一种细胞色素P450酶、核酸分子、甘草次酸衍生物及其应用

本发明属于基因工程制药，具体涉及一种细胞色素p450酶、核酸分子、甘草次酸衍生物及其应用，特别涉及其在制备新颖甘草次酸衍生物中的应用。

背景技术：

1、甘草次酸是一种常见的齐墩果烷型五环三萜天然产物。目前对甘草次酸母核进行结构修饰获得的一系列甘草次酸衍生物在抗炎，抗肿瘤，抗病毒，神经保护等方面表现出广泛的药理活性。传统有机合成手段主要包括两种：基于甘草次酸骨架上a环的羟基，c环的共轭烯酮和e环的c30位羧基进行衍生化；或者基于导向基团策略活化附近的c-h键并进行衍生化，进而改善其药理活性。但是由于甘草次酸b环和d环上多为化学环境相似的sp3杂化的惰性c-h键，缺乏导向基团，目前，无法通过有机合成方法实现甘草次酸b/d环的选择性c-h活化。

2、细胞色素p450酶(简称cyp450s)是一类以亚铁-卟啉作为催化中心的金属酶，以分子氧作为氧化剂可催化底物的单加氧反应。同时酶活性口袋中的不同氨基酸残基与底物发生相互作用形成的微环境赋予了cyp450s独特的区域和立体选择性。对于结构复杂且含有多个化学环境相似的惰性c-h键的天然产物，如甘草次酸，cyp450s是实现选择性c-h键活化并羟基化的理想催化剂。

3、通常cyp450s发生单加氧反应需要有还原蛋白辅助电子转移以及充足的nadph供应。其中，天然融合的p450rhf具有高效的电子传递链，其融合的还原蛋白p450rhfred与许多cyp450s适配性高，形成的人工融合酶cyp450-rhfred催化效率高，表达和使用方便。opt13是一种亚磷酸脱氢酶，在温和的水体系中，利用na2hpo3就能将nadp+高效转化成昂贵的nadph辅因子并实现循环，在cyp450s的催化转化中广泛使用。

4、目前，已报道的利用酶催化甘草次酸的选择性c-h键羟基化主要通过全细胞转化的方式，利用微生物如细菌bacillus megaterium本身的酶进行催化，这种方式通常产物背景杂，给分离纯化带来了一定的困难。尽管利用体外酶进行催化的产物谱干净，便于大规模推广，但尚未有用于甘草次酸选择性c-h键羟基化的细菌cyp450基因被鉴定并克隆的报道。

技术实现思路

1、发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供一种能够催化甘草次酸选择性c-h键羟基化的新的细胞色素p450酶或其催化活性片段。

2、本发明还要解决的技术问题是提供了编码该蛋白的核酸分子以及表达盒、重组载体、重组菌株或细胞等。

3、本发明还要解决的技术问题是提供了一种cyp161h12为关键催化酶的酶催化转化体系，将该体系用于不同甘草次酸衍生物的体外生物转化。

4、本发明还要解决的技术问题是提供了所述的细胞色素p450酶或其催化活性片段，所述的核酸分子，所述的表达盒、重组载体、重组菌株或细胞、所述的重组载体、所述的重组菌株、所述的酶催化转化体系在制备甘草次酸衍生物方面的应用。

5、本发明还要解决的技术问题是提供了一系列的新的甘草次酸衍生物。

6、本发明还要解决的技术问题是提供了一种结合有机合成和酶催化制备甘草次酸衍生物的方法。

7、本发明最后要解决的技术问题是提供了甘草次酸衍生物在制备抗炎、抗肿瘤、抗病毒或神经保护的药物中的应用。

8、技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供了一种细胞色素p450酶或其催化活性片段，包括：

