨率图像的多种显微成像技术。对于一些图像处理方法，拍摄同一标本的大量低分辨率图像。例如，通过图像捕获装置拍摄数百至数千个低分辨率图像。然后将这些低分辨率图像后处理成单个高分辨率图像。由于拍摄了标本的大量图像，因此图像采集时间长并且生物标本必须长时间静止才能获得优良品质的图像。

由于图像捕获时间延长，上述图像处理技术不能用于一些显微成像。例如，由于标本的曝光时间有限，流式成像不能与新的图像处理技术组合。另外，由于细胞运动性，湿封固显微术不能与图像处理技术组合。

因此，需要将生物标本固定延长的时间，以便使得能够使用在产生目标标本的高分辨率图像的同时需要更少时间和废物的显微成像技术。

发明概述

因此，本公开内容的一些实施方案提供了用于固定生物标本以进行显微成像的方法，其包括：提供处于第一状态的凝胶组合物，其中所述凝胶组合物在临界温度下在第一状态与第二状态之间是热可逆的；向凝胶组合物添加生物标本以形成水性混合物；任选地向水性混合物添加试剂；将水性混合物在低于凝胶组合物的临界温度下冷却至第二状态以形成凝胶基质，其中所述生物标本固定在凝胶基质中；以及捕获凝胶基质中生物标本的多个图像。在一些情况下，凝胶组合物在第一状态下是液体。在一些情况下，所述试剂是染色剂，并且所述方法还包括当凝胶组合物处于第一状态时，向水性混合物添加所述染色剂。在一些情况下，所述试剂是裂解剂，并且所述方法还包括当凝胶组合物处于第一状态时，向水性混合物添加所述裂解剂。在一些情况下，所述凝胶在低于临界温度下硬化以形成处于第二状态的凝胶基质。在一些情况下，临界温度为约15℃至25℃。在一些情况下，生物标本包含活细胞。在一些情况下，凝胶组合物可包含藻酸盐、卡拉胶、β-卡拉胶、琼脂、琼脂糖、凝胶多糖(curdlan)、普鲁兰多糖(pullulan)、结冷胶、叉红藻胶(furcellaran)、β-卡拉胶、β-1,3-葡聚糖、明胶、含聚氧化烯的化合物，或其任意组合，其中凝胶组合物形成透明凝胶基质。在一些情况下，将凝胶基质施加至成像基底的表面。在一些情况下，凝胶基质用作通过流式成像、显微术或非基于成像板的测定来分析生物标本的支持物

在一些实施方案中，本公开内容提供了用于在流式成像系统中对生物样品进行成像的方法，所述方法包括：制备用于流式成像细胞仪的标本样品，其包括：提供处于第一状态的凝胶组合物，其中所述凝胶组合物在临界温度下在第一状态与第二状态之间是热可逆的；向凝胶组合物添加生物标本以形成水性混合物；将水性混合物在低于凝胶组合物的临界温度下冷却至第二状态以形成包含标本溶液的凝胶基质，其中所述生物标本固定在凝胶基质中；使标本样品流过流式细胞仪的图像捕获区域；以及捕获标本样品的多个图像。在一些情况下，流式细胞仪捕获标本样品的多个低分辨率图像。在一些情况下，将标本样品的一部分暴露于图像捕获区域至少5秒。在一些情况下，凝胶组合物可包含藻酸盐、卡拉胶、β-卡拉胶、琼脂、琼脂糖、凝胶多糖、普鲁兰多糖、结冷胶、叉红藻胶、β-卡拉胶、β-1,3-葡聚糖、明胶、含聚氧化烯的化合物，或其任意组合，其中凝胶组合物形成透明凝胶基质。在一些情况下，制备标本样品还包括将染色或裂解组合物添加至水性混合物。

