一种含微量DNA牛仔裤检材的DNA提取方法与流程

本发明涉及生物和医学检验，更具体地，涉及含微量dna牛仔裤检材dna提取，特别是指一种含微量dna牛仔裤检材的dna提取方法。

背景技术：

1、法医dna检测是公安机关刑事案件必不可缺的一部分，目前的各种刑事案件中，使用dna技术去调查线索是非常重要的手段之一，其中短串联重复序列是法医最常用的遗传标记(str)，它能够通过所得str分型去侦破案件、打拐以及出现大规模灾难后的人员身份识别等。

2、法医dna检测技术总体包括样本采集、样本提取纯化、dna扩增以及str检测等，其中微量物证检材的提取纯化对于后续操作影响重大，如引入杂质导致扩增被抑制、str荧光被干扰等，因此提取纯化时尽可能增加样本的提取效果，减少杂质引入，对于后续扩增以及str检验结果起着重大作用。

3、目前dna常用的提取方法有煮沸裂解法、离心柱法、chelex-100法、磁珠法和硅珠法等，其中煮沸裂解法会使dna出现断裂，得率低，杂质多；离心柱法则对于样本的需求量较大，损失多，无法对微量样本进行提取；chelex-100法：对于微量样本的回收灵敏度差，抗抑制干扰能力差；硅珠法，回收效率高，对于操作要求较高，否则会存在样本损失；磁珠法则通过磁力架对磁珠进行吸附，弃液简单，整体操作失误风险小，得到dna样本的回收更多，纯度更高，更有利于后续样本扩增以及str检测。

4、目前磁珠法主要由4个部分组成：1、消化细胞，使细胞膜、核膜破损，释放dna；2、创造适合磁珠吸附dna的吸附环境，使dna与磁珠结合；3、反复对磁珠进行洗涤，去除杂质；4、利用低盐环境使dna从磁珠上洗脱下来；磁珠法总体通过以上4个步骤，以此达到提取纯化dna的目的。

5、含微量dna牛仔裤检材对于提取纯化dna的一大难点就是牛仔裤样本存在大量染色剂，如靛蓝等，可与磁珠相结合，与dna存在竞争吸附，并且由于案件特殊性，不可避免会存在牛仔裤这类检材，如不能在提取纯化步骤对样本进行有效吸附洗涤，则会使本身含量较低的dna样本在扩增以及str检测时出现异常，因此提取纯化步骤中对于靛蓝等染料的吸附洗涤则是重中之重。随着法医dna技术的发展，对于牛仔裤这类实物检材dna的提取纯化需求加大，如无法得到高质量的dna产物，则无法满足对案件的检测要求。

6、针对以上情况，有必要开发一种含微量dna牛仔裤检材的提取方法。

7、因此，针对上述情况，有必要开发一种含微量dna牛仔裤检材的dna提取方法，其能够从含微量dna牛仔裤检材中有效提取纯化微量dna，提取的dna可以用于法医学鉴定，可以为案件侦破和法庭审判提供更为有效的依据。

技术实现思路

1、为了克服上述现有技术中的缺点，本发明的一个目的在于提供一种含微量dna牛仔裤检材的dna提取方法，其能够从含微量dna牛仔裤检材中有效提取纯化微量dna，提取的dna可以用于法医学鉴定，可以为案件侦破和法庭审判提供更为有效的依据，适于大规模推广应用。

2、本发明的另一目的在于提供一种含微量dna牛仔裤检材的dna提取方法，其设计巧妙，构思独特，步骤简洁，操作简便，适于大规模推广应用。

3、为达到以上目的，本发明提供一种含微量dna牛仔裤检材的dna提取方法，其特点是，包括以下步骤：

4、(1)dna消化：将含微量dna牛仔裤检材、dna消化液和蛋白酶k溶液混匀后进行消化，然后离心获得上清液；

5、(2)dna吸附：在所述上清液中加入dna吸附液和壳聚糖衍生物溶液，翻转混匀吸附，加入磁珠悬浊液，再次翻转混匀吸附，然后磁吸，弃掉所有液体，得到吸附有dna的磁珠；

