一种鼠李糖乳杆菌高密度发酵方法与流程

本发明涉及菌类发酵，尤其是涉及一种鼠李糖乳杆菌高密度发酵方法。

背景技术：

1、乳酸菌(lactic acid bacteria，lab)是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的统称。这类细菌在自然界分布极为广泛，具有丰富的物种多样性，至少包含乳杆菌属、链球菌属、明串珠菌属、双歧杆菌属和片球菌属等18个属，共200多种。除极少数外，其绝大部分都是人体内必不可少的、且具有重要生理功能的菌群，广泛存在于人体的肠道中。在工业、农牧业、食品和医药等与人类生活密切相关的重要领域具有极高的应用价值。

2、鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)，多存在于人和动物的肠道，是一种不运动，兼性厌氧，耐酸，无芽孢的革兰氏染色呈阳性杆状益生菌。随着科研人员对鼠李糖乳杆菌不断深入的研究，发现其有调节肠道菌群、屏障保护和提高机体免疫等诸多益生功能。

3、在目前的现有技术中，鼠李糖乳杆菌发酵培养基通常使用mrs培养基，但是用该配方发酵后的活菌数较低大概为108-109cfu/ml，无法满足目前工业生产对于降本增效，缩短生产周期的要求。因此提出一种鼠李糖乳杆菌高密度发酵的配方及发酵工艺是十分必要的。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种鼠李糖乳杆菌高密度发酵方法，以解决上述现有技术存在的问题，该方法得到的发酵液活菌数达2.0×1010cfu/ml以上，实现了菌株的高密度培养，为后续的鼠李糖乳酸菌产品工业化生产提供理论支持。

2、为了达成上述的目的，本发明提供了一种鼠李糖乳杆菌高密度发酵方法，上述鼠李糖乳杆菌的高密度发酵方法包括以下步骤：

3、1)鼠李糖乳杆菌种子液的制备：用四区划线法将鼠李糖乳杆菌甘油菌悬液接种至mrs固体平板上，37±0.5℃厌氧培养18-24h，挑取独立的单菌落接种至装有120-150ml鼠李糖乳杆菌种子培养基的摇瓶中，37±0.5℃厌氧培养16-20h，得到鼠李糖乳杆菌一级种子液；将鼠李糖乳杆菌一级种子液以8-10％(v/v)的接种量转接至装有400-500ml鼠李糖乳杆菌种子培养基的摇瓶中，37±0.5℃厌氧培养12-14h，得到鼠李糖乳杆菌二级种子液；

4、2)鼠李糖乳杆菌发酵罐发酵：取步骤1)二级种子液，按菌液：培养基＝1:10～1:50比例接种，37℃，搅拌速度200～250rpm/min，氮气保压，罐压0.02～0.04mpa，发酵18-20h。

5、进一步的，上述步骤1)中的鼠李糖乳杆菌种子培养基的成分为：葡萄糖3.0～3.5wt％，蛋白胨1.0～2.0wt％，酵母浸粉0.2～0.6wt％，三水合磷酸氢二钾0.8～1.2wt％，六水合氯化镁0.1～0.5wt％，七水合硫酸亚铁0.02～0.12wt％，柠檬酸氢二铵0.05～0.15wt％，吐温-80 0.1～0.5wt％，四氢嘧啶0.5～1.5wt％，半胱氨酸0.5～1.5wt％，甘氨酸0.5～1.5wt％；ph为6.0～7.0，121℃灭菌30min。

6、进一步的，上述步骤2)中的培养基成分为：葡萄糖2.0～3.5wt％，蛋白胨0.8～2.0wt％，酵母浸粉0.1～0.6wt％，三水合磷酸氢二钾0.6～1.2wt％，氯化钠0.05～0.12wt％，六水合氯化镁0.1～0.5wt％，七水合硫酸亚铁0.02～0.12wt％，柠檬酸氢二铵0.05～0.15wt％，吐温-80 0.1～0.5wt％，四氢嘧啶0.5～1.5wt％，半胱氨酸0.5～1.5wt％，甘氨酸0.5～1.5wt％，ph为6.0～7.0，121℃灭菌30min。

