一种可控释放硫化氢及一氧化碳的荧光供体的制备及应用
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种可控释放硫化氢及一氧化碳的荧光供体的制备及应用。
背景技术：
1、硫化氢(h2s)和一氧化碳(co)是气体治疗的重要气体信号分子，这两种气体信号分子在人体内有重要的生理作用，与许多疾病息息相关，它们在哺乳动物细胞中由酶催化合成产生，是具有独特信号响应的内源性气体信号分子，广泛参与生物体内各种生理病理活动的调节。
2、内源性h2s在心血管系统中，具有舒张血管平滑肌、降低血压、促进血管平滑肌细胞的凋亡、抑制血管平滑肌细胞(vsmcs)增殖等多种生物学效应。h2s也可抑制肺动脉平滑肌细胞增殖，参与维持肺血管正常结构，对于肺循环的结构和功能具有重要的调节作用；增加抗氧化剂谷胱甘肽水平、抑制和清除神经系统内的多种氧化性物质等，具有广泛的生理作用。
3、co在心血管系统中，可导致颈动脉、股动脉和冠状动脉等的平滑肌舒张，还可调节阻力血管口径。此外，co在参与对中枢心血管活动的调节中，能加强减压反射，使血压下降、心率减慢；在中枢神经系统的许多生理和病理过程中，co是公认的神经信使。其来源并不仅仅局限于血液循环，外周神经组织产生的血红素亚单位亦可到达并通过血脑屏障进入脑内，在局部ho的作用下产生co。co的神经信使作用不仅涉及包括学习和记忆过程、脊髓神经痛觉传递、嗅觉受体神经的发育及其功能、颈动脉化学感受活性的调节和自主神经加压调节的抑制等机制，还涉及括约肌松弛、激素释放等过程。
4、由于h2s与co这两种气体都有在心血管方面的作用，因此研究两种气体在疾病中的协同作用，对疾病的发生、预防、治疗都具有十分重要的意义。气体信号分子在生物研究甚至疾病治疗中无法直接使用。为了研究h2s与co在人体内的气体治疗作用，需要气体分子供体作为研究基础，在生物体系内原位释放相关气体。为了研究h2s与co在人体内的气体治疗作用，需要气体分子供体作为研究基础，目前已报道的h2s供体和co供体，如：硫化氢供体gyy 4137、adt-oh；一氧化碳供体corms等，都是单气体分子供体，在实际的生物过程中，往往会有多种气体共同作用，因此单一供体难以满足研究、治疗需要；目前，市售的供体大多数为自发性供体，缺乏有效地控制，而在研究领域中所开发出一些可控释放气体信号分子的供体，在实际应用上还需要使用其他分析手段对气体进行分析，如紫外法、esr法等，这些分析方法都会造成生物样本的破坏。
5、针对目前所出现的技术问题，急切需要开发一种新型的双气体分子供体，可以同时或分别可控释放h2s和co，同时在实际使用过程中可有效地对产生的气体信号进行检测，并不会对生物样本产生破坏。
技术实现思路
1、本发明目的在于提供一种制备方法简单的可控释放硫化氢及一氧化碳的双气体供体，该供体能在生物体系内可控释放两种气体并给出荧光信号进行实时监控，无需破坏生物样品，能够成为一种有力的分子工具。本发明的目的通过以下技术方案实现：
2、一种可控释放硫化氢及一氧化碳的荧光供体的制备方法，包括以下步骤：
3、s1.将天然产物黄酮醇(cod)溶于15ml干燥的四氢呋喃中，得到含有cod的四氢呋喃混合液1；
4、s2.将步骤s1所述的混合液1在0℃下剧烈搅拌，并缓慢加入15ml含有硫光气的二氯甲烷混合溶液，并在冰浴下持续搅拌反应1h；待混合液温度恢复到室温后，继续搅拌反应2h，得到混合液2；
5、s3.将步骤s2中所述的混合液2重新置于0℃的冰浴中，加入苯基格氏试剂进行反应，反应液温度逐渐恢复至室温后，利用tlc监控反应的终点；
6、s4.待步骤s3所述反应液反应完成后，加入过量饱和氯化铵溶液淬灭格氏试剂，利用二氯甲烷萃取反应液三次，取有机相合并，旋干，得到固体混合物；
7、s5.将步骤s4所得到的固体混合物利用柱层析法进行分离和提纯，最终得到得到黄色荧光供体。
8、进一步地，步骤s1中所述的天然产物黄酮醇(cod)的添加量为300mg。
9、进一步地，步骤s2中所述的含有硫光气的二氯甲烷混合溶液中硫光气的添加量为180mg。
10、进一步地，步骤s3中所述的苯基格氏试剂为3-甲氧基苯基溴化镁，溴化3,4-(甲二氧基)苯基镁，4-氟苯基溴化镁中的一种。
11、进一步地，步骤s3中所述的苯基格氏试剂的添加量为为3～5倍当量。
12、进一步地，步骤s3中所述的利用tlc监控反应的终点的方法为取适量反应液，加入水将反应进行淬灭，取混合液点至tlc板，吹风筒吹干溶剂，利用展开剂为二氯甲烷和甲醇混合液，二氯甲烷：甲醇为20：1进行展开，观察到cod的点消失，反应出现的新点不在增加。
13、进一步地，步骤s4中所述的柱层析法进行分离和提纯的条件为利用400目硅胶，分离相为二氯甲烷和甲醇混合液，二氯甲烷：甲醇＝30：1，加压过柱。
