一种快速测定魔芋实生种子生活力的方法

本发明涉及植物种子生活力快速测定，具体涉及一种魔芋实生种子生活力的快速测定方法。

背景技术：

1、魔芋是天南星科(araceae)魔芋属(amorphaphallus blume)的特种经济作物，其球茎富含魔芋葡萄糖甘露聚糖(konjac glucomannan，简称kgm)，kgm具有凝胶、增稠、保水等40多项理化性质，广泛应用于休闲食品、保健食品、医药胶囊、民族医药、石油钻探等领域，经济价值极高。目前，魔芋广泛栽培于西南山区。魔芋依赖单一的营养繁殖模式扩繁，造成了软腐病病害严重、种性退化、产量锐降、种植风险激增等问题，有性繁殖的实生种子是克服上述问题新的高效途径。魔芋实生种子具体天然脱毒、多苗接力生长的突出优势，也存在大田生长中苗期过长、出苗不整齐的问题，尤其是由于贮藏不当、催芽不对造成的出苗问题更加突出。魔芋种子的生活力检测是避免上述问题的关键农事操作与核心技术，能广泛应用于预测大田出苗率、评价种子质量、制定魔芋种子市场流通行业标准等领域。

2、现有的种子发芽率测定主要有2类：一是萌发法直接测定种子发芽率。该方法准确、直接，对于水稻、玉米、大豆及常见蔬菜等出苗迅速的种子较实用，但对于含水量高、出苗期长的魔芋实生种子来说试验操作时期长、鉴定结果准确性差。本技术发明人团队多年来实验室鉴定实生种子出苗率的问题有2个：①是实验室萌发率低，且极显著低于真实出苗率。实验室一般只有20—47％的出苗率，而同样的种子大田出苗率通常为79—95％；②萌发周期过长。种子本身高达40％以上的高含水量，极易造成种子萌发时霉变腐烂，从而严重降低鉴定萌发率，同时60天左右的超长出苗期进一步加剧了霉变腐烂的概率。二是染色法测定种子生活力，间接鉴定种子发芽率。一般根据染色原理分为3大类，具体来说有7种方法，一类利用种子正常生理代谢功能的特点,分为ttc(四氮唑法)、h2o2(过氧化氢法、i2-ki(碘一碘化钾法)；二类利用种子萌发时的呼吸情况,分为btb(澳香草酚蓝法),改良石蕊法；三类利用种子细胞是否是活细胞,分为红墨水法和靛蓝法。其中被国际种子检验协会、中国种子检验规程及广大种子领域科研工作者共同认可和推荐的方法是ttc法，ttc法测定结果也是被广为证明与种子发芽率最接近、正相关性最好的方法。

3、ttc法在30多种植物种子中高频报道，其中典型的有粮油作物玉米、水稻、大豆、小麦；蔬菜作物菊芋、肉苁蓉、茄子、任豆；林木作物唐古特白刺、永瓣藤、油桐、南京椴、檀香、工业大麻、麻疯树、豆梨、毛竹、山龙眼、蒲葵；中药材桃儿七、窄叶蓝盆花、北乌头、葛根、菘蓝、多花黄精、白花前胡、榅桲、针茅、女贞子、结缕草等。不同植物种子在形态外观、千粒重大小、种皮透性、种子营养物质化学成分、贮藏期含水量、种子贮藏后生活力、种子萌发特性等方面差异巨大，导致虽然都是用ttc法染色鉴定种子生活力，但是每一种种子的鉴定条件都不一样，公认的是在浸种时间和温度、染色温度和时间、ttc溶液浓度等方面优化，其中浸种时间为40min-48h、浸种温度为20℃-35℃、染色温度为25-55℃(35℃左右最常用)、染色时间为40min-24h、ttc溶液溶度为0.1％-2％(0.5％左右最常用)。2020年，刘二喜等采用四唑法测定花魔芋实生种子生活力。试验条件为：种子经室温纯水浸泡5～6h后，沿种子纵切后均分成2份分别装入小网袋，然后完全浸没于40ml 0.5％四唑溶液中染色时间5h，染色温度25℃、40℃。试验同时发现2个问题：一是魔芋实生种子含有高黏度的魔芋葡甘聚糖植物胶，切开后的种子切面容易互相黏结或切面黏结烧杯的杯底、杯壁，造成ttc染色液无法充分与种子切面接触，导致染色不准确；二是染色后的实生种子，褪色较快，如处理的样品数量偏多，不能及时统计染色数据，容易导致后期的判定不准确。

