双机制荧光体系及其在制备胃癌辅助诊断试剂盒中的应用
本发明涉及分析化学，尤其是指双机制荧光体系及其在制备胃癌辅助诊断试剂盒中的应用。
背景技术：
1、胃癌位列我国所有肿瘤发病率的第二位，据2020年全球癌症数据(global cancerstatistics 2020)显示，我国胃癌的5年生存率仅为35.1％，远低于日本的64.6％和韩国的71.5％，这主要归因于我国对胃癌早筛早诊的缺乏。目前胃癌的临床诊断仍然依赖于肿瘤组织成像和病理检查相结合的侵入性方法，这往往对早期胃癌不敏感，并可能增加病变的风险。随着国民健康意识的提高，胃镜作为早期胃癌筛查手段也逐渐被大家所接受。但胃镜筛查不仅成本高，且给病人带来生理上的痛苦和一定的危险性。相比之下，基于生物标志物的液体活检提供了一种灵敏的非侵入性胃癌诊断方法。同时，胃癌复杂的病理机制使多种生物标志物的联合评价非常重要。
2、mirna是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的小rna，其在细胞内具有多种重要的调节作用，癌症的发展进程伴随着多种mirna表达水平的上调或者下调。因此，mirna已被作为癌症诊断的一类非常成熟的生物标志物。然而，通过mirna进行胃癌诊断的报道大都是通过某一种microrna的含量水平进行诊断，准确性和灵敏度很难达到临床诊断的标准。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种双机制荧光体系，包括由荧光基团修饰的on-探针和off-探针，on-探针为单链dna，特异性识别上调标志物，off-探针为双链dna，特异性识别下调标志物。on-探针吸附于无机纳米材料表面，与上调标志物结合后脱离无机纳米材料表面，荧光增强，off-探针中修饰有荧光基团的单链被下调标志物置换，荧光猝灭。通过tcga数据库筛选到与胃癌高度相关的三种上调mirna和三种下调mirna，对应设计了三种on-探针和三种off-探针，六种mirna的含量变化均会引起反应体系中荧光强度的变化，通过k-means算法对荧光变化结果进行聚类分析，能够辅助判断待测样本是否患有胃癌。
2、本发明的第一个目的是提供一种双机制荧光体系，包括由on-探针和off-探针，所述on-探针特异性识别上调标志物，所述off-探针特异性识别下调标志物；
3、所述on-探针为修饰有荧光基团的单链dna，吸附于无机纳米材料表面，与上调标志物结合后脱离无机纳米材料表面，荧光增强；
4、所述off-探针为双链dna，其中一条单链修饰有荧光基团，修饰有荧光基团的单链被下调标志物置换，并吸附于无机纳米材料表面，荧光猝灭，未修饰荧光基团的单链与下调标志物杂交形成双链。
5、本发明的第二个目的是提供上述双机制荧光体系在制备胃癌辅助诊断试剂盒中的应用。
6、本发明的第三个目的是提供一种试剂盒，包括用于识别胃癌mirna生物标志物的探针组合及吸附单链dna的无机纳米材料；
7、所述胃癌mirna生物标志物包括上调标志物和下调标志物，所述上调标志物包括mirna-21、mirna-18a和mirna-20a，所述下调标志物包括mirna-133a、mirna-133b和mirna-30a；
8、所述探针组合包括on-探针和off-探针，所述on-探针为单链dna，修饰有荧光基团，用于识别所述上调标志物；所述off-探针为双链dna，其中一条单链修饰有荧光基团，用于识别所述下调标志物。
9、进一步地，mirna-21的核苷酸序列如seq id no.1所示，mirna-18a的核苷酸序列如seq id no.2所示，mirna-20a的核苷酸序列如seq idno.3所示，mirna-133a的核苷酸序列如seq id no.4所示，mirna-133b的核苷酸序列如seq id no.5所示，mirna-30a的核苷酸序列如seq id no.6所示。
10、进一步地，所述无机纳米材料包括氧化石墨烯。
11、进一步地，所述on-探针包括on-探针-21、on-探针-18a和on-探针-20a，所述off-探针包括off-探针-133a、off-探针-133b和off-探针-30a，其中：
12、on-探针-21用于识别mirna-21，核苷酸序列如seq id no.7所示；
13、on-探针-18a用于识别mirna-18a，核苷酸序列如seq id no.8所示；
14、on-探针-20a用于识别mirna-20a，核苷酸序列如seq id no.9所示；
15、off-探针-133a用于识别mirna-133a，核苷酸序列如seq id no.10-11所示；
