一种骨类器官及其构建方法与用途
本发明属于生物医学工程，涉及一种骨类器官及其构建方法与用途。
背景技术：
1、口腔颅颌面部及全身其他部位骨缺损病因多样，发病率高，形态复杂，骨再生难度大，严重影响患者的容貌、咀嚼、发音以及运动等功能，导致患者生活质量与身心健康深受损害。目前，对于小范围骨缺损可通过填充人工骨粉等材料可实现修复。而对于较大范围骨缺损，目前治疗的方法包括自体骨移植、同种异体移植和合成骨替代物，但这些方法都有局限性，自体骨移植供区损伤、创伤大；同种异体移植和合成骨替代物存在免疫原性、感染、整合不良和血管化不足等问题。
2、类器官是基于细胞的简单的组织工程体外模型，是细胞通过自我更新及自组织或在生物材料诱导下组织而形成的具有仿生空间特征的三维培养物，能够模拟或部分模拟体内组织器官的细胞类型、结构及功能。目前类器官在组织发育、疾病发生发展机制、药物筛选以及组织工程的研究中发挥出至关重要的作用。因此，基于骨类器官构建的工程化组织，能够为骨组织再生修复提供新途径，同时还可以作为研究骨组织发育的模型、药物筛选模型。
3、然而在骨类器官技术中，尽管研究者们对骨类器官的构建和应用付出了诸多努力，但构建骨类器官耗时长，仍存在缺乏对细胞命运的调控，促成骨效果不佳，且细胞组成单一，与天然骨差异明显等局限性。例如专利申请“一种基于类骨器官的3d生物打印类骨组织工程支架”(申请号：cn202210911808.x)构建了包括壳体、外侧仿生骨膜和内部微球填充的骨类器官，在静态环境下模拟骨组织的宏观结构，但并没有模拟骨组织形成过程中所不可缺少的动态力学微环境，缺乏对细胞命运的调控。又如专利申请“一种骨骼类器官的构建系统及其使用方法”(申请号：cn202311219797.x)选择包括骨髓基质细胞、骨祖细胞、前成骨细胞、成骨细胞、骨衬细胞、骨细胞或破骨细胞等至少一种细胞或多种细胞用于构建骨类器官。又如文献“developmentally engineered callus organoid bioassembliesexhibit predictive in vivo long bone healing”(doi编号:10.1002/advs.201902295；pmid编号:31993293)中选择以单一骨膜来源的干细胞构建骨类器官，然而这些细胞多是成骨向细胞，缺乏骨免疫稳态、骨修复再生中起关键作用的巨噬细胞等免疫细胞。
技术实现思路
1、本发明的首要目的是提供一种骨类器官，以能够快速构建获得，与天然骨差异小，能够对细胞命运进行调控，并能够更好地促成骨和促进骨修复。
2、为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供一种骨类器官，所述的骨类器官由细胞混合物经过三维培养获得，所述的细胞混合物包含干细胞和巨噬细胞。
3、在一种优选的实施方案中，本发明提供一种骨类器官，其中所述的干细胞选自脐带血间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、多潜能诱导干细胞中的一种或者多种。
4、在一种优选的实施方案中，本发明提供一种骨类器官，其中所述的巨噬细胞为骨髓来源的巨噬细胞和/或外周血来源的巨噬细胞。
5、在一种优选的实施方案中，本发明提供一种骨类器官，其中所述的干细胞与所述的巨噬细胞的数量比为(2-3):1。
6、在一种优选的实施方案中，本发明提供一种骨类器官，其中所述的细胞混合物还包含水凝胶基质材料。
7、在一种优选的实施方案中，本发明提供一种骨类器官，其中所述的水凝胶基质材料选自甲基丙烯酰化明胶、透明质酸、海藻酸钠、丝素蛋白、羧甲基壳聚糖、硫酸软骨素、胶原中的一种或多种。
8、在一种优选的实施方案中，本发明提供一种骨类器官，其中全部细胞在所述的水凝胶基质材料中形成的密度为(1-5)×106个/ml。
9、本发明的第二个目的是提供一种如上所述的骨类器官的构建方法，以能够快速制备如上所述的骨类器官，制得骨类器官与天然骨差异小，能够对细胞命运进行调控，并能够更好地促成骨和促进骨修复。
10、为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供一种如上所述的骨类器官的构建方法，所述的构建方法包括如下步骤：
11、(1)在三维培养反应器中均匀混合所述的细胞混合物中的各材料；
12、(2)使所述的水凝胶基质材料固化；
13、(3)进行细胞培养，以得到所述的骨类器官。
14、在一种优选的实施方案中，本发明提供一种如上所述的骨类器官的构建方法，其中步骤(1)中，所述的三维培养反应器为基于动态拉应力的三维培养反应器。
15、所谓三维培养，是一种细胞在三维空间中生长、增殖和迁移的技术，细胞被包裹在具有三维结构的基质中，或是人工合成的支架材料上。相比传统的二维细胞培养，三维细胞培养更接近体内细胞在生理环境中的生长状态，包括细胞之间的相互作用、信号传导以及细胞外基质的响应。因此，三维培养更能够模拟组织和器官的生物学特性，为生物医学研究、药物开发和组织工程等领域提供更多可能性。关于三维培养的详细介绍，可参见文献：functional and biomimetic materials for engineering of the three-dimensionalcell microenvironment(doi编号:10.1021/acs.chemrev.7b00094)。