4、为克服魔芋实生种子直接萌发法鉴定时间长、鉴定出苗率低，而ttc法染色鉴定种子生活力中切面黏结、褪色快，测定方法准确性、重复性差的问题，魔芋实生种子ttc法鉴定生活力的研究与应用必要且迫切。

技术实现思路

1、本发明提供了一种快速测定魔芋实生种子生活力的方法，克服了ttc法染色鉴定种子生活力中切面黏结、褪色快等缺陷。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

2、一种快速测定魔芋实生种子生活力的方法，包括如下步骤：

3、(1)种子含水量检测、浸泡：取魔芋实生种子待测，先检测待测种子的含水量，其中含水量低于35％不进行后续处理，判断生活力几乎为零；

4、具体的，取待测种子总数的20％进行含水量检测，单组种子总数控制在70-1000粒，测得含水量高于35％的，将剩余待测种子用纯水浸泡5-24h，至其达到饱和吸水量；

5、(2)ttc染色：将浸泡后达到饱和吸水量的种子纵向对半切开，切开后的两半种子，每半颗种子利用0.5％无菌ttc溶液在30-40℃恒温避光染色5h，每另外半颗种子作为对照，不做任何处理，拍照时用来做染色前后颜色的对比；

6、(3)染色种子的固定和拍照：立即将染色后种子进行固定处理和拍照；

7、(4)标准比色卡的构建：选择具有典型染色特征的种子构建标准比色卡，比色卡分为3个比色区域；所述典型染色特征是指结构清晰、染色效果明显，如说明书附图图6所示。

8、(5)种子生活力的判定与统计：将染色后的种子与标准比色卡对比，同时将种子分为三类并分别计数；

9、(6)种子生活力的计算：种子生活力＝完全染上色的种子数*100％/种子总数；

10、(7)种子半致死含水量的计算：通过步骤(1)检测得到的种子含水量计算种子平均含水量，与步骤(6)计算得到的种子生活力，根据所述种子平均含水量与种子生活力做散点曲线，利用excel拟合回归方程，计算半致死含水量；

11、进一步地，所述的步骤(1)中种子浸泡的具体时间分为3档：一档为种子含水量56.8-62.2％，浸泡5h；二档为种子含水量46.41-56.7％，浸泡15h；三档为种子含水量35-46.40％，浸泡24h。关于含水量和浸泡时间的分档处理的原因在于，首先，由于魔芋种子收获的时间不一致，自然风干贮藏时间也有差异，导致种子播种前或测定生活力前的含水量不一样：

12、同时通过发明人长期的研究实践发现，对于魔芋类实生种子来说，不同含水量的种子，其吸水量、吸水速度均差异较大，达到接近饱和吸水量的时间差异较大；具体来说有3个特征：一是含水量越低的种子，其吸水量越大，接近或达到饱和吸水量所需时间越长；二是含水量为59.4％的种子在5h内吸水较快，含水量为56.8％的种子在5h内吸水较快；三是含水量为48.9％的种子在10-20h内接近饱和吸水量，期间的吸水速度较慢；四是含水量为42.7％的种子在20h-25h期间吸水量仍然在增长，通过种子测定的效率和种皮溶胀的具体情况，24h的吸水处理时间合适。吸水曲线图见说明书附图图1。

