一种人腺病毒多血清型Hexon嵌合抗原及其制备方法和应用与流程

本发明涉及基因重组以及免疫诊断，具体涉及一种人腺病毒多血清型hexon嵌合抗原。

背景技术：

1、腺病毒是一种无外壳的双链dna病毒，属腺病毒科，基因组全长约34.7kb，衣壳呈规则的20面体结构，直径80-110nm。核心由双股dna及蛋白质组成，外有核壳，上有252个壳粒，由240个六邻体（hexon）和12个五邻体（penton）组成。每个六邻体是六邻体蛋白的同源三聚体，三聚体的六邻体分子有一个三角形的塔尖和五面体的基底，塔区由4个环构成即loop1-loop4（l1-l4）；基底包含两个区域p1-p2区域；外无类脂质包膜。目前已知的腺病毒种类超过80个型别，分为a～g共7个血清组，每个血清组下面包含多个型别，其中大多数型别对人类有致病性，人腺病毒（hadv）感染是急性呼吸道感染的重要病原之一。腺病毒感染全年均可出现，高发于夏季和冬季，儿童和免疫力较差的成人易感。我国流行的呼吸道腺病毒主要为1-7型、11型、14型和55型，其中以7型和3型为主，分别占暴发疫情病例的62.33%和24.97%。近几年发现我国西南地区以55型腺病毒感染最为多见。近年来，不断有55型腺病毒引起的成人散发重症肺炎疫情报道，提示55型腺病毒感染已成为成人社区获得性肺炎的重要病因之一，需密切关注。针对腺病毒抗原表位研究发现腺病毒颗粒表面有3种主要的结构蛋白：六邻体蛋白、纤突蛋白和五邻体蛋白，都可以产生针对腺病毒的抗体，其中六邻体是腺病毒衣壳中最大和最丰富的蛋白，占衣壳蛋白的83%以上，具有很强的抗原性及暴露性，是型间特异性表位的主要来源。hexon氨基酸全长有7个高变区（hvr1，aa136-157；hvr2，aa181-191；hvr3，aa206-218；hvr4，aa249-260；hvr5，aa271-281；hvr6，aa303-312；hvr7，aa420-457），其中hvr1至hvr6位于大环l1上，hvr7位于大环l2上。这些高度变异区覆盖了病毒表面90%以上的区域，这些定位在外表面的高变区域也是抗原表位丰富区域，是区分不同血清型腺病毒的重要标志，因此六邻体上的表位具有型特异性，是病毒感染性疾病诊断的重要靶点，也是诊断不同血清型的标准。

2、由于感染人腺病毒亚型多，且hexon抗体具有型特异性特点，所以市场上用于人腺病毒诊断的抗原类原料有的为单一亚型，只能检出一种亚型的腺病毒，有的需要多种亚型原料不同比例混合后使用，增加了诊断试剂盒制备过程中的难度，且仍存在漏检的风险，因此需要一种可针对多种亚型抗原原料。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是：克服现有人腺病毒诊断的抗原类原料亚型单一、混合原料制备诊断试剂盒难度大等缺陷，提供一种人腺病毒多血清型hexon嵌合抗原及其制备方法和应用，其通过选取国内感染人腺病毒主要几种亚型的hexon优势、特异性抗原片段，结合多种亚型保守区域优势表位区域，将其嵌合表达制备获得抗原性强、阳性检出率高的人腺病毒抗原，并将其作为人腺病毒抗体的诊断抗原应用于检测试剂盒。

2、本人腺病毒多血清型hexon嵌合抗原所述抗原由3型、7型、55型hexon蛋白保守区优势表位区域与高变区特异性优势表位区域串联而成，所述3型hexon蛋白的优势表位包括39-81aa、103-258aa片段，其氨基酸序列分别如seq id no.3、seq id no.4所述；所述7型hexon蛋白的优势表位包括153-255aa片段，其氨基酸序列分别如seq id no.5所述；55型hexon蛋白的优势表位包括175-319aa片段，其氨基酸序列分别如seq id no.5所述。