9、(a)其氨基酸序列如seq id no：2所示；或

10、(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有细胞色素p450酶活性。

11、本
技术实现要素：
还包括一种核酸分子，其编码所述的细胞色素p450酶或其催化活性片段。

12、所述的核酸分子，包括：

13、(a)其编码所述的细胞色素p450酶或其催化活性片段与seq id no：2至少保持70％以上的序列同一性。

14、(b)其核苷酸序列如seq id no：1所示。

15、本发明的细胞色素氧化酶基因属于cyp161h亚家族，根据cyp450国际命名法将其命名为cyp161h12。cyp161h12编码蛋白的氨基酸序列(404aa)如序列表seq id no：1所示，其核苷酸序列(1212bp)如序列表seq id no.2所示。

16、cyp161h1蛋白序列是从ncbi数据库调研筛选获得的，cyp161h12来源于放线菌amycolatopsis pretoriensis，氨基酸序列uniprot号为a0a1h5rfx8。根据蛋白质序列进行密码子偏好性的优化，优化的序列见seq id no.2。而后将该酶的基因由安徽通用生物股份有限公司直接合成至pet28a-rhfred载体上，限制性内切酶切位点分别为ndei和bamhi，获得pet28a-cyp161h12-rhfred重组质粒。

17、本发明内容还包括表达盒、重组载体、重组菌株或细胞，其含有所述的核酸分子。

18、本发明内容还包括一种重组载体，所述重组载体是将所述的核酸分子导入表达载体中获得，作为优选地，所述表达载体包括pet28a-rhfred质粒。

19、本发明内容还包括一种重组菌株，所述重组菌株是将所述的重组载体导入大肠杆菌中获得，作为优选地，所述大肠杆菌包括大肠杆菌bl21。

20、本发明内容还包括一种酶催化转化体系，所述酶催化转化体系包括所述的重组菌株的细胞裂解液1，作为优选地，所述无细胞催化体系还包括表达亚磷酸脱氢酶的重组菌株的细胞裂解液2；作为优选地，所述细胞裂解液1和细胞裂解液2的体积比为2:1。

21、本发明内容还包括所述的细胞色素p450酶或其催化活性片段，所述的核酸分子，所述的表达盒、重组载体、重组菌株或细胞、所述的重组载体、所述的重组菌株、所述的酶催化转化体系在制备甘草次酸衍生物方面的应用。

22、本发明内容还包括一种甘草次酸衍生物，其结构式如下所示：

23、

24、其中，

25、r1是甘草次酸a环上的官能团或者基于a环修饰的衍生结构，所述a环上的官能团包括c3位羟基、c3位乙酰基、c3位丙酰基、c3位丁酰基、c3位酮羰基；所述基于a环修饰的衍生结构包括c3-氧代-c1-烯的α，β不饱和烯酮、a环扩环形成七元内酯环、c2和c3位稠和异噁唑杂环，r2包括h，甲基或己烯基。

26、其中，所述的甘草次酸衍生物，其结构式如下：

27、

28、

29、本发明内容还包括一种结合有机合成和酶催化制备甘草次酸衍生物的方法，包括以下步骤：

30、1)重组表达载体的构建：将所述的核酸或基因导入表达载体中获得重组表达载体；

31、2)重组菌株的获得与发酵：将重组表达载体导入宿主菌获得重组菌，将得到的重组菌进行发酵和诱导表达并超声破碎得到细胞裂解液1；作为优选地，还包括对表达亚磷酸脱氢酶的重组菌株进行发酵和诱导表达并超声破碎获得细胞裂解液2；

32、3)催化底物制备甘草次酸衍生物：将细胞裂解液1与底物进行反应即得；作为优选，还包括加入细胞裂解液2进行反应；作为优选，所述底物包括甘草次酸、3-羟基甘草次酸，3-乙酰基甘草次酸，3-丙酰基甘草次酸，3-丁酰基甘草次酸，3-氧代甘草次酸，3-氧代-1-烯甘草次酸，a环为七元内酯环的甘草次酸衍生物。

