转基因安格鲁雪貂模型的构建方法

本发明涉及生物，具体地，本发明涉及转基因安格鲁雪貂模型的构建方法。进一步地，本发明涉及一种转基因安格鲁雪貂模型和sgrna。

背景技术：

1、在生物医学研究领域，雪貂作为一种高等哺乳动物，因其与人类器官相似的解剖结构、代谢途径和生理特征，以及对多种人类病原体的敏感性，已逐渐成为重要的实验动物模型。近年来，雪貂模型在多个研究领域，包括大脑发育、神经功能、脊髓损伤、癫痫、心脏疾病、免疫系统功能、肥胖症、肿瘤学、以及包括慢性阻塞性肺病、肺囊肿、肺纤维化、肺癌在内的多种肺部疾病的研究中，展现了其独特的价值。此外，雪貂模型也在传染病研究中扮演了关键角色。

2、随着基因编辑技术，尤其是crispr/cas9系统的快速发展，基因组编辑的效率和精确度得到了显著提升，为雪貂模型的应用提供了新的改进。然而，现有的基因敲入雪貂模型的方法操作复杂且效率不高。

3、因此，亟需开发一种新的高效精准转基因敲入雪貂模型的制备方法。以提高基因敲入的效率和准确性。

技术实现思路

1、本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提供了一种转基因安格鲁雪貂模型的构建方法。

2、本发明是基于发明人的下列发现而完成的:

3、现有技术主要是在crispr/cas9的基础上通过非同源重组的方法获得转基因安格鲁雪貂模型，该技术操作复杂，效率低，且精准敲入难度大。为了克服这一问题，发明人开发了一种高效精准转基因敲入安格鲁雪貂模型的制备方法，并已成功制备多个品系的转基因敲入安格鲁雪貂品系。

4、在本发明的第一个方面，本发明提出了一种转基因安格鲁雪貂模型的构建方法。根据本发明的实施例，所述方法包括:将sgrna导入到安格鲁雪貂受精卵中，以便获得转基因雪貂模型，所述sgrna适于靶向预干预基因。根据本发明实施例的方法，能够高效地构建转基因安格鲁雪貂模型，包含基因敲入、基因敲除和人源化雪貂模型。

5、根据本发明的实施例，所述导入之前，进一步包括:对雪貂受精卵进行离心处理。

6、根据本发明的实施例，所述离心处理的速度为7800g～8000g。

7、根据本发明的实施例，所述离心处理的时间为6分钟～8分钟。

8、根据本发明的实施例，所述离心处理的速度为7850g～7950g。

9、根据本发明的实施例，所述离心处理的时间为6.5分钟～7.5分钟。

10、根据本发明的实施例，所述将sgrna导入到安格鲁雪貂受精卵是通过如下方式中的至少之一进行的:细胞核显微注射和细胞质显微注射。

11、根据本发明的实施例，所述离心处理后，对显示出核区的所述受精卵进行所述细胞核显微注射。

12、根据本发明的实施例，所述离心处理后，对未显示出核区的所述受精卵进行所述细胞质显微注射。

13、根据本发明的实施例，所述细胞核显微注射压力为200pa～240pa。

14、根据本发明的实施例，所述细胞核显微注射时间为0.35秒～0.45秒。

15、根据本发明的实施例，所述细胞质显微注射压力为190pa～210pa。

16、根据本发明的实施例，所述细胞质显微注射的时间为0.25秒～0.35秒。

17、根据本发明的实施例，所述雪貂受精卵是通过如下方式获得的:

18、在正常交配后的雌貂体内注射hcg；以及注射hcg预定时间后，进行受精卵取出处理，以便获得所述雪貂受精卵；其中，在正常交配后的30min～1h内的雌貂体内注射所述hcg。

