一种灵芝转录因子C3H-2及在灵芝酸合成中的应用和方法与流程
本发明属于分子生物学及基因工程，具体涉及一种灵芝转录因子c3h-2及在灵芝酸合成中的应用和方法。
背景技术：
1、灵芝(ganoderma lucidum)是传统的药食同源类大型真菌，具有补气安神，止咳平喘等功效。灵芝含有多种生物活性成分，具有极高的营养保健价值和经济发展前景。三萜类是灵芝中主要的生物活性次级代谢产物，其中灵芝三萜酸，简称灵芝酸(ganoderic acids，gas)，是灵芝药用功效的核心成分。研究表明，灵芝酸在肿瘤治疗、抗氧化、抑制胆固醇合成、抑制血管紧张素转换酶活性、抑制组胺释放、抗hiv等方面具有重要作用。然而，目前获得灵芝酸的主要方式是从灵芝子实体和孢子中进行提取，而灵芝中灵芝酸的含量相对较低。因此，解析灵芝酸生物合成途径及其调控机制对于培育高产灵芝酸的灵芝品种具有重要意义。
2、灵芝酸是以乙酰辅酶a为前体物质，通过甲羟戊酸途径(mevalonate pathway，mva)合成的。在mva途径中，灵芝酸合成有两个重要分支，一个分支是法尼基焦磷酸到牻牛儿基焦磷酸，另一个分支是法尼基焦磷酸到羊毛甾醇。这两个分支已克隆和报道的关键基因有fps、mvd、aact、ls、hmgr、hmgs、idi、sqs和osc基因，这些基因直接调控灵芝酸的合成，是灵芝酸合成积累的关键。其中，鲨烯合酶(squalene synthase，sqs)是催化mva途径转向三萜生物合成的第一个关键酶，也是参与灵芝酸合成代谢的关键酶。角鲨烯合成酶(squalene synthase,sqs)可催化异戊二烯途径中的碳流向三萜生物合成，sqs活性与角鲨烯等三萜化合物的产量相关，是角鲨烯等三萜类化合物合成过程中的关键酶。近年来已有研究对不同植物如人参、水稻、重楼等植物的sqs基因进行了克隆与载体构建，实现了在分子水平上探讨植物中三萜类化合物合成的机理和通过基因转化来探究基因表达的最佳条件；羊毛固醇合成酶(lss)是胆固醇合成途径中的一个关键酶，催化(s)-2,3-环氧角鲨烯转化成羊毛固醇。
3、基于以上背景，本专利通过对灵芝sqs基因和lss基因与转录因子c3h-2的相互作用机制进行研究，为灵芝酸的调控机制提供一定基础，也对培育优质灵芝新品种具有重要意义。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本发明提供了一种催化羊毛甾醇合成灵芝酸的关键转录因子c3h-2。
2、一方面，本发明提供了一种灵芝转录因子c3h-2，所述的灵芝转录因子c3h-2的核苷酸序列如seq id no.1所示，或与seq id no.1具有80％以上序列相似性的序列。
3、具体地，所述的灵芝转录因子c3h-2的核苷酸序列如seq id no.1所示，或与seqid no.1具有85％以上序列相似性的序列。
4、进一步具体地，所述的灵芝转录因子c3h-2的核苷酸序列如seq id no.1所示，或与seq id no.1具有90％以上序列相似性的序列。
5、优选地，所述的灵芝转录因子c3h-2的核苷酸序列如seq id no.1所示，或与seqid no.1具有95％以上序列相似性的序列。
6、进一步优选地，所述的灵芝转录因子c3h-2的核苷酸序列如seq id no.1所示，或与seq id no.1具有98％以上序列相似性的序列。
7、又一方面，本发明提供了一种重组载体，所述的重组载体包括前述的核苷酸序列。
8、具体地，所述的重组载体的类型包括但不限于：质粒、噬菌体或病毒。
9、进一步具体地，所述的重组载体的类型可以是质粒。
10、优选地，所述的质粒可以是pgadt7-ad或pgreenii 62-sk。