在一些实施方案中，本公开内容提供了用于在湿封固系统中在流式成像系统中对生物样品进行成像的方法，所述方法包括：制备标本样品，其包括：提供处于第一状态的凝胶组合物，其中所述凝胶组合物在临界温度下在第一状态与第二状态之间是热可逆的；向凝胶组合物添加生物标本以形成水性混合物；将水性混合物在低于凝胶组合物的临界温度下冷却至第二状态以形成包含标本溶液的凝胶基质，其中所述生物标本固定在凝胶基质中；将标本样品的一部分置于显微镜载片上；以及捕获标本样品的多个图像。在一些情况下，所述多个图像是低分辨率图像，并且其中所述多个图像中的每一个是凝胶基质中经固定生物标本的静止图像。在一些情况下，凝胶组合物可包含藻酸盐、卡拉胶、β-卡拉胶、琼脂、琼脂糖、凝胶多糖、普鲁兰多糖、结冷胶、叉红藻胶、β-卡拉胶、β-1,3-葡聚糖、明胶、含聚氧化烯的化合物，或其任意组合，其中凝胶组合物形成透明凝胶基质。在一些情况下，制备标本样品还包括将染色或裂解组合物的等分试样添加至水性混合物。

附图简述

图1示出了根据本公开内容的一个实施方案的凝胶中经固定嗜碱性粒细胞的一个实例。

图2示出了根据本公开内容的一个实施方案的凝胶中经固定嗜酸性粒细胞的一个实例。

图3示出了根据本公开内容的一个实施方案的凝胶中经固定中性粒细胞的一个实例。

图4示出了根据本公开内容的一个实施方案的凝胶中经固定淋巴细胞的一个实例。

图5示出了根据本公开内容的一个实施方案的凝胶中经固定单核细胞的一个实例。

发明详述

本公开内容的一些实施方案涉及用于生物样品的研究、诊断和筛选测定。本公开内容的一些具体实施方案可用于在通过显微术或成像方法进行连续性或周期性分析期间将生物样品固定在凝胶组合物中，从而降低以下的不利影响：细胞运动性、细胞从基底上脱离、布朗运动(Brownian motion)的影响、细胞位置的物理干扰或样品操作期间相互关系的损失。在一些实施方案中，可将生物样品中的活性组分固定在低于临界温度下形成的凝胶基质内。在一些实施方案中，生物样品可包括多细胞结构、细胞、病毒、蛋白质、酶、核酸例如DNA等。在一些实施方案中，生物样品可包括胞内结构和寄生物。在一些实施方案中，凝胶组合物是活细胞相容的，并且用于固定生物标本以进行对不同光学平面的依次成像，以进行3D重建或采集图像，以用于基于相机的显微术方法。

如上所述，新的成像技术需要延长的图像捕获时间来拍摄生物样品中生物标本的大量图像。例如，流式成像细胞术在标本溶液流中行进细胞的图像捕获区域中捕获样品溶液的图像，并持续监测以进行细胞摄像。流式成像细胞术使得能够高通量分析样品，并提供了用于分析处于其天然状态的样品的手段。相对地，当将样品涂抹在载片上时，细胞会破裂或从其天然状态改变。例如，当将血液涂抹在载片上时，红细胞通常会破裂。

然而，流式成像细胞术中的曝光时间限制了需要延长的图像捕获时间的新的图像处理技术的使用。例如，流式成像细胞术的曝光时间为约1.8微秒。为了拍摄大量低分辨率图像，在图像捕获区域中流动的标本可能需要曝光待拍摄足够数目的图像的时段。在一些情况下，标本应曝光至少5秒或更长时间。在一些情况下，标本应曝光至少8秒或更长时间。在一些情况下，标本应曝光至少10秒或更长时间。在一些情况下，标本应曝光5秒至30秒，例如，6秒至28秒、8秒至26秒、10秒至24秒、12秒至22秒、14秒至20秒，或16秒至18秒。

本发明人已经发现生物标本可以固定在凝胶组合物中以提供延长的图像捕获时间。另外，通过使用凝胶组合物，可以控制包含生物标本的样品流体的黏度以减慢标本溶液在流式成像细胞仪的图像捕获区域中的流动。例如，凝胶组合物可形成含有生物标本的高黏度凝胶以减慢生物标本在流式细胞仪中的流动(同时将生物标本的细胞固定在凝胶中)以提供5秒至30秒的图像捕获时间。具体地，在胶凝条件下(例如，在升高的温度下呈液体形式而在较低温度下呈凝胶形式)，包含生物标本的凝胶组合物硬化以形成凝胶以抑制或阻止生物标本中细胞的布朗运动，所述布朗运动通常会导致流式细胞术中的图像捕获问题。有利地，延长的图像捕获时间使得流式成像装置能够拍摄生物标本中静止细胞的一系列低分辨率图像。随后可以对这一系列低分辨率图像进行后处理，以产生以其天然状态的标本的高分辨率图像。在一些情况下，使用人工智能处理低分辨率图像以将低分辨率图像转换为一个或更多个高分辨率图像。添加至生物标本的凝胶组合物允许以所有益处使用流式成像，同时能够使用新的图像处理技术。