3、进一步的，所述3型、7型、55型hexon蛋白的优势表位区域由连接肽gggs、（gggs）2、aeaaaka连接。

4、进一步的，所述抗原的氨基酸序列片段的序列如seq id no.1所述。

5、本人腺病毒多血清型hexon嵌合抗原的制备方法所述人腺病毒多血清型hexon嵌合抗原为上述的人腺病毒多血清型hexon嵌合抗原，所述制备方法包括以下步骤，

6、s1-通过对3型、7型、55型血清型人腺病毒六邻体（hexon）蛋白保守区优势表位、高变区特异性优势表位分析，选取3型hexon蛋白的39-81aa、103-258aa片段，7型hexon蛋白的153-255aa片段，55型hexon蛋白的175-319aa片段序列，并通过密码子优化获得获得翻译该氨基酸的核苷酸序列作为目的基因，通过基因合成将获得目的基因连接到原核表达载体pgex-4t-1中，成功获得重组载体pgex-4t-1-h3755；

7、s2-将步骤s1获得的重组表达载体pgex-4t-1-h3755转化至宿主菌中，筛选得到重组工程菌b/pgex-4t-1-h3755；

8、s3-将步骤s2到的重组工程菌b/pgex-4t-1-h3755进行培养并诱导表达，并对产物进行分离和纯化获得重组人腺病毒多血清型hexon嵌合抗原。

9、进一步的，步骤s1所述通过密码子优化获得目的基因的碱基序列如seq id no.2所述。

10、进一步的，步骤s2所述重组工程菌b/pgex-4t-1-h3755的宿主菌株为大肠杆菌bl21（de3）。

11、本人腺病毒多血清型hexon嵌合抗原的应用于一种胶体金检测人腺病毒抗体的试剂盒，所述人腺病毒多血清型hexon嵌合抗原为上述人腺病毒多血清型hexon嵌合抗原，以及通过上述人腺病毒多血清型hexon嵌合抗原诊断抗原制备方法所制得的人腺病毒多血清型hexon嵌合抗原；其将所述人腺病毒多血清型hexon嵌合抗原作为所述胶体金检测人腺病毒抗体的试剂盒的诊断抗原。

12、进一步的，所述胶体金检测人腺病毒抗体试剂盒的制备方法包括以下步骤，

13、s21—胶体金标记：取1ml胶体金放小玻璃杯中，搅拌加入适量的0.2mk2co3 调节ph至7.6，搅拌1min；加入20μg所述人腺病毒多血清型hexon嵌合抗原，搅拌1 min；加入100μl1％peg20000，搅拌1min；5000g离心10分钟，弃上清，沉淀用100ul胶体金稀释液重悬；充分混匀后4℃保存。将上述金标复合物用胶体金稀释液10倍稀释后均匀的涂于玻璃纤维上，37℃烘干，制成金标垫；

14、s22—硝酸纤维素膜包被：包膜稀释液配方：0.01m pb，ph7.4，质量百分比浓度为0.05%海藻糖，将检测线和质控线从下至上依次包被于nc膜上，后37℃烘30min；

15、s23—组装：将已固相化的nc膜与样品垫、s垫、金标垫、pvc底板、吸水纸、mark贴组装，用切条机切成3-4mm的试纸条。

16、进一步的，步骤s21所述胶体金稀释液组分参数为20mm pb、150mm nacl、0.1％peg20000、0.1％tritonx-100、2％sucrose、0.01％nan3。

17、本发明一种人腺病毒多血清型hexon嵌合抗原及其制备方法和应用，克服了现有人腺病毒诊断的抗原类原料亚型单一、混合原料制备诊断试剂盒难度大等缺陷，其通过选取国内感染人腺病毒主要几种亚型的hexon优势、特异性抗原片段，结合多种亚型保守区域优势表位区域，将其嵌合表达制备获得抗原性强、阳性检出率高的人腺病毒抗原，并将其作为人腺病毒抗体的诊断抗原应用于检测试剂盒。