33、作为优选地，步骤1)中的重组表达载体包括pet28a-cyp161h12-rhfred；

34、作为优选地，步骤2)中的发酵步骤包括：将包含pet28a-cyp161h12-rhfred的重组大肠杆菌接种到lb培养基中在37℃培养下获得种子液，往tb培养基中加入微量金属盐溶液和上述种子液，在37℃培养至生长对数期，随后加入iptg和5-ala诱导菌体表达cyp161h12-rhfred融合蛋白，在18℃下诱导培养20h，离心收集菌体用于体外催化反应；

35、作为优选地，所述微量金属盐溶液的配方是：50mm fecl3，20mm cacl2，10mmmnso4，10mm znso4，2mm coso4，2mm cucl2，2mm nicl2，2mm na2moo4，2mm h3bo3；作为优选地，微量金属盐溶液以0.1％v/v的比例加入到tb培养基中；

36、作为优选地，所述iptg在tb培养基中的浓度优选为0.1mm，所述的5-ala在tb培养基中的浓度优选为0.5mm。

37、本发明还包括构建cyp161h12为关键催化剂的多酶催化转化体系及进一步制备甘草次酸衍生物的方法具体包括如下步骤：

38、(1)在大肠杆菌中异源表达cyp161h12-rhfred：将包含pet28a-cyp161h12-rhfred的重组大肠杆菌接种到lb培养基中在37℃培养下获得种子液，往tb培养基中加入微量金属盐溶液和上述种子液。首先在37℃培养至生长对数期，随后加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)和5-氨基乙酰丙酸盐酸盐(5-ala)诱导菌体表达cyp161h12-rhfred融合蛋白，在18℃下诱导培养20h。离心收集菌体用于体外催化反应。具体实施方法见实施例1。

39、(2)在大肠杆菌中异源表达opt13：利用无缝克隆技术连接opt13与载体petduet得到重组质粒petdue-opt13后转化至大肠杆菌bl21中，将重组大肠杆菌接种到lb液体培养基中在37℃培养下获得种子液，往tb培养基中加入上述种子液。首先在37℃培养至生长对数期，随后加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)诱导菌体表达opt13，在18℃下诱导培养20h。离心收集菌体用于体外催化反应。具体实施方法见实施例2。

40、(3)体外催化转化反应：将上述步骤(1)和步骤(2)得到的发酵菌体在kpi缓冲液中重悬后进行超声破碎，分别得到cyp161h12-rhfred和opt13的细胞裂解液，将两者按体积比2：1合得到包括细胞色素氧化酶cyp161h12，还原蛋白rhfred和实现高效nadph供应的亚磷酸脱氢酶opt13的三组分体外催化体系。往三组分催化体系中加入底物，na2hpo3·5h2o和nadp+，在23℃下反应20h后，对反应产物进行萃取，浓缩，分离得到b/d环上惰性c-h键羟基化的氧化产物。

41、其中，上述步骤(3)的kpi缓冲溶液的组成是10.27gk2hpo4·3h2o和0.68gkh2po4溶于1l蒸馏水得到ph＝7，浓度为0.1m的磷酸盐缓冲液。

42、上述步骤(3)所述的kpi缓冲液的浓度优选0.1m，ph值优选7.0。

43、本发明的新颖甘草次酸衍生物可首先经过有机化学合成得到甘草次酸a环衍生物后，由cyp161h12催化获得a环衍生化，b环和/或者d环发生c-h键羟基化的甘草次酸衍生物，如反应路线1所示。

44、反应路线1：

45、

46、反应路线1中，甘草次酸a环经修饰后得到的衍生物与cyp161h12的催化氧化效率不同，部分衍生物只能获得在c7β位羟基化产物，如实施例8和实施例9；部分衍生物则可进一步获得c7β和c15α发生氧化级联的双羟基产物，如实施例7，实施例10，实施例11，实施例12，实施例13。

