一种简单高效的DNA-蛋白质定向偶联模型的构建方法
本发明属于化学生物学和药物化学领域，具体涉及一种简单高效的dna-蛋白质定向偶联模型的构建方法。
背景技术：
1、dna损伤与疾病有着密切的关系。dna双螺旋结构中的杂环碱基序列构成了驱动所有生物体运作的遗传密码，编码序列的正确性和稳定性对于细胞中功能性mrna和蛋白质的表达是至关重要的。而细胞会受到多种环境因素的影响，各种内源性和外源性的威胁对细胞中dna造成不可逆转的损伤，进而导致癌症、神经退行性疾病和自身免疫疾病等疾病的发生。
2、dna-蛋白质的共价偶联产物(dna-protein cross-links,dpcs)是一类结构复杂且特殊的dna损伤，具有高度异质性，不同类型的dpc根据dna的结构，蛋白质的种类以及化学结合的方式不同而各有所异。
3、在染色质结构中，拥有约145个碱基对的dna缠绕在由组蛋白h2a、h2b、h3和h4组成的八聚体上，形成核小体。组蛋白n端尾部具有大量赖氨酸，易与多种内源性含醛基的dna结构发生反应，形成水解可逆但半衰期相对较长的schiff碱型dna-组蛋白共价偶联体(dhcs)。目前，对于dna与蛋白质偶联损伤的修复机制研究还不是非常充分。损伤模型的设计构建与表征，是相关类型dpc修复机制研究中的必要环节。因此，构建多样化的体外研究模型，提高表征方法的准确性是dna损伤修复研究中亟待解决的关键问题。
4、目前在体外获得dhc的方式主要有两种：(1)使用还原试剂(如nabh4、nabh3cn等)将c＝n键还原为c-n键，从而形成稳定的dhc，但是该策略不仅需要使用管制类还原剂，且缺乏位点选择性，所得到的产品往往是混合物，在具有位点特异性的研究中不适用；(2)使用tretyakova等人开发的肟化偶联方法，此方法通过快速的生物正交方式来制备水解稳定、结构上与内源性dhc类似且具有位点选择性的5fc-h3 dhc。肟化偶联利用羰基化合物与氨氧化物反应，形成稳定的r-c＝n-o-r键，从而避免了席夫碱的水解稳定性问题。然而，该方法需要多步化学合成和固相肽合成，过程复杂且耗时，并且sortase介导的连接需要一个保守的lpxtg基序，限制了其在其他组蛋白中的应用(s.s.pujari,m.wu,j.thomforde,z.a.wang,c.chao,n.m.olson,l.erber,w.c.k.pomerantz,p.cole and n.y.tretyakova,angew chem int ed engl,2021,60,26489-26494.；s.s.pujari,y.zhang,s.ji,m.d.distefano and n.y.tretyakova,chem commun(camb),2018,54,6296-6299.)。
技术实现思路
1、本发明旨在提供一种体外构建具有位点特异性dna-蛋白质偶联模型的方法，本发明利用可见光催化策略，对蛋白质的目标位点进行赖氨酸结构类似物的定向功能化，实现了蛋白质与dna在生理条件下的定向共价偶联。
2、本发明具体采用以下技术方案：
3、本发明提供了一种简单高效的dna-蛋白质定向偶联模型的构建方法，包括：
4、步骤1：将赖氨酸衍生物定向安装到野生型蛋白质突变得到的半胱氨酸位点上；
5、所述野生型蛋白质的赖氨酸残基会与dna形成水解可逆但是半衰期较长的席夫碱型dna-蛋白质共价偶联(dpc)产物，造成dna损伤。若所述野生型蛋白质中不含有半胱氨酸(或半胱氨酸发生突变后不影响该野生蛋白质功能)，但是含有赖氨酸，则可以采用本发明方法，将该野生型蛋白质中目标位点的赖氨酸突变为半胱氨酸，然后将赖氨酸衍生物定向安装到突变获得的半胱氨酸位点上，赖氨酸衍生物则会与dna形成水解稳定的内源性dpc结构类似物。
6、在进一步的方案中，所述野生型蛋白质为组蛋白h4。
7、步骤1具体包括以下内容：
8、步骤1.1：将野生型蛋白质突变后的半胱氨酸侧链基团-ch2-ch2-sh还原、转化为-ch＝ch2；具体的，可采用二硫苏糖醇(dtt)和2,5-二溴己二酰胺(dbhda)分别对野生型蛋白质突变后的半胱氨酸的侧链基团-ch2-ch2-sh进行还原和转化。采用dtt进行还原时，dtt用量为100当量，在室温下振荡反应4小时。采用dbhda进行转化时，dbhda用量为100当量，37℃振荡反应4小时。
9、步骤1.2：将bpin(化合物1)、邻苯二酚与步骤1.1的产物在ru(bpm)3cl2催化剂的作用下进行可见光催化反应，对残基中的-ch＝ch2结构进行-oxyk-boc功能化，所述-oxyk-boc结构为-ch2-ch2-ch2-ch2-o-nh-boc；催化反应中，bpin、邻苯二酚、ru(bpm)3cl2的用量分别为1000当量、100当量、10当量，在ph7.5的反应体系中，于4℃下催化反应40分钟。
10、所述bpin采用以下方法合成：向羟基氨基甲酸叔丁酯的二氯甲烷溶液中加入2-(3-溴丙基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷和叔丁醇钾，在室温条件下搅拌过夜，即得；反应中，羟基氨基甲酸叔丁酯与2-(3-溴丙基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷和叔丁醇钾的摩尔比为75:83:225。
