一种提高TERT启动子高GC区域捕获效率的方法及试剂盒与流程
本发明具体涉及一种提高tert启动子高gc区捕获效率的方法及试剂盒。
背景技术：
1、甲状腺癌是一种常见的内分泌恶性肿瘤，tert基因是甲状腺癌中一个非常重要的突变基因，是诊断和侵袭性评估重要的标志物。tert启动子区的突变在dtc【分化型甲状腺癌，differentiated thyroid carcinoma，包括乳头状甲状腺癌(papillary thyroidcarcinoma,ptc)和滤泡型甲状腺癌(follicular thyroid carcinoma,ftc)】中的发生率为10％-15％，而在良性结节中较罕见。临床表现为dtc侵袭性及复发风险显著增加，导致较差预后。tert编码端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase)，是端粒酶中有催化活性的亚基。tert启动子的两个热点突变(c228t和c250t)最初在黑色素瘤中发现，后被证明广泛的存在于多种癌细胞中，最常见的就包括甲状腺癌。tert突变导致甲状腺癌出现可能的机制是，c228t或c250t突变后，为gabpα提供了第二个结合位点，进而导致细胞的复制、增殖等一系列生理活动。在乳头状甲状腺癌中，tert启动子突变常与braf v600e突变同时出现。
2、现有的杂交捕获检测方法通常检测gc含量相对正常的cds区域，而tert基因的这两个突变位点位于高gc含量的启动子区，因此，采用杂交捕获方法来检测这两个热点突变存在捕获效率不理想，而导致测序深度较低，影响了低突变丰度样本的检测准确性。此外，braf中at含量高，因此，捕获效率也较差。
3、因此，开发一种能够有效提高tert启动子区域以及braf等突变区检测灵敏度和准确性的方法具有重要意义。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题是提供一种提高难检测突变区捕获效率的方法及试剂盒。
2、为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
3、本发明第一方面提供一种提高tert启动子高gc区捕获效率的方法，包括如下步骤：
4、(1)从待检测样本中提取dna并构建dna预文库；
5、(2)采用rna探针和dna探针的混合物与所述dna预文库进行杂交反应；
6、(3)对杂交反应得到的产物进行文库扩增，然后进行测序分析。
7、本技术通过rna探针和dna探针的组合使用，在相同测序量下，有效的提高了tert的测序量，提高了低频率突变的检出，使得检测下限可达1％。
8、根据一些实施方式，所述rna探针和所述dna探针的序列一致。其中，序列一致是指两者的序列中，除了碱基u和t的差异外，其他碱基完全相同，即dna探针序列是将rna探针序列中的u替换为t得到的序列。
9、根据一些实施方式，所述rna探针和所述dna探针的长度为121bp。
10、根据一些实施方式，所述rna探针和所述dna探针均标记有生物素。
11、根据一些实施方式，所述混合物中，所述rna探针和所述dna探针的比例为1:0.25～3，例如4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3。
12、进一步地，所述混合物中，所述rna探针和所述dna探针的比例为1:2。经多次试验发现，该比例下的探针混合物对于低突变频率的待测样本的检测效果更好。
13、根据一些实施方式，所述待检测样本的目标基因为tert启动子区域。
14、进一步地，所述待检测样本的目标基因tert启动子区域的c228t和c250t。
15、根据一些实施方式，所述rna探针和所述dna探针分别为多种。
16、进一步地，所述dna探针包括第一dna探针、第二dna探针、第三dna探针和第四dna探针，其中，所述第一dna探针的序列包括5'-tgcgcagcaggacgcagcgctgcctgaaactcgcgccgcgaggagagggcggggccgcggaaaggaaggggaggggctgggagggc ccggagggggctgggccggggacccgggaggggtc-3'；
17、所述第二dna探针的序列包括5'-cctgaaactcgcgccgcgaggagagggcggggccgcggaaaggaaggggaggggctgggagggcccggagggggctgggccgggg acccgggaggggtcgggacggggcggggtccgcgcg-3'；
18、所述第三dna探针的序列包括5'-aaaggaaggggaggggctgggagggcccggagggggctgggccggggacccgggaggggtcgggacggggcggggtccgcgcgga ggaggcggagctggaaggtgaaggggcaggacgggt-3'；
19、所述第四dna探针的序列包括5'-gggcccggagggggctgggccggggacccgggaggggtcgggacggggcggggtccgcgcggaggaggcggagctggaaggtgaa ggggcaggacgggtgcccgggtccccagtccctccg-3'；