6、(3)dna洗涤：对所述的吸附有dna的磁珠进行洗涤；

7、(4)dna洗脱：对所述的吸附有dna的磁珠进行洗脱，得到所述含微量dna牛仔裤检材的dna溶液。

8、较佳地，在所述步骤(1)中，所述含微量dna牛仔裤检材是2cm×2cm的含微量dna的牛仔裤布片，所述dna消化液300ul～400ul，所述dna消化液包括0.3mol/l～0.6mol/l的盐酸胍、0.2mol/l～0.6mol/l的异硫氰酸胍、4mmol/l～10mmol/l的吐温80、3mmol/l～6mmol/l的edta和20mmol/l～50mmol/l的ph8.4的tris-hcl，所述dna消化液的ph值为7.5～10，所述蛋白酶k溶液15ul～20ul，所述蛋白酶k溶液的浓度为10mg/ml～20mg/ml，所述消化采用37℃～56℃金属浴进行1h～2h，所述离心的速度为12000rpm～13300rpm，所述离心的时间为2min～4min。

9、较佳地，在所述步骤(2)中，所述dna吸附液300ul～400ul，所述dna吸附液包括5mol/l～7mol/l的异硫氰酸胍、20mmol/l～50mmol/l的ph8.4的tris-hcl和体积百分比为30％～50％的无水乙醇，所述dna吸附液的ph值为3～5，所述壳聚糖衍生物溶液50ul～100ul，所述壳聚糖衍生物溶液中壳聚糖衍生物的浓度为1wt％～3wt％，所述翻转混匀吸附的时间为15min～20min，所述磁珠悬浊液20ul～40ul，所述再次翻转混匀吸附的时间为15min～30min，所述磁吸的时间为2min～4min。

10、较佳地，在所述步骤(2)中，所述壳聚糖衍生物溶液中的壳聚糖衍生物选自壳聚糖-柠檬酸、壳聚糖-柠檬酸钠、壳聚糖-柠檬酸钾、壳聚糖-柠檬酸锶、壳聚糖-柠檬酸钙、壳聚糖-柠檬酸铝和壳聚糖-柠檬酸镁中的一种或几种。

11、较佳地，在所述步骤(2)中，所述磁珠悬浊液包括9wt％的尺寸为100nm～2000nm的二氧化硅磁性复合微粒。

12、较佳地，在所述步骤(3)中，所述洗涤的具体步骤包括：对所述的吸附有dna的磁珠采用洗涤液i进行第一次洗涤和磁吸，吸弃所有液体，采用洗涤液ii进行第二次洗涤和磁吸，吸弃所有液体，采用洗涤液iii进行第三次洗涤和磁吸，吸弃所有液体。

13、更佳地，在所述步骤(3)中，所述洗涤液i包括2mol/l～4mol/l的异硫氰酸胍、20mmol/l～50mmol/l的ph8.4的tris-hcl、体积百分比为30％～50％的无水乙醇和体积百分比为0.4％～0.8％的非离子洗涤剂，所述洗涤液i的使用量为500ul～700ul，所述洗涤液ii包括3mol/l的nacl、体积百分比为50％的无水乙醇、体积百分比为20％的异丙醇和体积百分比为30％的水，所述洗涤液ii的使用量为700ul～900ul，所述洗涤液iii包括体积百分比为60％的无水乙醇和体积百分比为40％的异丙醇，所述洗涤液iii的使用量为700ul～900ul，所述洗涤采用旋涡混匀15s～30s，所述磁吸的时间为2min～4min。

