一种空气芽孢杆菌QC7及其在降解黄曲霉毒素B1中的应用
本发明涉及食品加工，特别涉及一种空气芽孢杆菌qc7及其在降解黄曲霉毒素b1中的应用。
背景技术：
1、真菌毒素是曲霉类、青霉类等真菌生长繁殖产生的代谢毒物。目前已经发现400余种化学结构不同的真菌毒素，主要分为曲霉毒素、镰刀菌毒素和青霉毒素三类。其广泛存在于谷物和饲料中，全球约有25％谷物受到各种真菌毒素污染。在种植、贮藏、加工和运输过程，黄曲霉菌或寄生曲霉污染富含脂肪酸的粮食及相关食品和饲料后，会产生多种化学结构相似、具有强毒性的次生代谢产物，统称为黄曲霉毒素。黄曲霉毒素的基本结构为双呋喃环香豆素，目前共有20多种，包括b类、g类和m类等，其中黄曲霉毒素b1(aflatoxins b1，afb1)毒性最强。afb1分子式为c17h12o6，相对分子质量为312.27。在紫外线照射下呈蓝色荧光，耐高温，难溶于水，易溶于甲醇、氯仿和乙腈等极性有机溶剂。
2、afb1主要污染对象为坚果类和谷物类食品，以及植物油、香辛料和部分中药材，其毒性是氰化钾的10倍、砒霜的68倍，能引起人和动物急性中毒死亡。afb1在人体或动物体内发挥毒性作用的主要机制是afb1经细胞色素p450氧化酶作用形成活性代谢物afb1-8,9-环氧化合物(afbo)，afbo随后与dna、rna和蛋白质共价结合产生毒性。afb1还有致癌性、致畸性，黄曲霉毒素主要损害肝脏，导致出现中毒性肝炎、肝小管增生，严重的导致肝硬化、肝癌等。
3、人类的粮食及动物的饲料常被afb1污染，由于其性质稳定，因此难以去除，严重影响到了人类和动物的健康，目前主要有三类方法来脱除毒素，分别为物理方法、化学方法和生物方法。由于物理化学残留问题，生物方法被日渐关注。生物方法降解afb1也有着很大开发利用空间，因此研究生物方法降解afb1也成为现在的热门研究课题。通过微生物降解afb1更安全高效，也更环保。
技术实现思路
1、基于此，本发明提供了一种能够有效降解黄曲霉毒素b1的空气芽孢杆菌(bacillus aerius)qc7。
2、一种空气芽孢杆菌qc7，所述空气芽孢杆菌qc7保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.31025。
3、本发明还提供了一种菌株发酵液，所述菌株发酵液为上述空气芽孢杆菌qc7的发酵液。
4、本发明还提供了一种菌株发酵上清液，所述菌株发酵上清液为上述菌株发酵液去除菌体后得到。
5、本发明还提供了一种蛋白提取物，所述蛋白提取物是从上述菌株发酵上清液中提取的分子量大于3500da的蛋白质组分。
6、本发明还提供了上述空气芽孢杆菌qc7、菌株发酵液、菌株发酵上清液或蛋白提取物在降解黄曲霉毒素b1中的应用。
7、在其中一个实施例中，所述菌株发酵液的制备方法包括以下步骤：以4～6％的接种量将所述空气芽孢杆菌qc7的种子液接入初始ph为6～7的培养基，置于35～39℃、100～200r/min摇床培养24～72h。
8、在其中一个实施例中，所述培养基中含有0.01mol/l的k+离子。
9、在其中一个实施例中，所述蛋白提取物的制备方法包括以下步骤：将所述菌株发酵上清液在冰浴条件下加入硫酸铵粉末使其终浓度为50％～90％，盐析得到粗蛋白液，将所述粗蛋白液离心取沉淀后复溶，将复溶液装入截留量为3500da的透析袋中透析24～36h。
10、本发明还提供了一种降解黄曲霉毒素b1的方法，包括以下步骤：
11、将所述空气芽孢杆菌qc7接种于目标样品中，然后置于35～39℃、100～200r/min摇床避光培养24～72h。
12、在其中一个实施例中，所述目标样品为黄豆酱，所述空气芽孢杆菌qc7的菌液接种量为10％～30％；或所述目标样品为豆瓣酱，所述空气芽孢杆菌qc7的菌液接种量为30％～50％。
13、本发明的上述方案具有如下的有益效果：
14、本发明以香豆素为唯一碳源进行afb1降解菌株的初筛，从三个样品中共筛选出16株能利用香豆素生长的菌株。之后以各菌株对afb1的降解率为标准进行复筛，使用高效液相色谱法检测afb1的含量，得到菌株qc7对afb1降解率最高为86.00％。对菌株qc7进行形态鉴定、生理生化鉴定以及分子鉴定，确定qc7为空气芽孢杆菌。相较于目前已知能够降解afb1的菌株，菌株qc7降解能力较为优秀。而且通过生理生化试验，发现菌株qc7能利用多种碳源生长，且耐盐性强，表明菌株qc7生长适应性良好。筛选得到的qc7菌株也丰富了降解真菌毒素的微生物资源库，为微生物降解毒素奠定了一定的研究基础。