14、进一步地，该供体可控释放两种气体信号分子并给出荧光信号变化，用于实时监控气体的释放：在半胱氨酸存在下，释放硫化氢，并产生红色的增强型荧光；随后在蓝光照射下，释放一氧化碳，红色荧光信号逐渐减弱。
15、本发明的另一目的在于提供一种可控释放硫化氢及一氧化碳的荧光供体在生物样本检测中的应用。
16、结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：
17、(1)本申请通过一锅法合成可控释放硫化氢及一氧化碳的荧光供体，反应简单、经济，有利于大规模推广和应用。
18、(2)合成的化合物hsco作为硫化氢与一氧化碳的双气体分子供体本身无荧光信号，加入半胱氨酸反应后可释放出h2s并生成化合物cod，该化合物cod可在溶液中生成具有荧光信号的产物，因此通过检测溶液中化合物cod的荧光信号强度的增强，即可判断出h2s的生成量；化合物cod作为一氧化碳的气体分子供体本身具有荧光信号，经过一定波长的光照射后可释放出co，因此，通过检测溶液中化合物cod的荧光信号强度的减弱，即可判断出co的生成量。
19、(3)由于该双气体分子供体hsco在体内与在半胱氨酸的存在下先释放出硫化氢，同时生成cod，并在410nm波长的光照射下后释放出一氧化碳。在同时存在半胱氨酸和光照的条件下，也能同时释放h2s和co。通过用h2s荧光探针与co荧光探针测定反应产物，可证明供体hsco释放出了h2s和co，与现有的h2s供体和co供体相比，双气体分子供体hsco可由一个分子结构同时释放h2s和co，并且可通过检测cod的荧光信号强度来判断h2s和co的释放过程，实现了该双气体分子供体的可视并且可控释放。因此供体能在生物体系内可控释放两种气体并给出荧光信号进行实时监控，无需破坏生物样品，能够成为一种有力的分子工具。
技术特征：
1.一种可控释放硫化氢及一氧化碳的荧光供体的制备方法，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种可控释放硫化氢及一氧化碳的荧光供体的制备方法，其特征在于：步骤s1中所述的天然产物黄酮醇(cod)的添加量为300mg。
3.根据权利要求1所述的一种可控释放硫化氢及一氧化碳的荧光供体的制备方法，其特征在于：步骤s2中所述的含有硫光气的二氯甲烷混合溶液中硫光气的添加量为180mg。
4.根据权利要求1所述的一种可控释放硫化氢及一氧化碳的荧光供体的制备方法，其特征在于：步骤s3中所述的苯基格氏试剂为3-甲氧基苯基溴化镁，溴化3,4-(甲二氧基)苯基镁，4-氟苯基溴化镁中的一种。
5.根据权利要求1所述的一种可控释放硫化氢及一氧化碳的荧光供体的制备方法，其特征在于：步骤s3中所述的苯基格氏试剂的添加量为3～5倍当量。
6.根据权利要求1所述的一种可控释放硫化氢及一氧化碳的荧光供体的制备方法，其特征在于：步骤s3中所述的利用tlc监控反应的终点的方法为取适量反应液，加入水将反应进行淬灭，取混合液点至tlc板，吹风筒吹干溶剂，利用展开剂为二氯甲烷和甲醇混合液，二氯甲烷：甲醇为20：1进行展开，观察到cod的点消失，反应出现的新点不在增加。
7.根据权利要求1所述的一种可控释放硫化氢及一氧化碳的荧光供体的制备方法，其特征在于：步骤s4中所述的柱层析法进行分离和提纯的条件为利用400目硅胶，分离相为二氯甲烷和甲醇混合液，二氯甲烷：甲醇＝30：1，加压过柱。
8.根据权利要求1～7所述的方法制备的一种可控释放硫化氢及一氧化碳的荧光供体，其特征在于：该供体可控释放两种气体信号分子并给出荧光信号变化，用于实时监控气体的释放：在半胱氨酸存在下，释放硫化氢，并产生红色的增强型荧光；随后在蓝光照射下，释放一氧化碳，红色荧光信号逐渐减弱。
9.一种权利要求8所述的一种可控释放硫化氢及一氧化碳的荧光供体在生物样本检测中的应用。
技术总结
本发明公开了一种可控释放硫化氢及一氧化碳的荧光供体的制备及应用，将化合物COD溶于干燥的THF中，缓慢加入含有硫光气的DCM溶液,并剧烈搅拌反应，将反应液至于冰浴当中，加入苯基格氏试剂,冰浴下反应1小时，反应逐渐恢复至室温后，利用TLC监控反应终点，反应结束后加入过量饱和氯化铵溶液淬灭格氏试剂，利用DCM萃取反应液三次，取有机相合并，旋干，利用柱层析法得到黄色固体HSCO。本申请用简易的方法获得一种双气体供体，并且该供体能在生物体系内可控释放两种气体并给出荧光信号进行实时监控，无需破坏生物样品，能够成为一种有力的分子工具。
技术研发人员：张子谦,李力,林珍梅
受保护的技术使用者：广西中医药大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5