11、进一步优选地，所述的质粒为pgadt7-ad时，扩增灵芝转录因子c3h-2的引物如seqid no.5-6所示；所述的质粒为pgreenii 62-sk时，扩增灵芝转录因子c3h-2的引物如seqid no.7-8所示。
12、又一方面，本发明提供了前述的灵芝转录因子c3h-2或重组载体的细胞。
13、具体地，所述的细胞为基因工程菌。
14、进一步具体地，所述的基因工程菌包括但不限于：大肠杆菌、酵母菌、农杆菌、放线菌或丝状真菌。
15、优选地，进一步优选所述的基因工程菌可以是酵母菌或农杆菌。
16、又一方面，本发明提供了前述的灵芝转录因子c3h-2在激活灵芝sqs基因和lss基因表达中的应用。
17、又一方面，本发明提供了一种合成灵芝酸的方法，所述的方法通过前述的灵芝转录因子c3h-2或前述的重组载体或前述的细胞进行生物合成。
18、又一方面，本发明提供了前述的灵芝转录因子c3h-2或重组载体或细胞或方法在合成灵芝酸中的应用。
19、本发明所取得的技术效果：
20、(1)灵芝转录因子c3h-2通过结合灵芝sqs基因和lss基因启动子并正调控sqs和lss的表达。
21、(2)灵芝转录因子c3h-2能够调控参与灵芝酸合成代谢的关键酶基因，从而实现对灵芝中灵芝酸含量的调控。
技术特征：
1.一种灵芝转录因子c3h-2，其特征在于，所述的灵芝转录因子c3h-2的核苷酸序列如seq id no.1所示，或与seq id no.1具有80％以上序列相似性的序列。
2.一种重组载体，其特征在于，所述的重组载体包括权利要求1所述的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述的重组载体的类型为质粒、噬菌体或病毒，优选为质粒。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述的质粒为pgadt7-ad或pgreenii62-sk。
5.根据权利要求3-4任一项所述的重组载体，其特征在于，所述的质粒为pgadt7-ad时，扩增灵芝转录因子c3h-2的引物如seq id no.5-6所示；所述的质粒为pgreenii 62-sk时，扩增灵芝转录因子c3h-2的引物如seq id no.7-8所示。
6.包括权利要求1所述的灵芝转录因子c3h-2或权利要求2-5任一项所述的重组载体的细胞。
7.根据权利要求6所述的细胞，其特征在于，所述的细胞为基因工程菌；优选为大肠杆菌、酵母菌、农杆菌、放线菌或丝状真菌；进一步优选为酵母菌或农杆菌。
8.权利要求1所述的灵芝转录因子c3h-2在激活灵芝sqs基因和lss基因表达中的应用。
9.一种合成灵芝酸的方法，其特征在于，所述的方法通过权利要求1所述的灵芝转录因子c3h-2或权利要求2-5任一项所述的重组载体或6-7任一项所述的细胞进行生物合成。
10.权利要求1所述的灵芝转录因子c3h-2或权利要求2-5任一项所述的重组载体或6-7任一项所述的细胞或权利要求9所述的方法在合成灵芝酸中的应用。
技术总结
本发明属于分子生物学及基因工程技术领域，具体涉及一种灵芝转录因子C3H‑2及在灵芝酸合成中的应用和方法。本发明提供的灵芝转录因子C3H‑2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述的灵芝转录因子C3H‑2激活灵芝SQS基因和LSS基因表达，提高灵芝中灵芝酸的含量，为灵芝酸的大量生产提供技术支持。
技术研发人员：李振皓,李明焱,李俊,徐靖,陈文潇,孙伟,徐志超,彭长瑜,陈旭
受保护的技术使用者：浙江寿仙谷医药股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5