47、本发明的新颖甘草次酸衍生物也可首先由cyp161h12催化甘草次酸的b环c7β和/或者d环c15α发生羟基化，随后用有机化学合成在甘草次酸骨架的c30位进行酯化获得c30位羧基酯化，b环和/或者d环发生c-h键羟基化的产物，如路线反应路线2所示。

48、反应路线2：

49、

50、反应路线2中，cyp161h12可对甘草次酸的c7β和c15α发生氧化级联反应，生成2个羟基化产物，对羧基的酯化反应在不影响现有的羟基基团的情况下可容易制备。

51、本发明内容还包括所述的甘草次酸衍生物在制备抗炎、抗肿瘤、抗病毒或神经保护的药物中的应用。

52、有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：

53、①本发明提供了一种新型细胞色素氧化酶cyp161h12及其编码基因，通过利用cyp161h12构建的体外催化转化系统，实现了甘草次酸骨架分子的b环和/或d环的高选择性c-h键活化。②与传统有机合成相比，本发明利用酶催化技术实现的c-h键羟基化具有明显优势，该技术不仅在位点和立体选择性上表现出色，而且反应条件温和，对环境友好，符合绿色化学原则。③与微生物全细胞转化相比，本发明构建的酶体外催化转化体系，能够产生干净的产物谱，有利于产物的分离和纯化。④羟基作为常用分子手柄，容易被进一步修饰引入其他官能团，本发明中合成的新颖甘草次酸衍生物保留了b环和d环上的羟基。这对于扩展甘草次酸衍的生物化学空间以及深入探索其在药理研究中的构效关系具有重要意义。

技术特征：

1.一种细胞色素p450酶或其催化活性片段，包括：

2.一种核酸分子，其编码权利要求1所述的细胞色素p450酶或其催化活性片段。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，包括：

4.表达盒、重组载体、重组菌株或细胞，其含有权利要求2或3所述的核酸分子。

5.一种重组载体或重组菌株，其特征在于，所述重组载体是将权利要求2或3所述的核酸分子导入表达载体中获得，作为优选地，所述表达载体包括pet28a-rhfred质粒，所述重组菌株是将权利要求4所述的重组载体导入大肠杆菌中获得，作为优选地，所述大肠杆菌包括大肠杆菌bl21。

6.一种酶催化转化体系，其特征在于，所述酶催化转化体系包括权利要求5所述的重组菌株的细胞裂解液1，作为优选地，所述酶催化转化体系还包括表达亚磷酸脱氢酶的重组菌株的细胞裂解液2；作为优选地，所述细胞裂解液1和细胞裂解液2的体积比为2:1。

7.权利要求1所述的细胞色素p450酶或其催化活性片段，权利要求2或3所述的核酸分子，权利要求4所述的表达盒、重组载体、重组菌株或细胞、权利要求5所述的重组载体、权利要求5所述的重组菌株、权利要求6所述的酶催化转化体系在制备甘草次酸衍生物方面的应用。

8.甘草次酸衍生物，其结构式如下所示：

9.一种结合有机合成和酶催化制备甘草次酸衍生物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

10.权利要求8所述的甘草次酸衍生物在制备抗炎、抗肿瘤、抗病毒或神经保护的药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种细胞色素P450酶、核酸分子、甘草次酸衍生物及其应用。本发明通过利用CYP161H12构建的体外催化转化系统，在甘草次酸骨架分子的B环和/或D环实现了选择性C‑H键活化，具备明显优势。本发明利用酶催化技术实现的C‑H键羟基化反应，不仅在位点和立体选择性上表现出色，而且反应条件温和，对环境友好，符合绿色化学原则。本发明构建的酶体外催化转化体系，能够产生干净的产物谱，有利于产物的分离和纯化。本发明中合成的新颖甘草次酸衍生物保留了B环和D环上的羟基，这对于扩展甘草次酸衍生物的化学空间以及深入探索其在药理研究中的构效关系具有重要的意义。

技术研发人员：董廖斌,张晓维,林小栩,王增援,李芳茹
受保护的技术使用者：中国药科大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5