13、进一步地，所述的步骤(2)中ttc染色的具体方法为：切半的种子每1～2h搅拌一次，防止由于切面粘连或切面紧贴烧杯的杯底、杯壁，造成ttc染色液无法充分与种子切面接触，导致染色不准确。

14、进一步地，所述的步骤(3)中染色后的种子固定和拍照，其中种子固定方法采取以下3种中的一种：一是将染色后的种子切面朝上依照颜色深浅依次垂直压入细河沙，切面露出河沙1-3mm；二是在a4打印纸上用双面胶制造等距的水平条20-40条，水平条间距为0-0.5cm，然后将染色后的种子切面朝上依照颜色深浅依次粘贴在双面胶上；三是将黑色黏土(也可用面粉+黑色墨水制作替代)用擀面杖擀平，然后将染色后的种子切面朝上依照颜色深浅依次按压入其中；由于切半种子的形状不规则，拍照时切面无法保持在同一平面，会影响染色结果的正确记录，故采取了上述的切半种子固定方法，同时为了避免快速褪色，本步骤总的处理时间控制在0.5-2h。

15、进一步地，所述的步骤(4)标准比色卡的构建，第1区域：种子完全染上色，且颜色较红，种子生活力强；第2区域：种子部分染上色，且颜色较浅，种子生活力弱；第3区域：种子完全染不上色，种子生活力无。

16、进一步地，所述的步骤(7)半致死含水量的计算：将步骤(1)每种处理的种子设置至少3组重复，根据所述种子平均含水量与种子生活力做散点曲线，利用excel拟合回归方程，以种子平均含水量为x轴，以种子生活力为y轴，当y值为0.5时，代入所得到的方程，计算出的x值即为半致死含水量。

17、本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：

18、本发明提供了一种快速测定魔芋实生种子生活力的方法，包括了3个关键技术：首先，利用种子本身含水量分档确定浸种时间；其次，染色中增加搅拌操作，防止种子切面黏结影响测定准确性；最后，在染色充分的前提下，配合特有的固定和拍照方式迅速固化染色得到的颜色，防止快速褪色影响数据的统计。本发明采用种子含水量检测、浸泡→ttc染色→种子的拍照→标准比色卡的构建→种子生活力的判定与统计→种子生活力的计算的6步操作法，不仅提高了鉴定种子生活力的效率，而且提高了鉴定的准确性和重复性，更系统构建了标准化、流程化、数据化、可视化的魔芋实生种子生活力ttc鉴定法。本发明成功实现了魔芋实生种子生活力的快速测定方法，替换了魔芋实生种子直接萌发法的低效率、低发芽率的操作方式，将测定时间由60天缩短到2-3天完成，提高效率20-30倍，同时也克服了ttc法染色鉴定种子生活力中切面黏结、褪色快，测定方法准确性、重复性差的缺陷，本发明可带来魔芋实生种子生活力鉴定的变革性进步。具体而言，本发明具有如下优点：

19、1)根据种子本身含水量分档确定浸种时间。已有文献中，不同植物种子，浸种时间均不同，通常含水量低、种皮厚实紧致的种子浸种时间长一些，同一类种子，浸种时间通常为恒定值。但本技术明人在长期的实践过程中发现，对于魔芋类实生种子来说，不同含水量的种子，其吸水量、吸水速度均差异较大，由此，本发明的技术方案设置了分类分档的浸种时间，提高试验效率、试验准确性。本发明将种子浸泡的具体时间分为3档：一档为种子含水量56.8-62.2％，浸泡5h；二档为种子含水量46.41-56.7％，浸泡15h；三档为种子含水量35-46.40％，浸泡24h。另外，检测出种子含水量低于35％的，其种子生活力或田间萌发率均极低，没有鉴定的实际价值了，故含水量低于35％的种子在本技术方案中被直接判定为生活力极低，不参与检测含水量后续的处理，也不再进行生活力计算。