技术特征：

1.一种人腺病毒多血清型hexon嵌合抗原，其特征是：所述抗原由3型、7型、55型hexon蛋白保守区优势表位区域与高变区特异性优势表位区域串联而成，所述3型hexon蛋白的优势表位包括39-81aa、103-258aa片段，其氨基酸序列分别如seq id no.3、seq id no.4所述；所述7型hexon蛋白的优势表位包括153-255aa片段，其氨基酸序列分别如seq id no.5所述；55型hexon蛋白的优势表位包括175-319aa片段，其氨基酸序列分别如seq id no.5所述。

2.根据权利要求1所述的人腺病毒多血清型hexon嵌合抗原，其特征是：所述3型、7型、55型hexon蛋白的优势表位区域由连接肽gggs、（gggs）2、aeaaaka连接。

3.根据权利要求2所述的人腺病毒多血清型hexon嵌合抗原，其特征是：所述抗原的氨基酸序列片段的序列如seq id no.1所述。

4.一种人腺病毒多血清型hexon嵌合抗原的制备方法，其特征是：所述人腺病毒多血清型hexon嵌合抗原为权利要求1至3任一项所述的人腺病毒多血清型hexon嵌合抗原，所述制备方法包括以下步骤，

5.根据权利要求4所述的人腺病毒多血清型hexon嵌合抗原的制备方法，其特征是：步骤s1所述通过密码子优化获得目的基因的碱基序列如seq id no.2所述。

6.根据权利要求4所述的人腺病毒多血清型hexon嵌合抗原的制备方法，其特征是：步骤s2所述重组工程菌b/pgex-4t-1-h3755的宿主菌株为大肠杆菌bl21（de3）。

7.一种人腺病毒多血清型hexon嵌合抗原的应用，其特征是：所述应用于一种胶体金检测人腺病毒抗体试剂盒，所述人腺病毒多血清型hexon嵌合抗原为权利要求1至3任一项所述的人腺病毒多血清型hexon嵌合抗原，以及通过权利要求4至6任一项所述的人腺病毒多血清型hexon嵌合抗原诊断抗原制备方法所制得的人腺病毒多血清型hexon嵌合抗原；其将所述人腺病毒多血清型hexon嵌合抗原作为所述胶体金检测人腺病毒抗体的试剂盒的诊断抗原。

8.根据权利要求7所述的人腺病毒多血清型hexon嵌合抗原的应用，其特征是：所述胶体金检测人腺病毒抗体试剂盒的制备方法包括以下步骤，

9.根据权利要求7所述的人腺病毒多血清型hexon嵌合抗原的应用，其特征是：步骤s21所述胶体金稀释液组分参数为20mm pb、150mm nacl、0.1％ peg20000、0.1％tritonx-100、2％sucrose、0.01％nan3。

技术总结
本发明涉及一种人腺病毒多血清型Hexon嵌合抗原，其由3型、7型、55型Hexon蛋白保守区优势表位区域与高变区特异性优势表位区域串联而成，所述3型Hexon蛋白的优势表位包括39‑81aa、103‑258aa片段；所述7型Hexon蛋白的优势表位包括153‑255aa片段；55型Hexon蛋白的优势表位包括175‑319aa片段。本发明还涉及该抗原的制备方法和应用。本发明通过选取国内感染人腺病毒主要几种亚型的Hexon优势、特异性抗原片段，结合多种亚型保守区域优势表位区域，将其嵌合表达制备获得抗原性强、阳性检出率高的人腺病毒抗原，并将其作为人腺病毒抗体的诊断抗原应用于检测试剂盒。

技术研发人员：李林,张百灵,邵建华,张纯瑶,杨帆,高文晓,刘万建
受保护的技术使用者：青岛汉唐生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5