在一个实施方案中，用于固定生物标本以进行显微成像的方法包括：提供处于第一状态的凝胶组合物，其中所述凝胶组合物在临界温度下在第一状态与第二状态之间是热可逆的；向凝胶组合物添加生物标本以形成水性混合物；任选地向水性混合物添加试剂；将水性混合物在低于凝胶组合物的临界温度下冷却至第二状态以形成凝胶基质，其中所述生物标本固定在凝胶基质中；以及捕获凝胶基质中生物标本的多个图像。

在一些情况下，凝胶组合物为生物样品提供了惰性环境。例如，凝胶组合物不与生物样品的细胞发生化学相互作用。凝胶组合物中生物样品的细胞能够正常发挥功能并被包裹在凝胶基质中。凝胶组合物形成在不将细胞从其天然状态改变(例如，破坏)的情况下抑制生物样品中细胞的布朗运动的硬化溶液。凝胶组合物用于抑制或阻止细胞的天然运动(例如布朗运动和流体运动)，以便在需要的时间内可捕获多个图像；然而，凝胶对于样品的操作仍然是柔软和柔韧的。对于热可逆性凝胶组合物，在高于凝胶临界温度的温度下，在凝胶为液体形式时可并入生物样品。当将温度降低例如至室温时，凝胶组合物形成凝胶并且细胞被捕获在凝胶基质中。可以在凝胶处于液相时施用任何必要或期望的试剂，从而确保细胞能够吸收凝胶基质中的必要试剂。一些非限制性实例包括将染色或裂解组合物添加至处于液相的凝胶。在成像之后，可以提高带有所捕获细胞的凝胶基质的温度，以允许通过转变至液相来提取细胞。在一些方面中，在凝胶的选定区域提高凝胶的温度，从而允许在没有任何不良作用的情况下微选择具有给定特征的细胞群。以这种方式，可以以高效的方式处理包含生物标本的液体凝胶组合物。

在一些实施方案中，本公开内容提供了用于将生物标本固定在凝胶组合物中的方法。凝胶组合物可以是热可逆的。换言之，凝胶组合物从在高于其临界温度的温度下的液相热可逆至在低于其临界温度的温度下的凝胶相，或反之亦然。在一些情况下，凝胶组合物可最初以在高于其临界温度的温度下的液体形式提供。可向凝胶组合物添加生物标本以形成水性混合物。可任选地向水性混合物添加一种或更多种试剂。例如，可将染色剂或裂解剂添加至水性混合物。水性混合物的温度可以降低到低于凝胶组合物的临界温度以将生物标本固定在凝胶基质中。凝胶特性可通过为聚合物提供适合于不同应用的不同转变温度的制剂来调节。在操作之前或操作期间，凝胶组合物可用于捕获、支持、覆盖(over-layer)或悬浮颗粒、珠、细胞等。在温度变化时，凝胶硬化，从溶胶(例如，液体形式)转变为凝胶，提供了凝胶基质中的经固定细胞/颗粒。例如，凝胶可经历主动或被动冷却以形成凝胶基质。在一些实施方案中，凝胶组合物在高于室温的温度下可具有低黏度(例如，溶胶形式)并且在室温下可具有高黏度(例如，凝胶形式)。

在临界温度下凝胶的快速形成固定了生物样品，并为细胞的操作、分析或处理提供了支持基质。例如，凝胶可固定活细胞以防止布朗运动。还预期了凝胶的快速形成在细胞上提供固定层。以这种方式，固定层也可以在施加至显微镜载片或用盖片压紧时保护细胞。凝胶的热可逆性允许这些细胞被选择性地移出并进一步处理。另外，凝胶形成提供了高黏度的生物标本，从而消除了在显微镜载片上涂抹生物标本的需要。