19、根据本发明的实施例，所述hcg的注射量为250单位～350单位。

20、根据本发明的实施例，注射hcg 42小时～44小时后进行所述受精卵取出处理。

21、根据本发明的实施例，所述sgrna适于靶向emx1、nkx2.1、hace2和chd8中的至少之一。

22、根据本发明的实施例，所述sgrna的crrna具有如seq id no:1、seq id no:2、seqid no:3和seq id no:44所示的核苷酸序列中的至少之一。

23、根据本发明的实施例，所述sgrna的crrna具有如seq id no:1所示的核苷酸序列。

24、根据本发明的实施例，所述sgrna的crrna具有如seq id no:2所示的核苷酸序列。

25、根据本发明的实施例，所述sgrna的crrna具有如seq id no:3所示的核苷酸序列。

26、根据本发明的实施例，所述sgrna的crrna具有如seq id no:44所示的核苷酸序列。

27、在本发明的第二个方面，本发明提出了一种转基因安格鲁雪貂模型。根据本发明的实施例，所述模型是利用本发明的第一个方面所述的方法进行制备获得的。根据本发明实施例的雪貂模型，能广泛应用于研究大脑皮层发育和功能研究、自闭症自闭机制研究、和新冠病毒sars-cov-2感染致病机制和疫苗药物开发。

28、根据本发明的实施例，所述转基因安格鲁雪貂模型包括emx1-creert2转基因安格鲁雪貂、nkx2.1-creert2转基因安格鲁雪貂、人源化ace2替代雪貂模型和chd8敲除转基因安格鲁雪貂中的至少之一。

29、在本发明的第三个方面，本发明提出了一种sgrna。根据本发明的实施例，所述sgrna的crrna具有如seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3和seq id no:44所示的核苷酸序列中的至少之一。根据本发明的实施例，所述sgrna的crrna具有如seq id no:1所示的核苷酸序列。根据本发明的实施例，所述sgrna的crrna具有如seq id no:2所示的核苷酸序列。根据本发明的实施例，所述sgrna的crrna具有如seq id no:3所示的核苷酸序列。根据本发明的实施例，所述sgrna的crrna具有如seq id no:44所示的核苷酸序列。根据本发明的实施例，所述sgrna的trrna适于靶向cas9蛋白。根据本发明实施例的sgrna，能够精准高效靶向预干预基因。

30、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

技术特征：

1.一种转基因安格鲁雪貂模型的构建方法，其特征在于，包括:

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述导入之前，进一步包括:对雪貂受精卵进行离心处理。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述离心处理的速度为7800g～8000g；

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述将sgrna导入到安格鲁雪貂受精卵是通过如下方式中的至少之一进行的:细胞核显微注射和细胞质显微注射；

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述细胞核显微注射压力为200pa～240pa；

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述雪貂受精卵是通过如下方式获得的:

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述sgrna适于靶向emx1、nkx2.1、hace2和chd8中的至少之一；

8.一种转基因安格鲁雪貂模型，其特征在于，利用权利要求1～7任一项所述的方法进行制备获得的。

9.根据权利要求8所述的模型，其特征在于，所述转基因安格鲁雪貂模型包括emx1-creert2转基因安格鲁雪貂、nkx2.1-creert2转基因安格鲁雪貂、人源化ace2替代雪貂模型和chd8敲除转基因安格鲁雪貂中的至少之一。

10.一种sgrna，其特征在于，所述sgrna的crrna具有如seq id no:1、seq id no:2、seqid no:3和seq id no:44所示的核苷酸序列中的至少之一。

技术总结
本发明公开了一种转基因安格鲁雪貂模型的构建方法。根据本发明的实施例，所述方法包括:将sgRNA导入到安格鲁雪貂受精卵中，以便获得转基因雪貂模型，所述sgRNA适于靶向预干预基因。根据本发明实施例的方法，能够高效地构建转基因安格鲁雪貂模型，包含基因敲入、基因敲除和人源化雪貂模型。

技术研发人员：时松海,马健,于淼,贺明,何南,张淞博
受保护的技术使用者：清华大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5