7、优选的，上述鼠李糖乳杆菌种子培养基和步骤2)中的培养基利用naoh溶液调节ph，其中，补料为葡萄糖50％。

8、进一步的，所述补料采用恒速流加补料，流速为5～10ml/min。

9、优选的，所述发酵温度为37℃，发酵ph为6.5，二级种子液的接种量为5％。

10、相比现有技术，本发明具有以下有益效果：

11、1、本发明中用于鼠李糖乳杆菌的培养基中添加了促进生长因子四氢嘧啶、半胱氨酸、甘氨酸使得本发明的培养基比现有技术相比的活菌数更高，不仅适合鼠李糖乳杆菌菌体生长，繁殖速度快，活菌数量大，而且降低了培养基的成本。

12、2、通过流加naoh溶液来控制发酵过程中ph恒定，更有利于富集鼠李糖乳杆菌菌体。

13、3、分级扩大培养能促使菌体数量快速增加，能在短时间里得到大量的菌体，并且菌种稳定，变异、退化少。

14、4、本发明提供的鼠李糖乳杆菌培养基活菌数可达2×1010cfu/ml，远远高于普通发酵培养基的发酵效率，实现了菌株的高密度培养，为后续的鼠李糖乳杆菌产品工业化生产提供理论支持。

技术特征：

1.一种鼠李糖乳杆菌高密度发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种鼠李糖乳杆菌高密度发酵方法，其特征在于，步骤1)中的鼠李糖乳杆菌种子培养基的成分为：葡萄糖3.0～3.5wt％，蛋白胨1.0～2.0wt％，酵母浸粉0.2～0.6wt％，三水合磷酸氢二钾0.8～1.2wt％，六水合氯化镁0.1～0.5wt％，七水合硫酸亚铁0.02～0.12wt％，柠檬酸氢二铵0.05～0.15wt％，吐温-80 0.1～0.5wt％，四氢嘧啶0.5～1.5wt％，半胱氨酸0.5～1.5wt％，甘氨酸0.5～1.5wt％；ph为6.0～7.0，121℃灭菌30min。

3.根据权利要求2所述的一种鼠李糖乳杆菌高密度发酵方法，其特征在于，所述步骤2)中的培养基成分为：葡萄糖2.0～3.5wt％，蛋白胨0.8～2.0wt％，酵母浸粉0.1～0.6wt％，三水合磷酸氢二钾0.6～1.2wt％，氯化钠0.05～0.12wt％，六水合氯化镁0.1～0.5wt％，七水合硫酸亚铁0.02～0.12wt％，柠檬酸氢二铵0.05～0.15wt％，吐温-80 0.1～0.5wt％，四氢嘧啶0.5～1.5wt％，半胱氨酸0.5～1.5wt％，甘氨酸0.5～1.5wt％，ph为6.0～7.0，121℃灭菌30min。

4.根据权利要求2或3所述的一种鼠李糖乳杆菌高密度发酵方法，其特征在于，利用naoh溶液来调节培养基的ph，其中，补料为葡萄糖50％。

5.根据权利要求4所述的一种鼠李糖乳杆菌高密度发酵方法，其特征在于，所述补料采用恒速流加补料，流速为5～10ml/min。

6.根据权利要求5所述的一种鼠李糖乳杆菌高密度发酵方法，其特征在于，所述发酵温度为37℃，发酵ph为6.5，二级种子液的接种量为5％。

技术总结
本发明公开了一种鼠李糖乳杆菌高密度发酵方法，属于微生物发酵技术领域。发酵采用高密度发酵培养基，其由下述组分及配比组成：由下述组分及配比组成：葡萄糖2.0～3.5wt％，蛋白胨0.8～2.0wt％，酵母浸粉0.1～0.6wt％，三水合磷酸氢二钾0.6～1.2wt％，氯化钠0.05～0.12wt％，六水合氯化镁0.1～0.5wt％，七水合硫酸亚铁0.02～0.12wt％，柠檬酸氢二铵0.05～0.15wt％，吐温‑800.1～0.5wt％，四氢嘧啶0.5～1.5wt％，半胱氨酸0.5～1.5wt％，甘氨酸0.5～1.5wt％，余量为水。本发明以工业化生产为出发点，对具有潜在益生特性菌株鼠李糖乳杆菌高密度培养基配方和培养工艺进行优化，优化后发酵液活菌数显著提高，实现了菌株的高密度培养，为后续的鼠李糖乳酸菌产品工业化生产提供理论支持。

技术研发人员：李雪平,焦四平,杨俊岚
受保护的技术使用者：江西好实沃生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5