测定炎症模型中花生四烯酸代谢通路COX-2代谢产物含量的方法

本发明属于检测，尤其涉及测定炎症模型中花生四烯酸代谢通路cox-2代谢产物含量的方法。

背景技术：

1、花生四烯酸(arachidonic acid，aa)是一种ω-6多不饱和脂肪酸，为体内分布最广泛的内源性活性物质，在维持机体细胞膜的结构与功能等方面具有重要的作用。aa不仅是机体各组织和器官中必不可少的磷脂，同时还是人体前列腺素(pg)合成的重要前体物质，在aa代谢网络中，aa分别通过环氧合酶(cyclooxygenases，coxs)、脂氧合酶(lipoxygenase，loxs)和细胞色素p450(cytochromep450，cyp450)酶三种代谢途径分别产生了前列腺素类(prostaglandins，pgs)、血栓素类(thromboxanes，txs)、白三烯类(leucotrienes，lts)或羟基脂肪酸等一系列代谢产物，引发不同的炎症反应。前列腺素类包括前列腺素f2β(pgf2β)、前列腺素e2(pge2)、前列腺素e1(pge1)、前列腺素d1(pgd1)、前列腺素d2(pgd2)、前列腺素a1(pga1)、前列腺素a2(pga2)、前列腺素j2(pgj2)、前列腺素b2(pgb2)等。血栓素类包括血栓素b1(txb1)、血栓素b2(txb2)等。这些aa代谢产物统称为花生酸类，是有效的自分泌和旁分泌生物活性介质，是体内重要的炎症因子，参与机体免疫及炎症反应过程，并在许多疾病的病理生理过程中起着重要的作用。炎症是关节炎的重要病理基础，是与关节炎发生紧密相关的一个过程。以pge2为例，pge2在前列腺素样物质中促进骨吸收的作用最强，关节炎组织中存在pge2受体，与pge2结合发挥作用，具有pge2受体动物的关节组织病理学揭示了软骨退化，蛋白聚糖丢失，导致ⅱ型胶原的破坏，因此，其在关节炎的病理机制中起重要作用。

2、基于cox代谢途径，其有cox-1和cox-2两种亚型，cox-1用于基本前列腺素合成，属于组成酶；cox-2在许多炎症中有重要作用，受到激发而产生，属于诱导酶。花生四烯酸(arachidonic acid，aa)代谢通路在炎症反应中发挥重要作用。然而，在炎症模型中的aa的整体代谢轮廓仍然难以捉摸。

3、目前，aa代谢通路中炎性因子的含量的检测仍采用酶联免疫吸附法、流式细胞术、westernblot等技术进行单一指标检测，存在不同批次样本不稳定性、检测成本高以及对技术人员要求高等问题。pang等建立了对大鼠脊髓挫伤后4h、24h和48h的脊髓组织进定量分析pge2和ltb4(参考文献：pang y,liu x,zhao c,et al.lc-ms/ms-based arachidonicacid metabolomics in acute spinal cord injury reveals the upregulation of 5-lox and cox-2 products.free radic biol med.2022；193(pt1):363-372.)。lin等则建立了测定人血浆样本中白三烯b4的含量的lc-ms方法(参考文献：lin w，huang mq，xue x，et al.ahighly sensitive and selective method for the determination ofleukotriene b4(ltb4)in ex vivo stimulated human plasma by ultra fast liquidchromatography tandem mass spectrometry[j].jchromatogr b analyt technolbiomed life sci，2013，925：54.)。现有方法仅能检测1-2个aa的代谢产物，但1-2个aa的代谢产物的检测无法清楚了解炎症模型中的aa的整体代谢情况。

技术实现思路

1、鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供测定炎症模型中花生四烯酸代谢通路cox-2代谢产物含量的方法。本发明提供的方法可以同时检测aa代谢通路中11种代谢产物的含量，具有快速、灵敏度高、稳定性好等优点。