20、2)染色中增加搅拌操作，防止种子切面黏结影响测定准确性。现有文献中公开报道的其他类植物种子，染色过程中均没有搅拌的操作，但是魔芋实生种子含有高黏度的魔芋葡甘聚糖植物胶，切开后的种子切面容易互相黏结或切面黏结烧杯的杯底、杯壁，造成ttc染色液无法充分与种子切面接触，导致染色不准确。染色过程中采用搅拌的操作，可以分离种子与种子的黏结，也可以很好的分离种子切面贴合烧杯杯底、杯壁的种子。确保染色液充分与种子切面接触、染色、渗透，提高染色的准确性。

21、3)利用特有的固定方式配合拍照固化染色后的颜色，防止快速褪色影响数据的统计。ttc染色后，其切面的红色容易褪色，影响种子生活力的判定分类，从而影响实验的准确性和重复性。利用本技术特别设置的固定方式配合拍照，不仅可以固化染色后的颜色，同时，可以提高拍照的真实性，更加可以建立标准化的种子生活力判定标准比色卡，利于种子类相关生活力鉴定的研究者参考。

技术特征：

1.一种快速测定魔芋实生种子生活力的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种快速测定魔芋实生种子生活力的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中种子浸泡时间分为3档：种子含水量56.8-62.2％，浸泡5h；种子含水量46.41-56.7％，浸泡15h；种子含水量35-46.40％，浸泡24h。

3.根据权利要求1所述的一种快速测定魔芋实生种子生活力的方法，其特征在于，步骤(2)中ttc染色时，切半的种子每1～2h搅拌一次。

4.根据权利要求1所述的一种快速测定魔芋实生种子生活力的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中种子固定采取以下方式：将步骤(2)得到的染色后种子切面朝上，依照颜色深浅依次垂直压入细河沙，切面露出河沙1-3mm。

5.根据权利要求1所述的一种快速测定魔芋实生种子生活力的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中种子固定采取以下方式：在打印纸上用双面胶制造等距的水平条20-40条，水平条间距为0-0.5cm，将步骤(2)得到的染色后种子切面朝上依照颜色深浅依次粘贴在双面胶上。

6.根据权利要求1所述的一种快速测定魔芋实生种子生活力的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中种子固定采取以下方式：将黑色黏土或者面粉混合黑色墨水，用擀面杖擀平，将步骤(2)得到的染色后种子切面朝上依照颜色深浅依次按压入其中。

7.根据权利要求1所述的一种快速测定魔芋实生种子生活力的方法，其特征在于，所述的步骤(4)标准比色卡的构建方法为：第1区域：种子完全染上色，且颜色较红，种子生活力强；第2区域：种子部分染上色，且颜色较浅，种子生活力弱；第3区域：种子完全染不上色，种子生活力无。

8.根据权利要求1所述的一种快速测定魔芋实生种子生活力的方法，其特征在于，所述的步骤(7)半致死含水量的计算：将步骤(1)每种处理的种子设置至少三组重复，根据所述种子平均含水量与种子生活力做散点曲线，利用excel拟合回归方程计算半致死含水量。

技术总结
本发明涉及植物种子生活力快速测定技术领域，具体公开了一种快速测定魔芋实生种子生活力的方法，包括以下步骤：(1)种子含水量检测、分档浸泡；(2)TTC避光染色；(3)种子固定处理后拍照；(4)标准比色卡的构建：选择具有典型染色特征的种子构建标准比色卡；(5)种子生活力的判定与统计：与标准比色卡对比分为三类并分别计数；(6)种子生活力计算：种子生活力＝完全染上色的种子数*100％/种子总数；(7)半致死含水量的计算。本发明成功实现了魔芋实生种子生活力的快速测定，做到了“两提高一标准”，具体来说就是提高了测定的准确性和重复性、提高了测定的时效，最后是做到了种子染色生活力判定的标准化。

技术研发人员：刘二喜,向一兵,左帮烈,谭澍,王林,马作江,朱永要,万朝翰,张佳,郭敬元
受保护的技术使用者：恩施土家族苗族自治州农业科学院（硒应用技术与产品开发研究院）
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5