在一些情况下，由凝胶形成的基质是为经固定生物标本提供支持的三维结构。基质结构用作维持凝胶完整性的骨架。用于凝胶的基质结构的性质影响孔隙度和基质网络的其他特征。在一些实施方案中，可基于凝胶基质的期望功能提供产生具有特定孔隙度的三维基质结构的凝胶组合物。

另外，可将一种或更多种试剂添加至凝胶组合物以进行生物修饰，其将赋予凝胶组合物以另外的功能。在一些实施方案中，“试剂”可包括针对其化学或生物活性使用的任何合适的物质。试剂可以是液体或干燥形式。试剂的一些实例可包括报道子(例如，标志物)、支持试剂，例如裂解溶液、染色剂、缓冲剂等。例如，可将生长因子或信号传导分子添加至凝胶组合物以维持或修饰特定的细胞表型。在一些实施方案中，可出于调节光照明对细胞的光物理和光化学作用的目的添加试剂，或者报道分子将赋予凝胶组合物以另外的功能以在流式细胞术期间提高图像捕获。例如，在凝胶相或液相中，可添加试剂来修饰生物样品中的细胞。

凝胶组合物可以以宽范围浓度存在于水性混合物中，精确的量取决于凝胶的预期应用、凝胶的物理特征、所用凝胶形成组分的胶凝特性，以及其他类似因素。在一些实施方案中，基于水性混合物的总重量，凝胶形成组分可以以非常低的浓度、以低至1wt％或更少的量存在。在一些实施方案中，基于水性混合物的总重量，水性混合物的凝胶形成组分以约0.1wt.％至约25wt.％的量存在。在一些实施方案中，基于水性混合物的总重量，水性混合物的凝胶形成组分以约0.5wt.％至约20wt.％的量存在。在一些实施方案中，基于水性混合物的总重量，水性混合物的凝胶形成组分以约1wt.％至约10wt.％的量存在。

在一些实施方案中，合适的凝胶形成材料可包括多糖水凝胶。一些非限制性实例包括藻酸盐、卡拉胶、琼脂、凝胶多糖、普鲁兰多糖、结冷胶或其任何合适的组合。在一些实施方案中，可以利用基于热可逆聚合物的多种水凝胶(在升高的温度下呈液体形式，但在较低温度下呈凝胶形式)。一些非限制性实例包括天然凝胶形成材料，例如琼脂糖、琼脂、叉红藻胶、β-卡拉胶、β-1,3-葡聚糖例如凝胶多糖、明胶或含聚氧化烯的化合物，或其任何合适的组合。在一些实施方案中，合适的凝胶形成材料可包括琼脂糖凝胶，因为其胶凝/熔化温度低，并且尤其可用于涉及生物活性材料的凝胶基质应用。市售琼脂粉可包括例如来自Sigma Aldrich Co.Ltd.的Agar A-7002、Agar A-9414和Agar A-9045。在一些情况下，优选的琼脂粉是低熔点琼脂(例如，熔点低于约75℃)。

在一些实施方案中，可将琼脂粉添加至去离子水以形成琼脂溶液。琼脂溶液可包含约0.1wt.％至约10wt.％琼脂(例如，约0.5wt.％至约8wt.％、约0.8wt.％至约5wt.％或约0.9wt.％至约2wt.％)。在一些实施方案中，琼脂溶液可包含约0.1wt.％、0.2wt.％、0.3wt.％、0.4wt.％、0.5wt.％、0.6wt.％、0.7wt.％、0.8wt.％、0.9wt.％、1wt.％、2wt.％、3wt.％、4wt.％、5wt.％、5wt.％、7wt.％、8wt.％、9wt.％、或约10wt.％琼脂。

在一些情况下，凝胶组合物形成液体(例如，第一状态)的临界温度为大于约20℃。在一些情况下，凝胶组合物形成液体的临界温度为大于约25℃。在一些情况下，凝胶组合物形成液体的临界温度为大于约30℃。在一些情况下，凝胶组合物形成液体的临界温度为大于约35℃。在一些情况下，凝胶组合物形成液体的临界温度为大于约40℃。在一些情况下，凝胶组合物形成液体的临界温度为大于约50℃。在一些情况下，凝胶组合物形成液体的临界温度为大于约60℃。在一些情况下，凝胶组合物形成液体的临界温度为大于约70℃。在一些情况下，凝胶组合物形成液体的临界温度为大于约80℃。根据凝胶形成化合物的类型和凝胶形成化合物的预期用途，凝胶组合物的临界温度可以变化。