11、步骤1.3：将步骤1.2中的产物分别与三氟乙酸(tfa)和hcl反应，以去除-boc；具体的，将步骤1.2中的产物溶于50％的tfa水溶液中，最终浓度为1mg/ml，反应在惰性气体保护下于室温进行2小时。然后向反应体系中加入hcl，并在惰性气体保护下振荡1小时。
12、步骤2：将寡核苷酸与步骤1的产物通过肟化偶联反应获得dna-蛋白质共价偶联产物。
13、步骤2具体包括：
14、将3′端带有磷酸-α,β-不饱和醛(pua)基团的寡核苷酸与步骤1的产物在37℃下孵育20小时，即得到dna-蛋白质共价偶联产物。3′端带有pua基团的寡核苷酸与步骤1的产物的摩尔比为1:2。
15、本发明的有益效果为：
16、1、高效性和简便性：本发明利用可见光催化策略，将oxyk定向安装到蛋白质的特定位点上，再通过肟化偶联反应获得水解稳定的dpc产物，并通过lc-ms/ms和体外酶修复试验验证其位点特异性和结构完整性。如图1所示。本发明实现了在温和条件下对蛋白质进行位点选择性的赖氨酸衍生物化学修饰，构建了一个dna与蛋白质定向偶联、水解稳定且与内源性dpc化学结构高度类似的体外研究模型。该方法步骤简单、反应快速，有助于提高实验效率，减少对实验设备和操作的要求。
17、2、广泛适用性：本发明方法不依赖于特定的酶切位点，适用于所有不含有半胱氨酸(或半胱氨酸被突变后不影响蛋白质功能)、含有赖氨酸的蛋白质。传统方法通常需要特定的基序或多步化学合成，而本发明的方法具有更广泛的适用性，能够适应不同蛋白质的研究需求。
18、3、稳定性和可靠性：通过肟化反应形成的dna-蛋白质共价偶联结构(dhc)具有高度的水解稳定性，确保了在体外研究中的稳定性和可靠性。这种稳定的偶联结构有助于进一步的生化效应和修复机制研究，提高了实验结果的重现性和可信度。
19、4、研究价值：本发明提供了一种高效构建位点特异性dhc模型的方法，为dna损伤修复机制的研究提供了重要工具。通过该方法制备的dhc模型，能够更好地模拟内源性的dna-蛋白质偶联损伤，帮助科学家深入了解dpcs在dna损伤修复中的作用和机制。
20、5、其他应用：该策略在生物技术和药物开发领域具有潜在的应用价值。通过对蛋白质进行特定位点的化学修饰，可以开发出新的生物标志物和药物靶点，推动dna损伤修复相关疾病的诊断和治疗研究。
技术特征：
1.一种简单高效的dna-蛋白质定向偶联模型的构建方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的一种简单高效的dna-蛋白质定向偶联模型的构建方法，其特征在于，步骤1具体包括以下内容：
3.根据权利要求2所述的一种简单高效的dna-蛋白质定向偶联模型的构建方法，其特征在于，步骤1.1中，采用二硫苏糖醇和2,5-二溴己二酰胺分别对野生型蛋白质突变后的半胱氨酸的侧链基团-ch2-ch2-sh进行还原和转化。
4.根据权利要求3所述的一种简单高效的dna-蛋白质定向偶联模型的构建方法，其特征在于，采用二硫苏糖醇进行还原时，二硫苏糖醇用量为100当量，在室温下振荡反应4小时；采用2,5-二溴己二酰胺进行转化时，2,5-二溴己二酰胺用量为100当量，37℃振荡反应4小时。
5.根据权利要求2所述的一种简单高效的dna-蛋白质定向偶联模型的构建方法，其特征在于，步骤1.2的催化反应中，bpin、邻苯二酚、ru(bpm)3 cl2的用量分别为1000 当量、100当量、10 当量，在ph7.5的反应体系中，于4℃下催化反应40分钟。
6.根据权利要求2所述的一种简单高效的dna-蛋白质定向偶联模型的构建方法，其特征在于，在步骤1.2的bpin的合成中，羟基氨基甲酸叔丁酯与2-(3-溴丙基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷和叔丁醇钾的摩尔比为75:83:225。
7.根据权利要求2所述的一种简单高效的dna-蛋白质定向偶联模型的构建方法，其特征在于，步骤1.3具体为：
8.根据权利要求1所述的一种简单高效的dna-蛋白质定向偶联模型的构建方法，其特征在于，步骤2具体包括：
9.根据权利要求8所述的一种简单高效的dna-蛋白质定向偶联模型的构建方法，其特征在于，3′端带有磷酸-α,β-不饱和醛基团的寡核苷酸与步骤1的产物的摩尔比为1:2。
10.根据权利要求1所述的一种简单高效的dna-蛋白质定向偶联模型的构建方法，其特征在于，所述野生型蛋白质为组蛋白h4。
技术总结
本发明属于化学生物学和药物化学领域，涉及一种简单高效的DNA‑蛋白质定向偶联模型的构建方法。包括：步骤1：将赖氨酸结构类似物定向安装到野生型蛋白质突变得到的半胱氨酸位点上；该野生型蛋白质不含有半胱氨酸或其突变不影响功能，并含有可与DNA形成水解可逆席夫碱型DNA‑蛋白质共价偶联（DPC）的赖氨酸残基；所述半胱氨酸由赖氨酸突变获得。步骤2：将寡核苷酸与步骤1产物通过肟化偶联得到内源性DPC结构类似物。本发明在温和条件下实现了蛋白质的位点选择性赖氨酸结构类似物功能化，构建了水解稳定且与内源性DPC化学结构高度类似的定向偶联模型。该方法步骤简单、反应快速，有助于提高实验效率，减少对实验设备和操作的要求。
技术研发人员：刘阳雪,杨昆,彭莹,王之朔,魏晓滢,陈俊阳,张守涛
受保护的技术使用者：郑州大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5