2、本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

3、本发明提供测定炎症模型中花生四烯酸代谢通路cox-2代谢产物含量的方法，包括以下步骤：

4、(1)对样本前处理：对细胞上清液样本和/或血清样本进行前处理，前处理的过程中加入内标工作液，内标工作液为内标物pga2-d4的溶液；

5、(2)采用agilent 6495三重四极杆质谱仪检测处理后的样本。

6、采取上述方案的有益效果包括：本发明提供的方法可以确定aa代谢产物及其结构类似物等成分的定性和定量分析，拓展了lc-ms在检测pge2等炎症因子方面的应用。本发明通过uhplc-qqq-ms/ms方法建立快速、灵敏度高、稳定性好的11个代谢产物的检测方法，实现了样本数多、信息量多以及对单个样本量需要量少。

7、进一步，步骤(2)中，检测条件包括：在waters acquity uplc c18柱上进行色谱分离；流动相为0.1％甲酸a和乙腈b，梯度洗脱：40％b为0-3分钟，40％-80％b为3-8分钟，40％b为8.01-10分钟；注射等量5μl，flow速度为300μl/min；使用mrm和esi源在负离子模式下对代谢产物进行检测；干燥气体流量为11.0l/min，干燥气体温度为300℃，雾化器15psig，毛细管电压为4000v。

8、进一步，步骤(1)中，细胞上清液样本进行前处理的方法包括以下步骤：取上清液200μl，加入内标工作液50μl，加入乙腈800μl，涡旋3min；4℃，14000rpm离心10min，取上清；真空浓缩；加入色谱甲醇100μl重新溶解，静置后超声，涡旋3min；4℃，14000rpm离心10min，取上清。

9、进一步，细胞上清液为经lps诱导的raw264.7细胞炎症模型的上清液。

10、进一步，步骤(1)中，血清样本进行前处理的方法包括以下步骤：取血清200μl，加入内标工作液50μl，再加入乙腈800μl，涡旋3min；4℃，14000rpm离心10min，取上清；真空浓缩；加入色谱甲醇100μl重新溶解，静置后超声，涡旋3min；4℃，14000rpm离心10min，取上清。

11、进一步，血清样本为佐剂型诱导关节炎(aia)模型的血清样本或ⅱ型胶原诱导关节炎(cia)模型的血清样本。

12、采取上述方案的有益效果包括：本发明采用高效液相色谱串联质谱法(lc-ms法)可以同时对细胞上清液和动物血清中的11种aa代谢产物进行快速定量分析，具有快速、高效、灵敏度高、稳定性好、信息量大、单个样本需要量少等优点。该方法是应用于各类不同炎症模型构建中cox-2代谢产物含量测定的合适方法。

13、进一步，步骤(2)中，根据检测得到的峰面积以及标准曲线公式计算代谢产物的含量。

14、当检测细胞上清液样本时，txb1的标准曲线为y＝0.196x-0.0572，pgf2β的标准曲线为y＝1.98x-0.0400，txb2的标准曲线为y＝0.928x-0.0335，pge2的标准曲线为y＝21.2x-0.259，pge1的标准曲线为y＝49.1x-0.500，pgd1的标准曲线为y＝4.09x-0.0314，pgd2的标准曲线为y＝4.03x-0.232，pga2的标准曲线为y＝48.5x-0.00965，pgj2的标准曲线为y＝34.8x-0.315，pgb2的标准曲线为y＝10.5x-0.0443，pga1的标准曲线为y＝4.86x-0.0330；上述中，x为目标物浓度，单位为ng/ml，y为目标物和内标物的峰面积比。

15、当检测血清样本时，txb1的标准曲线为y＝0.298x+0.0378，pgf2β的标准曲线为y＝12.5x+0.131，txb2的标准曲线为y＝8.84x+0.259，pge2的标准曲线为y＝110.4x+3.21，pge1的标准曲线为y＝243.8x+5.23，pgd1的标准曲线为y＝76.0x+1.68，pgd2的标准曲线为y＝646.23x+0.457，pga2的标准曲线为y＝6051.63x+0.565，pgj2的标准曲线为y＝136.94x+14.5，pgb2的标准曲线为y＝62.8x+1.50，pga1的标准曲线为y＝24.7x+0.574；上述中，x为目标物浓度，单位为ng/ml，y为目标物和内标物的峰面积比。

