基于分子标记技术鉴定调控水稻镉砷积累等位基因ABCC1基因及应用的制作方法
本发明属于水稻诱变育种和基因型检测。本发明具体涉一种鉴定水稻镉砷积累等位基因的特异性分子标记及应用。
背景技术：
1、重金属镉、类金属砷是毒性较强的两种化学元素。然而，由于镉砷在土壤中具有相反的地球化学行为，导致稻米中镉砷浓度呈负相关。目前，大量研究集中在通过改良水分管理、施用土壤改良剂等措施来同步降低籽粒的镉砷含量。
2、农田土壤中镉砷的阻控主要遵循改变镉砷在土壤中的赋存形态，降低其生物有效性；降低镉砷元素在土壤中的浓度或总量等原则。目前适用于大田应用的主要方法包括水分管理、客土法、钝化技术、植物修复技术、叶面阻控技术等。利用不同水分条件下，镉砷对土壤ph和氧化还原电位eh等条件的响应差异，来降低土壤镉和砷的生物有效性，该技术操作简便，成本低廉，但大田中的ph和eh条件不易精准控制，难以同时降低镉砷的生物有效性。采用覆盖表层污染土壤或稀释污染土壤的客土法，能显著降低水稻中镉和砷含量，但该方法生产洁净且类型相似的土源需要培肥，成本高昂。钝化技术通过改变土壤ph值、eh条件和根际微生物反应等条件来改变镉和砷的赋存形态，降低其生物有效性，具有适用于实际大面积污染农田修复的特点。但该技术需要筛选同步钝化剂，新型钝化材料成本相对较高，且存在潜在环境影响。利用蜈蚣草等超(高)累积植物吸取土壤中镉和砷等重金属，能直接减小土壤中镉和砷的含量，被公认为是无二次污染的环境友好型方法，但该方法耗时长，缺乏修复植物的后续处置。因此，在镉砷复合污染农田中，通过大田管理和修复很难实现同时降低水稻籽粒中镉和砷积累的目标。
3、重金属元素低积累水稻品种的选育可有效降低水稻籽粒重金属污染风险，实现重金属污染土地上的水稻安全生产。基于水稻籽粒积累镉砷分子机制的研究基础，陆续有单一的低镉和低砷积累水稻材料被报道。有研究通过crispr/cas9技术敲除osnramp5、oslct1或osccx2，并通过camv 35s启动子过量表达oshma3，培养出了低镉积累的水稻栽培品种；ishikawa和cao等利用化学诱变技术分别创制了粳稻和籼稻低镉积累种质资源。与镉相比，砷低积累水稻育种的报道相对较少。蜈蚣草的pvacr3基因被导入到水稻中异源表达，转基因水稻品种的籽粒中无机砷含量下降26.0～46.0％；包含两种不同液泡隔离基因(scycf1和osabcc1)和细菌γ谷氨酰半胱氨酸合成酶的转基因水稻表现出糙米中砷积累量减少70％。但目前大多品种的筛选培育仅以单一重金属低累积为目标，很难获得镉和砷同时低积累的水稻种质资源，以满足镉砷复合污染地区的种植需求。
技术实现思路
1、为解决上述难题，本发明的目的是提供一种鉴定水稻镉砷积累等位基因的特异性分子标记及应用。该方法具有简便、快速、高通量的特点，为借助分子标记辅助育种技术进行镉砷低积累性状改良提供技术支撑。
2、为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：
3、一种鉴定水稻镉砷积累等位基因的特异性分子标记，以日本晴水稻的基因组为参考基因组，第4号染色体的第31511987的位置，由野生型的c突变为t，该snp分子标记的多态性为c/t；突变体使osabcc1基因的翻译产物在第372-382个氨基酸发生缺失和改变，并在第383个氨基酸处翻译提前终止。
4、一种用于检测所述特异性分子标记的组合引物，包括两条特异性引物序列：hca-f:5’-ctcaagatagccatgggagt-3’，如seq id no.1所示；
5、hca-r:5’-ctgcagtcactgggtgtt-3’，如seq id no.2所示。
6、所述组合引物，利用所述组合引物以水稻基因组进行pcr扩增得到片段长度为201bp，如seq id no.3所示。
7、一种鉴定水稻镉砷积累差异的方法，包括以下步骤：
8、(1)ctab法提取待测水稻基因组dna，并以其为模板，利用权利要求2中所述引物进行pcr扩增反应；