14、更进一步地，在所述步骤(3)中，所述非离子洗涤剂选自聚乙二醇叔辛基苯基醚、聚乙二醇壬基苯基醚和正辛基谷氨酸中的一种或几种。

15、较佳地，在所述步骤(4)中，所述洗脱的具体步骤包括：将所述的吸附有dna的磁珠干燥后加水混匀进行溶解，混匀磁吸后得到的液体即为所述dna溶液。

16、更佳地，在所述步骤(4)中，所述干燥采用55℃金属浴5分钟～10分钟，所述水的用量为20ul～100ul，所述溶解采用55℃金属浴10分钟～25分钟，所述磁吸的时间为2分钟～4分钟。

17、本发明的有益效果在于：

18、1、本发明的含微量dna牛仔裤检材的dna提取方法首先对牛仔裤检材进行消化，检材上消化下来的靛蓝会与dna存在竞争吸附关系，通过加入壳聚糖衍生物，在偏酸的环境下靛蓝与壳聚糖衍生物进行结合，减少靛蓝进入吸附体系含量，然后加入磁珠吸附dna，极大减少了靛蓝对于磁珠吸附dna的影响，提升样本含量，从而提升样本的检出率；可以进一步在洗涤液i中加入非离子洗涤剂，使剩余吸附在磁珠上的靛蓝染料得到有效洗涤，通过离心弃液的方式去除靛蓝杂质，减少磁珠上靛蓝染料的影响，在最大限度上减少靛蓝对于后续检测的影响，因此，其能够从含微量dna牛仔裤检材中有效提取纯化微量dna，提取的dna可以用于法医学鉴定，可以为案件侦破和法庭审判提供更为有效的依据，适于大规模推广应用。

19、2、本发明的含微量dna牛仔裤检材的dna提取方法首先对牛仔裤检材进行消化，检材上消化下来的靛蓝会与dna存在竞争吸附关系，通过加入壳聚糖衍生物，在偏酸的环境下靛蓝与壳聚糖衍生物进行结合，减少靛蓝进入吸附体系含量，然后加入磁珠吸附dna，极大减少了靛蓝对于磁珠吸附dna的影响，提升样本含量，从而提升样本的检出率；可以进一步在洗涤液i中加入非离子洗涤剂，使剩余吸附在磁珠上的靛蓝染料得到有效洗涤，通过离心弃液的方式去除靛蓝杂质，减少磁珠上靛蓝染料的影响，在最大限度上减少靛蓝对于后续检测的影响，因此，其设计巧妙，构思独特，步骤简洁，操作简便，适于大规模推广应用。

20、本发明的这些和其它目的、特点和优势，通过下述的详细说明和权利要求得以充分体现，并可通过所附权利要求中特地指出的手段、装置和它们的组合得以实现。

技术特征：

1.一种含微量dna牛仔裤检材的dna提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的含微量dna牛仔裤检材的dna提取方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，所述含微量dna牛仔裤检材是2cm×2cm的含微量dna的牛仔裤布片，所述dna消化液300ul～400ul，所述dna消化液包括0.3mol/l～0.6mol/l的盐酸胍、0.2mol/l～0.6mol/l的异硫氰酸胍、4mmol/l～10mmol/l的吐温80、3mmol/l～6mmol/l的edta和20mmol/l～50mmol/l的ph8.4的tris-hcl，所述dna消化液的ph值为7.5～10，所述蛋白酶k溶液15ul～20ul，所述蛋白酶k溶液的浓度为10mg/ml～20mg/ml，所述消化采用37℃～56℃金属浴进行1h～2h，所述离心的速度为12000rpm～13300rpm，所述离心的时间为2min～4min。

3.根据权利要求1所述的含微量dna牛仔裤检材的dna提取方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述dna吸附液300ul～400ul，所述dna吸附液包括5mol/l～7mol/l的异硫氰酸胍、20mmol/l～50mmol/l的ph8.4的tris-hcl和体积百分比为30％～50％的无水乙醇，所述dna吸附液的ph值为3～5，所述壳聚糖衍生物溶液50ul～100ul，所述壳聚糖衍生物溶液中壳聚糖衍生物的浓度为1wt％～3wt％，所述翻转混匀吸附的时间为15min～20min，所述磁珠悬浊液20ul～40ul，所述再次翻转混匀吸附的时间为15min～30min，所述磁吸的时间为2min～4min。