在液体形式中，生物标本可与凝胶组合物混合。例如，对于表现出凝胶-溶胶热可逆性的胶凝组合物(gelling composition)，生物标本可与为溶胶或液体形式的凝胶组合物混合。对于“热可逆”我们是指在高于或低于临界转变点凝胶组合物凝胶形成的特性，而该组合物的液体或溶胶形式存在于高于或低于该转变点的温度下。另外，可以引入试剂，例如染色剂、染料(荧光探针)、生长因子和报道分子，以产生均质制剂。从液相中或从凝胶的稀释物中回收细胞或颗粒可通过常规方法包括离心法、过滤或磁分离或其组合来实现。

在一些实施方案中，凝胶组合物形成凝胶(例如，第二状态)的临界温度为小于约20℃。在一些实施方案中，凝胶组合物形成凝胶的临界温度为小于约15℃。在一些实施方案中，凝胶组合物形成凝胶的临界温度为小于约10℃。在一些实施方案中，凝胶组合物形成凝胶的临界温度为小于约2℃。在一些实施方案中，凝胶组合物形成凝胶的临界温度为小于约2℃。在凝胶形式中，经固定生物标本的细胞或颗粒被嵌入或支持在三维凝胶基质中。凝胶基质可以保持基质中细胞功能或颗粒完整性。即，生物标本中的细胞不会破裂并完整地保持在凝胶基质中。在这种凝胶基质中，可以在低温下引入细胞或颗粒，保持了细胞功能或颗粒完整性，而没有使用仅在升高的温度下才会变成液体的凝胶的热冲击潜能。在一些实施方案中，凝胶基质将细胞生存力和细胞功能保持足以用于分析目的的时间段。

凝胶组合物可具有使得能够对生物样品进行基于光的光学分析的光学特性。特别地，凝胶可具有包含聚合物的组合物作为在颗粒光学分析中的支持基质。例如，凝胶可具有低的光吸光度并且可以是非荧光的。在一些实施方案中，凝胶组合物可以是光学透明(optically clear)的、透明的(transparent)或二者兼有。

凝胶组合物可适合于需要收集光的方法中的校准、光学对准或定向。例如，该组合物可用于二维或更多维光学切片内的校准、点扩展函数确定和事件定向。有利地，出于分析物的机械递送和需要收集光的后续光学分析的目的，支持基质组合物形成可寻址阵列(addressable array)。一些非限制性实例包括透射、相衬(phase-contrast)、荧光、荧光寿命(fluorescence-lifetime)、生物发光、化学发光、各向异性、光散射和折射率或其任何合适组合。

可将凝胶组合物以胶凝浓度添加至生物标本，以为活的或固定的细胞的附着培养物或平面制备物提供覆盖层。凝胶可提供方便的方式来保护细胞以进行原位染色或标记细胞，或进行二者。在一些情况下，凝胶的液体-凝胶转变是温度的函数，并因此提供了在较高温度下铺展凝胶以及通过降低制备物温度通过凝胶形成停止铺展来控制凝胶深度的方式。另外，附着特性将允许胶凝标本的倒置，以便可以使用倒置显微术形式。在此，凝胶可以在标本与另一个光学界面之间提供水凝胶相以进行成像。

基于凝胶组合物的制剂，凝胶可形成细胞或颗粒或试剂支持/包埋基质，其为操作、处理和分析提供了有利的特性。在室温(通过制剂选择的高于15℃以在室温至37℃下实现凝胶形式)下，凝胶可以是疏水的。

在一些实施方案中，凝胶具有低细胞毒性以使得能够进行活细胞处理。在一些情况下，凝胶组合物基本上无细胞毒性。例如，对于微生物体，凝胶在稳定的凝胶形式下应具有低毒性。本文中使用的“细胞毒性”是指对哺乳动物细胞结构或功能造成致命损害的特性。在一些实施方案中，凝胶制剂的pH对细胞生存力是重要的。例如，根据生物标本，凝胶制剂的pH可能需要通过添加缓冲溶液来调节至特定的pH范围。