15、通过选择发酵时间、菌株接种量、初始ph以及afb1质量浓度四个因素进行单因素试验，通过单因素试验和正交试验，得到菌株qc7降解afb1的最优条件为发酵时间72h、初始ph 6.5、接种量5％，最高降解率为89.41％。
16、通过对比分析菌株发酵液、菌株发酵上清液以及菌体对afb1的降解能力，菌株发酵液中能够有效降解afb1的组分为发酵上清液。对菌株发酵上清液进行高温高压、蛋白酶k、十二烷基硫酸钠(sds)、edta等处理，发现上清液中降解afb1的有效成分可能是活性蛋白，并且具有良好的热稳定性。利用不同饱和度硫酸铵从发酵上清液中提取活性物质，得到的活性蛋白同样有一定降解afb1的能力，70％硫酸铵提取得到的粗酶液对afb1作用72h后，降解率为52.62％。
17、通过以不同菌液添加量与人工染毒的黄豆酱和豆瓣酱共培养，分别处理72h后，发现qc7菌液接种量为20％时，对黄豆酱中afb1最高降解率为55.03％。而当菌液接种量为40％时，对豆瓣酱中afb1最高降解率为41.08％。表明qc7在黄豆酱和豆瓣酱中对afb1也有良好的降解作用，经安全性评价后可用于实际应用生产。
技术特征：
1.一种空气芽孢杆菌qc7，其特征在于，所述空气芽孢杆菌qc7保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.31025。
2.一种菌株发酵液，其特征在于，所述菌株发酵液为权利要求1所述的空气芽孢杆菌qc7的发酵液。
3.一种菌株发酵上清液，其特征在于，所述菌株发酵上清液为权利要求2所述的菌株发酵液去除菌体后得到。
4.一种蛋白提取物，其特征在于，所述蛋白提取物是从权利要求3所述的菌株发酵上清液中提取的分子量大于3500da的蛋白质组分。
5.权利要求1所述的空气芽孢杆菌qc7、权利要求2所述的菌株发酵液、权利要求3所述的菌株发酵上清液或权利要求4所述的蛋白提取物在降解黄曲霉毒素b1中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述菌株发酵液的制备方法包括以下步骤：以4～6％的接种量将所述空气芽孢杆菌qc7的种子液接入初始ph为6～7的培养基，置于35～39℃、100～200r/min摇床培养24～72h。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述培养基中含有0.01mol/l的k+离子。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述蛋白提取物的制备方法包括以下步骤：将所述菌株发酵上清液在冰浴条件下加入硫酸铵粉末使其终浓度为50％～90％，盐析得到粗蛋白液，将所述粗蛋白液离心取沉淀后复溶，将复溶液装入截留量为3500da的透析袋中透析24～36h。
9.一种降解黄曲霉毒素b1的方法，其特征在于，包括以下步骤：
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述目标样品为黄豆酱，所述空气芽孢杆菌qc7的菌液接种量为10％～30％；或所述目标样品为豆瓣酱，所述空气芽孢杆菌qc7的菌液接种量为30％～50％。
技术总结
本发明提供了一种空气芽孢杆菌QC7及其在降解黄曲霉毒素B<subgt;1</subgt;中的应用，所述空气芽孢杆菌QC7保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.31025。本发明从青贮饲料、泡菜液以及腌酸菜中分离出能够降解AFB<subgt;1</subgt;的菌株QC7，对菌株QC7进行形态鉴定、生理生化鉴定以及分子鉴定，确定QC7为空气芽孢杆菌。相较于目前已知能够降解AFB<subgt;1</subgt;的菌株，菌株QC7降解能力较为优秀。而且通过生理生化试验，发现菌株QC7能利用多种碳源生长，且耐盐性强，表明菌株QC7生长适应性良好。筛选得到的QC7菌株也丰富了降解真菌毒素的微生物资源库，为微生物降解毒素奠定了一定的研究基础。
技术研发人员：周红丽,陶越攀,邬雨璇,周兴旺,邹谋勇
受保护的技术使用者：湖南农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5