4.根据权利要求1所述的含微量dna牛仔裤检材的dna提取方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述壳聚糖衍生物溶液中的壳聚糖衍生物选自壳聚糖-柠檬酸、壳聚糖-柠檬酸钠、壳聚糖-柠檬酸钾、壳聚糖-柠檬酸锶、壳聚糖-柠檬酸钙、壳聚糖-柠檬酸铝和壳聚糖-柠檬酸镁中的一种或几种。

5.根据权利要求1所述的含微量dna牛仔裤检材的dna提取方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述磁珠悬浊液包括9wt％的尺寸为100nm～2000nm的二氧化硅磁性复合微粒。

6.根据权利要求1所述的含微量dna牛仔裤检材的dna提取方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，所述洗涤的具体步骤包括：对所述的吸附有dna的磁珠采用洗涤液i进行第一次洗涤和磁吸，吸弃所有液体，采用洗涤液ii进行第二次洗涤和磁吸，吸弃所有液体，采用洗涤液iii进行第三次洗涤和磁吸，吸弃所有液体。

7.根据权利要求6所述的含微量dna牛仔裤检材的dna提取方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，所述洗涤液i包括2mol/l～4mol/l的异硫氰酸胍、20mmol/l～50mmol/l的ph8.4的tris-hcl、体积百分比为30％～50％的无水乙醇和体积百分比为0.4％～0.8％的非离子洗涤剂，所述洗涤液i的使用量为500ul～700ul，所述洗涤液ii包括3mol/l的nacl、体积百分比为50％的无水乙醇、体积百分比为20％的异丙醇和体积百分比为30％的水，所述洗涤液ii的使用量为700ul～900ul，所述洗涤液iii包括体积百分比为60％的无水乙醇和体积百分比为40％的异丙醇，所述洗涤液iii的使用量为700ul～900ul，所述洗涤采用旋涡混匀15s～30s，所述磁吸的时间为2min～4min。

8.根据权利要求7所述的含微量dna牛仔裤检材的dna提取方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，所述非离子洗涤剂选自聚乙二醇叔辛基苯基醚、聚乙二醇壬基苯基醚和正辛基谷氨酸中的一种或几种。

9.根据权利要求1所述的含微量dna牛仔裤检材的dna提取方法，其特征在于，在所述步骤(4)中，所述洗脱的具体步骤包括：将所述的吸附有dna的磁珠干燥后加水混匀进行溶解，混匀磁吸后得到的液体即为所述dna溶液。

10.根据权利要求9所述的含微量dna牛仔裤检材的dna提取方法，其特征在于，在所述步骤(4)中，所述干燥采用55℃金属浴5分钟～10分钟，所述水的用量为20ul～100ul，所述溶解采用55℃金属浴10分钟～25分钟，所述磁吸的时间为2分钟～4分钟。

技术总结
本发明提供一种含微量DNA牛仔裤检材的DNA提取方法，首先对牛仔裤检材进行消化，检材上消化下来的靛蓝会与DNA存在竞争吸附关系，通过加入壳聚糖衍生物，在偏酸的环境下靛蓝与壳聚糖衍生物进行结合，减少靛蓝进入吸附体系含量，然后加入磁珠吸附DNA，极大减少了靛蓝对于磁珠吸附DNA的影响，提升样本含量，从而提升样本的检出率；可以进一步在洗涤液I中加入非离子洗涤剂，使剩余吸附在磁珠上的靛蓝染料得到有效洗涤，通过离心弃液的方式去除靛蓝杂质，减少磁珠上靛蓝染料的影响，在最大限度上减少靛蓝对于后续检测的影响。本发明能够从含微量DNA牛仔裤检材中有效提取纯化微量DNA，提取的DNA可以用于法医学鉴定。

技术研发人员：刘宇航,陈德荐,顾盼,商锐,曲英博
受保护的技术使用者：宁波市博坤生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5