9、(2)检测扩增产物片段的第120bp处碱基的种类，若碱基种类为t，则待测水稻为砷镉高积累水稻，若碱基种类为c，则待测水稻不是镉砷高积累水稻。
10、所述的方法，步骤(1)中pcr扩增反应使用的扩增体系以10μl计为：1μl模板dna，烘干后加入100μm的引物hca-f和引物hca-r各0.5μl，2×mix 5μl,ddh2o 3μl。
11、所述的方法，步骤(1)pcr扩增反应的条件为：95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，循环30次，最后72℃延伸10min，产物4℃低温保存10min。
12、含有所述引物对的辅助鉴定水稻籽粒镉砷积累差异基因osabcc1的试剂盒。
13、含有所述引物对或所述试剂盒在水稻籽粒镉砷积累种质资源改良中的应用。
14、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：(1)本发明利用突变体的镉砷高积累表型鉴定到参与镉砷积累基因osabcc1 atg下游第2261核苷酸序列处snp，设计开发了一种特异性分子标记。(2)利用该分子标记，本发明只需通过简单的pcr和测序即可完成对osabcc1的基因分型，在水稻未结实前同时预测籽粒中镉砷含量差异。(3)检测方法操作简便，鉴定周期短、成本低，可更好地服务水稻镉砷积累差异品种的筛选和改良，为解决同时降低镉砷复合污染农田中水稻籽粒中镉砷含量的难题提供技术支撑。
技术特征：
1.一种鉴定水稻镉砷积累等位基因的特异性分子标记，其特征在于，以日本晴水稻的基因组为参考基因组，第4号染色体的第31511987的位置，由野生型的c突变为t，该snp分子标记的多态性为c/t；突变体使osabcc1基因的翻译产物在第372-382个氨基酸发生缺失和改变，并在第383个氨基酸处翻译提前终止。
2.一种用于检测根据权利要求1所述特异性分子标记的组合引物，其特征在于，包括两条特异性引物序列：
3. 根据权利要求2所述组合引物，其特征在于，利用所述组合引物以水稻基因组进行pcr扩增得到片段长度为201 bp，如seq id no.3所示。
4.一种鉴定水稻镉砷积累差异的方法，其特征在于，包括以下步骤：
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（1）中pcr扩增反应使用的扩增体系以10 μl计为：1 μl模板dna，烘干后加入100 μm的引物hca-f和引物hca-r各0.5 μl，2×mix5 μl, ddh2o 3μl。
6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（1）pcr扩增反应的条件为：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，循环30次，最后72 ℃延伸10min，产物4 ℃低温保存10 min。
7.含有根据权利要求2所述引物对的辅助鉴定水稻籽粒镉砷积累差异基因osabcc1的试剂盒。
8.含有根据权利要求2所述引物对或权利要求7所述试剂盒在水稻籽粒镉砷积累种质资源改良中的应用。
技术总结
本发明提供了一种基于分子标记技术鉴定调控水稻镉砷积累等位基因ABCC1基因及应用。该分子标记以日本晴水稻的基因组为参考基因组，第4号染色体的第31511987的位置，由野生型的C突变为T，该SNP分子标记的多态性为C/T；突变体使OsABCC1基因的翻译产物在第372‑382个氨基酸发生缺失和改变，并在第383个氨基酸处翻译提前终止。本发明还提供了设计的特异性引物对和检测方法。本发明可减少培育镉砷低积累的工作成本和培育周期，具有简便、快速等优点。本发明也可用于高效预测不同水稻品种籽粒的镉砷积累特性和镉砷低积累品种的资源筛选鉴定。
技术研发人员：杨欢,陈铭学,牟仁祥,曹赵云
受保护的技术使用者：中国水稻研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5