16、动态拉应力三维培养，其不同于以往静态环境下的三维培养，而是一种基于动态环境下的三维培养方式，其通过整个三维培养体系与腔室的结合，借助动态拉应力设备(例如cell tank设备)对腔室的动态牵张，带动整个三维培养体系的动态牵张，使发生牵张形变的同时产生动态拉应力，培养中的细胞也因此处在动态拉应力的环境中。
17、在一种优选的实施方案中，本发明提供一种如上所述的骨类器官的构建方法，其中所述的基于动态拉应力的三维培养反应器在加入所述的细胞混合物前先后经过等离子体喷涂处理去除内表面杂质，和内表面涂覆多聚赖氨酸以提高内表面的亲水性和黏附性的处理。
18、在一种优选的实施方案中，本发明提供一种如上所述的骨类器官的构建方法，其中步骤(2)中，所述的固化为光固化，光固化的波长为400-420nm，光固化的时间为30-60s。
19、在一种优选的实施方案中，本发明提供一种如上所述的骨类器官的构建方法，其中步骤(3)中，进行细胞培养时，动态拉应力的频率为0.5-0.8hz，时间为2-3h/天，比例为8-10％。
20、本发明的第三个目的是提供如上所述的骨类器官用于制备骨修复材料或体外研究模型的用途，以能够更好地促成骨和促进骨修复。
21、为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供如上所述的骨类器官用于制备骨修复材料或体外研究模型的用途。
22、在一种优选的实施方案中，本发明提供如上所述的骨类器官用于制备骨修复材料或体外研究模型的用途，其中所述的骨修复材料用于治疗骨缺损或骨质疏松，所述的体外研究模型用于组织发育研究或药物筛选研究。
23、本发明的有益效果在于，利用本发明的骨类器官及其构建方法，能够快速制备骨类器官，制得骨类器官与天然骨差异小，能够对细胞命运进行调控，并能够更好地促成骨和促进骨修复。
24、目前构建骨类器官多采用单一成骨向细胞，没有考虑到骨免疫微环境，与天然骨组织差异明显，本发明在成骨向细胞的基础上同时引入巨噬细胞等免疫细胞调控骨免疫微环境，从而形成具有免疫调节作用的功能性骨类器官。
25、目前骨类器官的构建耗时长，缺乏对细胞命运的调控，促成骨效果不佳，本发明模拟天然骨组织的力学环境，构建动态拉应力三维培养系统，通过力学调控细胞命运，同时可缩短构建骨类器官的时间，获得骨类器官可提高促成骨效果，可促进成熟的功能性骨类器官的形成。
26、本发明提供的骨类器官促进间充质干细胞成骨向分化和抑制骨质流失的能力较单独的间充质干细胞凋亡囊泡显著提高，在治疗老年性骨质疏松方向有着广阔的临床应用前景。
27、相较于以往研究中基于静态培养和单种细胞构建的骨类器官，本发明构建的骨类器官拥有更加优异的骨修复效果。目前自体骨移植是治疗骨缺损的金标准，但自体骨移植会造成供区损伤，本发明构建的骨类器官在植入14天后就能达到与自体骨修复相媲美的骨再生修复效果。
技术特征：
1.一种骨类器官，其特征在于：所述的骨类器官由细胞混合物经过三维培养获得，所述的细胞混合物包含干细胞和巨噬细胞。
2.根据权利要求1所述的骨类器官，其特征在于：
3.根据权利要求1或2所述的骨类器官，其特征在于：所述的干细胞与所述的巨噬细胞的数量比为(2-3):1。
4.根据权利要求1或2所述的骨类器官，其特征在于：所述的细胞混合物还包含水凝胶基质材料。
5.根据权利要求4所述的骨类器官，其特征在于：
6.一种根据权利要求4或5所述的骨类器官的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括如下步骤：
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的三维培养反应器为基于动态拉应力的三维培养反应器。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于：所述的基于动态拉应力的三维培养反应器在加入所述的细胞混合物前先后经过等离子体喷涂处理去除内表面杂质，和内表面涂覆多聚赖氨酸以提高内表面的亲水性和黏附性的处理。
9.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于：
10.根据权利要求1-5之一所述的骨类器官用于制备骨修复材料或体外研究模型的用途。
技术总结
本发明属于生物医学工程技术领域，涉及一种骨类器官及其构建方法与用途。所述的骨类器官由细胞混合物经过三维培养获得，所述的细胞混合物包含干细胞和巨噬细胞。利用本发明的骨类器官及其构建方法，能够快速制备骨类器官，制得骨类器官与天然骨差异小，能够对细胞命运进行调控，并能够更好地促成骨和促进骨修复。
技术研发人员：周永胜,吕珑薇,白晓强,万竹青,翟墨,袁芷若
受保护的技术使用者：北京大学口腔医学院
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5