16、进一步，步骤(1)中，内标工作液中，pga2-d4的浓度为0.1μg/ml。

17、采取上述方案的有益效果包括：pga2-d4作为内标效益更好，在几个被测组分色谱峰中间，且不共溢出，而其他的内标arachidonic acid-d8在样品复溶后未检测成功。

技术特征：

1.测定炎症模型中花生四烯酸代谢通路cox-2代谢产物含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)中，检测条件包括：在watersacquity uplc c18柱上进行色谱分离；流动相为0.1％甲酸a和乙腈b，梯度洗脱：40％b为0-3分钟，40％-80％b为3-8分钟，40％b为8.01-10分钟；注射等量5μl，flow速度为300μl/min；使用mrm和esi源在负离子模式下对代谢产物进行检测；干燥气体流量为11.0l/min，干燥气体温度为300℃，雾化器15psig，毛细管电压为4000v。

3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，步骤(1)中，细胞上清液样本进行前处理的方法包括以下步骤：取上清液200μl，加入内标工作液50μl，加入乙腈800μl，涡旋3min；4℃，14000rpm离心10min，取上清；真空浓缩；加入色谱甲醇100μl重新溶解，静置后超声，涡旋3min；4℃，14000rpm离心10min，取上清。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，细胞上清液为经lps诱导的raw264.7细胞炎症模型的上清液。

5.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，步骤(1)中，取血清200μl，加入内标工作液50μl，加入乙腈800μl，涡旋3min；4℃，14000rpm离心10min，取上清；真空浓缩；加入色谱甲醇100μl重新溶解，静置后超声，涡旋3min；4℃，14000rpm离心10min，取上清。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，血清样本为佐剂型诱导关节炎模型的血清样本或ⅱ型胶原诱导关节炎模型的血清样本。

7.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，步骤(2)中，根据检测得到的峰面积以及标准曲线公式计算代谢产物的含量。

8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，当检测细胞上清液样本时，txb1的标准曲线为y＝0.196x-0.0572，pgf2β的标准曲线为y＝1.98x-0.0400，txb2的标准曲线为y＝0.928x-0.0335，pge2的标准曲线为y＝21.2x-0.259，pge1的标准曲线为y＝49.1x-0.500，pgd1的标准曲线为y＝4.09x-0.0314，pgd2的标准曲线为y＝4.03x-0.232，pga2的标准曲线为y＝48.5x-0.00965，pgj2的标准曲线为y＝34.8x-0.315，pgb2的标准曲线为y＝10.5x-0.0443，pga1的标准曲线为y＝4.86x-0.0330；上述中，x为目标物浓度，单位为ng/ml，y为目标物和内标物的峰面积比。

9.根据权利要求7所述方法，其特征在于，当检测血清样本时，txb1的标准曲线为y＝0.298x+0.0378，pgf2β的标准曲线为y＝12.5x+0.131，txb2的标准曲线为y＝8.84x+0.259，pge2的标准曲线为y＝110.4x+3.21，pge1的标准曲线为y＝243.8x+5.23，pgd1的标准曲线为y＝76.0x+1.68，pgd2的标准曲线为y＝646.23x+0.457，pga2的标准曲线为y＝6051.63x+0.565，pgj2的标准曲线为y＝136.94x+14.5，pgb2的标准曲线为y＝62.8x+1.50，pga1的标准曲线为y＝24.7x+0.574；上述中，x为目标物浓度，单位为ng/ml，y为目标物和内标物的峰面积比。

10.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，内标工作液中，pga2-d4的浓度为0.1μg/ml。

技术总结
本发明涉及测定炎症模型中花生四烯酸代谢通路COX‑2代谢产物含量的方法，包括以下步骤：(1)对样本前处理：对细胞上清液样本和/或血清样本进行前处理，前处理的过程中加入内标工作液，内标工作液为PGA<subgt;2</subgt;‑D<subgt;4</subgt;溶液；(2)采用Agilent 6495三重四极杆质谱仪检测处理后的样本。本发明提供的方法可以同时检测AA代谢通路中11种代谢产物的含量，具有快速、灵敏度高、稳定性好等优点。

技术研发人员：何凡,黄虞枫,汪梦贤
受保护的技术使用者：广东省中医院（广州中医药大学第二附属医院、广州中医药大学第二临床医学院、广东省中医药科学院）
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5