16、off-探针-133b用于识别mirna-133b，核苷酸序列如seq id no.12-13所示；
17、off-探针-30a用于识别mirna-30a，核苷酸序列如seq id no.14-15所示。
18、进一步地，所述试剂盒中还包括健康人和胃癌患者的血清标准品。
19、进一步地，所述荧光基团为fam，修饰于探针的5’端。
20、进一步地，使用方法包括以下步骤：
21、步骤s1、从待测样本中提取总mirna，加入所述探针组合和无机纳米材料共同孵育，检测反应体系的荧光变化；
22、步骤s2、通过k-means算法对荧光变化结果进行聚类分析，辅助判断待测样本是否患病。
23、进一步地，所述on-探针在反应体系中的终浓度为10-50mm。
24、优选地，所述on-探针在反应体系中的终浓度为15mm。
25、进一步地，所述off-探针在反应体系中的终浓度为20-50mm。
26、优选地，所述off-探针在反应体系中的终浓度为40mm。
27、进一步地，选择血清标准品(1例胃癌患者，1例健康人)作为初始的聚类中心，然后计算每个样本与各个聚类中心之间的距离，把每个样本分配给距离它最近的聚类中心，然后根据当前分配的样本重新计算聚类中心，重复以上步骤，直至聚类中心不再发生变化，得到聚类结果，该聚类结果将胃癌患者和健康人进行区分。
28、本发明的第四个目的是提供上述试剂盒在胃癌辅助诊断中的应用。
29、本发明的有益效果：
30、本发明机理简单，通用性强，针对不同的mirna可设计相应的on-探针或off-探针，进行相应的检测。将该体系应用于制备胃癌辅助诊断试剂盒，能快速将待测者血清中胃癌相关mirna信号转化为荧光信号，从而通过荧光强度的变化判断待测者是否有罹患胃癌的风险。除此之外，由于无机纳米材料吸附单链dna以及引起荧光强度变化的机理已十分成熟，因此拥有稳定性和高度重现性，可以应用于其他疾病的早期辅助诊断，具有广阔的应用前景。
技术特征：
1.一种双机制荧光体系，其特征在于：包括on-探针和off-探针，所述on-探针特异性识别上调标志物，所述off-探针特异性识别下调标志物；
2.权利要求1所述的双机制荧光体系在制备胃癌辅助诊断试剂盒中的应用。
3.一种试剂盒，其特征在于：包括用于识别胃癌mirna生物标志物的探针组合及吸附单链dna的无机纳米材料；
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述无机纳米材料包括氧化石墨烯。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述on-探针包括on-探针-21、on-探针-18a和on-探针-20a，所述off-探针包括off-探针-133a、off-探针-133b和off-探针-30a，其中：
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括健康人和胃癌患者的血清标准品。
7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述荧光基团为fam，修饰于探针的5’端。
8.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，使用方法包括以下步骤：
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述off-探针在反应体系中的终浓度为20-50mm。
10.权利要求3-9任一所述的试剂盒在胃癌辅助诊断中的应用。
技术总结
本发明涉及一种双机制荧光体系及其在制备胃癌辅助诊断试剂盒中的应用，属于分析化学领域。本发明提供了一种双机制荧光体系，包括由荧光基团修饰的ON‑探针和OFF‑探针，ON‑探针为单链DNA，特异性识别上调标志物，OFF‑探针为双链DNA，特异性识别下调标志物。ON‑探针吸附于无机纳米材料表面，与上调标志物结合后脱离无机纳米材料表面，荧光增强，OFF‑探针中修饰有荧光基团的单链被下调标志物置换，荧光猝灭。针对胃癌miRNA标志物设计特异性探针，从待测样本中提取总miRNA，与该体系中的探针组合和无机纳米材料共同孵育，检测反应体系的荧光变化，通过K‑means算法对荧光变化结果进行聚类分析，能够辅助判断待测样本是否患有胃癌，具有广阔的应用前景。
技术研发人员：卢沙沙,郭春显,罗超
受保护的技术使用者：苏州科技大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5