流式成像

在一些实施方案中，本文中所述的用于固定生物标本的方法可特别地地用于流式成像显微术。凝胶可用作基本上固定细胞或颗粒以降低运动的支持基质以用于成像目的。另外，凝胶组合物可形成含有生物标本的高黏度溶液，以减慢生物标本在流式细胞仪中的流动，以提供5秒至30秒的图像捕获时间。以这种方式，凝胶形成在为流式成像提供足够黏度的凝胶溶液的同时抑制生物样品中细胞的布朗运动。固定对于允许检查高密度和信息丰富的视野是重要的。一些非限制性实例可包括对由不同荧光染料或特征标记的细胞/颗粒子集的计数。例如，使生物标本固定可允许检查细胞/颗粒特征随时间的成像变化、需要依次采集的细胞/颗粒的多重分析、细胞/颗粒视野中异步事件的成像、以及亚细胞事件的高分辨率成像，如果细胞本身是可运动的，则上述可能会受到损害。

在流式成像细胞仪中，标本溶液中的细胞以流过图像捕获区域的方式行进，所述图像捕获区域被连续监测以进行细胞摄像。在一些情况下，生物样品中的细胞/颗粒用荧光染料处理，并且标本溶液用来自脉冲光源的光辐照以激发荧光，和/或用红外光辐照以监测细胞通过细胞仪。然后，当检出目的细胞颗粒时，用高亮度的光脉冲辐照细胞颗粒以获得荧光发射细胞的静止图像。在检出细胞时，可以启动光源以获取细胞的基于光的图像。

有益的是，所描述的方法使得能够使用采用需要延长图像捕获时间的新的图像处理技术的流式成像。例如，通过向提供给流式成像细胞仪的生物标本添加凝胶组合物，可以控制样品流体的黏度，从而降低标本中分析物的运动/速度。这为图像捕获提供了更长的时间，允许获取大量低分辨率图像。例如，可以拍摄处于其经固定状态的标本的数百个低分辨率图像。显微成像装置可利用对低分辨率图像进行后处理以产生高分辨率图像的图像处理改进。另外，相对便宜的光学器件可用于捕获低分辨率图像。

可以描述提供应用的一般方法，在所述应用中活的或固定的细胞、颗粒或珠可以与可包含信息性染料或其他报道分子的制剂一起掺入到凝胶中。这些基本方案可适用于药物发现中候选产品筛选、基于细胞和颗粒/珠的生物技术的具体应用，以及成像和显微术和非基于成像板的测定中的多种应用。

湿封固

在一些实施方案中，固定生物标本的方法可用于湿封固显微术。包含经固定生物标本的凝胶基质的等分试样可以悬浮在载片与盖片之间。为了制备湿封固物(wet mount)，将标本样品置于试管中，向其添加期望裂解或染色组合物的等分试样并添加凝胶组合物。将标本充分混合并加盖并在室温下孵育，以使裂解剂或染色剂渗入样品。在一些情况下，与裂解剂或染色剂一起孵育可进行12至18小时。将薄的标本滴置于显微镜载片上，并用显微镜盖片覆盖。然后在血细胞计中分析该湿封固物。

在湿封固显微术中，样品标本通常以液体形式提供，因此布朗运动是个问题。布朗运动会在细胞中引起足够的运动性以至于无法拍摄数百个低分辨率图像以进行新的成像技术，因为细胞的运动太高而无法捕获到优良品质的图像。例如，美国专利公布No.2013/0169948(其内容出于所有意图和目的通过引用整体并入)描述了拍摄多个不同分辨率图像以产生高分辨率图像的过程。通过将凝胶组合物添加至标本溶液，标本可被固定以进行图像捕获。例如，可将标本定位在凝胶的液相中并保持在适当位置，直至液相聚合产生足够的凝胶强度以固定标本。