20、所述rna探针包括第一rna探针、第二rna探针、第三rna探针和第四rna探针，其中，所述第一rna探针的序列包括5'-ugcgcagcaggacgcagcgcugccugaaacucgcgccgcgaggagagggcggggccgcggaaaggaaggggaggggcugggagg gcccggagggggcugggccggggacccgggagggguc-3'；
21、所述第二rna探针的序列包括5'-ccugaaacucgcgccgcgaggagagggcggggccgcggaaaggaaggggaggggcugggagggcccggagggggcugggccggg gacccgggaggggucgggacggggcgggguccgcgcg-3'；
22、所述第三rna探针的序列包括5'-aaaggaaggggaggggcugggagggcccggagggggcugggccggggacccgggaggggucgggacggggcgggguccgcgcg gaggaggcggagcuggaaggugaaggggcaggacgggu-3'；
23、所述第四rna探针的序列包括5'-gggcccggagggggcugggccggggacccgggaggggucgggacggggcgggguccgcgcggaggaggcggagcuggaaggug aaggggcaggacgggugcccggguccccagucccuccg-3'。
24、该些序列的探针能够高效捕获含有热点突变的核酸片段，同时避免非特异性结合。其中，该些序列为针对tert启动子区域的两个热点突变位点(c228t和c250t)设计rna探针和dna探针。通过针对c228t和c250t铺设四种探针，有利于进一步提高捕获效率以及检测灵敏度和准确性。
25、进一步地，所述rna探针为双链rna探针，所述dna探针为双链dna探针，其中所述双链rna探针的两条链完全反向互补，所述双链dna探针的两条链完全反向互补。且双链rna探针和双链dna探针中的每条链均标记有生物素。
26、根据某些具体实施方式，所述方法基于ngs技术。
27、本发明第二方面提供一种能够提高tert启动子高gc区域捕获效率的试剂盒，所述试剂盒包括所述的rna探针和dna探针。
28、根据某些实施方式，所述试剂盒还包括ngs检测所需的其他试剂。
29、由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
30、本发明通过使用rna探针和dna探针的混合物与dna预文库进行杂交反应，有效提高了tert启动子高gc区域的捕获效率，提高了突变检测的灵敏度，从而显著提高了突变在低丰度样本中的检出率。
技术特征：
1.一种提高tert启动子高gc区域捕获效率的方法，其特征在于：包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述rna探针和所述dna探针的序列一致。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述rna探针和所述dna探针的长度为121bp；和/或，所述待检测样本的目标基因为tert启动子高gc区域；和/或，所述rna探针和所述dna探针均标记有生物素。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述混合物中，所述rna探针和所述dna探针的比例为1:0.25～3。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述混合物中，所述rna探针和所述dna探针的比例为1:1～3。
6.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于：所述rna探针和所述dna探针分别为多种。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述dna探针包括第一dna探针、第二dna探针、第三dna探针和第四dna探针，其中，所述第一dna探针的序列包括5'-
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述rna探针为双链rna探针，所述dna探针为双链dna探针，其中所述双链rna探针的两条链完全反向互补，所述双链dna探针的两条链完全反向互补。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法基于ngs技术。
10.一种能够提高tert启动子高gc区域捕获效率的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括如权利要求1至9中任一项所述的rna探针和dna探针。
技术总结
本发明涉及一种提高TERT启动子高GC区域捕获效率的方法，包括如下步骤：(1)从待检测样本中提取DNA并构建DNA预文库；(2)采用RNA探针和DNA探针的混合物与所述DNA预文库进行杂交反应；(3)对杂交反应得到的产物进行文库扩增，然后进行测序分析。本发明通过使用RNA探针和DNA探针的混合物与DNA预文库进行杂交反应，有效提高了TERT启动子高GC区域的捕获效率，提高了突变检测的灵敏度，从而显著提高了突变在低丰度样本中的检出率。
技术研发人员：崔书建
受保护的技术使用者：苏州她他基因科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5