可根据本文中所述的方法制备薄的生物标本滴以固定生物标本。例如，可以在高于凝胶组合物临界温度的温度下向凝胶组合物添加生物标本以形成水性混合物。可将期望的裂解或染色组合物的等分试样添加至水性混合物并孵育一段时间。水性组合物的温度可降低至低于凝胶组合物的临界温度以形成包含生物标本的凝胶基质。可将包含生物标本的凝胶基质样品置于显微镜载片上。在一些实施方案中，显微镜载片可用显微镜盖片来覆盖。使用形成的凝胶基质，产生用于湿封固显微术的具有整个完整细胞的载片，并抑制细胞的运动。在这种情况下，可以在固定细胞的同时捕获多个低分辨率图像。然后，应用图像处理技术以将多个低分辨率图像转换为高分辨率图像。

在一些情况下，标本可以在凝胶的液相中染色。例如，可将标本溶液的温度升高高于凝胶的临界温度以形成液体，可将染色剂添加至标本溶液，并然后可将标本溶液的温度降低低于临界点以形成凝胶。

成像基底的表面积可影响包含生物标本的标本溶液的硬化。例如，在具有大表面积的成像基底上沉积少量标本溶液可导致标本溶液在接触时硬化。在一些情况下，在具有大表面积的成像基底(例如，平底板)上沉积标本溶液可导致样品在标本溶液可在成像基底上铺展成薄层之前硬化，从而导致图像品质不佳。

在一些实施方案中，标本溶液可沉积在具有使得样品溶液能够在硬化之前铺展在成像基底上的表面积的成像基底上。例如，可将特定量的标本溶液沉积到成像基底(例如显微镜载片)上，以具有特定的标本溶液体积与成像基底表面积的比例。预期可以控制标本溶液体积与成像基底表面积的比例以防止在与成像基底接触时硬化。例如，标本溶液体积与成像基底表面积的比例可以为0.001:1至20:1，例如0.01:1至15:1、0.05:1至10:1、0.1:1至8:1、0.5:1至6:1、0.8:1至4:1、1:1至3:1。通过控制该比例，标本溶液可在成像基底上铺展成薄层，从而在成像期间获得更大视野。

在一些实施方案中，本文中所述的方法可用于自动化系统中。例如，凝胶组合物可以提供在成像基底中或提供在成像基底上，所述成像基底包括例如，包含一系列囊(pocket)的多室板、盘(reel)或条带(strip)。可将生物样品和任选地试剂(例如染色剂或裂解剂)添加至包含凝胶组合物的囊。例如，可将染色剂或裂解剂添加至含有凝胶组合物的囊。一旦染色或裂解完成，将囊冷却使反应混合物凝胶化，从而将细胞/颗粒固定在凝胶基质中。然后，可使用较早描述的成像技术对凝胶基质中的细胞/颗粒进行成像，该技术需要长的曝光时间或多次曝光而不需要对象运动。在成像之后，可以加热反应混合物以将凝胶基质转变为液体形式并作为废物丢弃。

图1至5示出了根据本公开内容一些实施方案的凝胶中来自生物标本的特定的经固定细胞的图像。在这些实例中，将生物标本与染色剂混合并在47℃下孵育约45秒。然后将液体琼脂凝胶组合物添加至经染色的生物标本以形成样品溶液。将样品溶液置于显微镜载片上并使其冷却至室温。在室温下，液体琼脂凝胶组合物形成凝胶以将细胞固定在样品溶液中。在来自Olympus(Lake Success,N.Y.)的标准显微镜下观察制备的显微镜载片，并使用连接至显微镜的相机拍摄照片。图1至5中的每个图像示出了固定在凝胶(例如，硬化凝胶)中的来自生物标本的细胞。具体地，图1示出了经固定嗜碱性粒细胞的一个实例，图2示出了经固定嗜酸性粒细胞的一个实例，图3示出了经固定中性粒细胞的一个实例，图4示出了经固定淋巴细胞的一个实例以及图5示出了经固定单核细胞的一个实例。

实施例

对固定在包含胶凝剂、来自Sigma Aldrich Co.Ltd.的琼脂粉和去离子水的制剂中的生物样品进行凝胶成像实验。琼脂粉是胶凝组分。

比较例1至3各自包含由Agar A-7002(来自Sigma Aldrich Co.Ltd)和去离子水构成的制剂。Agar A-7002的熔点高于75℃。

对于比较例1，将Agar A-7002粉末在烧瓶中与去离子水混合以形成10wt.％琼脂溶液。将含有10wt.％琼脂溶液的烧瓶置于75℃热水浴中。Agar A-7002粉末在热水浴中没有完全溶解。然而，将热水浴温度升至80℃，Agar A-7002粉末仍未溶解。

对于比较例2，将Agar A-7002粉末在烧瓶中与去离子水混合以形成5wt.％琼脂溶液。将含有5wt.％琼脂溶液的烧瓶置于80℃热水浴中。Agar A-7002粉末在5wt.％琼脂溶液中溶解，然而，溶液太黏稠。因此，5wt.％琼脂溶液难以移液并且必须被丢弃。

在比较例3中，将Agar A-7002粉末在烧瓶中与去离子水混合以形成1wt.％琼脂溶液。将含有1wt.％琼脂溶液的烧瓶置于80℃热水浴中。Agar A-7002粉末在1wt.％琼脂溶液中溶解，然而，1wt.％琼脂溶液由于从80℃至室温的温度变化而难以移液。因此，由Agar A-7002构成的1wt.％琼脂溶液对于使用也是不切实际的，并且必须被丢弃。

比较例4和5各自包含由与去离子水混合的低熔点琼脂粉末构成的制剂。比较例4包含含有熔点小于60℃的Agar A-9414(来自Sigma Aldrich Co.Ltd)粉末的制剂。比较例5包含含有熔点小于或等于65℃的Agar A-9045(来自Sigma Aldrich Co.Ltd)粉末的制剂。

对于比较例4，将Agar A-9414粉末在烧瓶中与去离子水混合以形成1wt.％琼脂溶液。将含有1wt.％琼脂溶液的烧瓶置于65℃热水浴中。Agar A-9414粉末在热水浴中在1wt.％琼脂溶液中溶解。

对于比较例5，将Agar A-9045粉末在烧瓶中与去离子水混合以形成1wt.％琼脂溶液。将含有1wt.％琼脂溶液的烧瓶置于65℃热水浴中。Agar A-9045粉末在热水浴中在1wt.％琼脂溶液中溶解。

对于比较例4和5中的每一个，将100μl溶解的琼脂溶液与经染色的生物样品(例如，在染色剂中稀释的生物样品，以1:5之比)混合。将混合的患者样品在室温下倒入六孔平底培养板中。比较例4和5的琼脂溶液中的每一种在与板接触时均变成凝胶状，并且不允许混合的患者样品在孔上铺展成薄层。因此，室温下具有小体积患者样品(350μl)的孔(直径34.8mm)的大表面积对于任一种琼脂溶液均不成功。尽管对于这些实施例，低熔点琼脂粉末在溶液中溶解，但成像基底的大表面积导致患者样品在其可以铺展成薄层之前固化。

通过将Agar A-9045粉末与去离子水混合以形成5wt.％琼脂溶液来制备实施例1。将5wt.％琼脂溶液置于65℃水浴中，并且Agar A-9045粉末在溶液中完全溶解。将50至75μl 5wt.％琼脂溶液与经染色的患者样品(例如，在染色剂中稀释的生物样品，以1:5之比)混合。将混合的患者样品移液到两孔显微镜载片上。混合的患者样品在孔中在约15至20秒内硬化，这允许混合的患者样品在硬化之前铺展成薄层。将载片置于显微镜下，这出人意料地显示出，由于凝胶形成，通常在常规载片中看到的细胞的布朗运动不存在。另外，患者样品(例如，细胞)本身是完整的，并且没有显示出被损坏或破坏的迹象。有益地，混合的患者样品体积与成像基底表面积之比足以允许混合的患者样品在硬化之前铺展成薄层。

应当理解，本文中所述的多种不同特征可以与多个实施方案互换使用。例如，如果关于特定实施例描述了一个特征，则应当理解，该同一特征也可以与其他实施例一起使用。

尽管已经示出和描述了某些实施方案，但是应当理解，在不脱离本公开内容或所附权利要求书的范围或精神的情况下，可以对以上记载和附图中示出的结构和方法进行改变和修改、添加和删除。