GmROS1L基因在调控植物籽重中的应用

本发明涉及基因工程，尤其涉及gmros1l基因在调控植物籽重中的应用。

背景技术：

1、大豆(glycine max)是古四倍体演变而来的二倍体自交作物，基因组庞大，约有56000个基因，且75％的基因以同源基因的形式出现，种内遗传变异程度低，表型多。大豆的基因及表型特征暗示其中蕴藏着丰富的表观遗传学调控机制。

2、ros1作为介导主动去甲基化过程的dna去甲基化酶，可以通过dna甲基化水平的动态调控，影响转座子沉默、基因表达及染色体互作等过程，进而对植物的发育、响应生物和非生物环境刺激、果实成熟、根结瘤和其他发育过程都表现出重要作用。因此，利用基因编辑技术研究ros1基因在大豆中的功能有望为大豆植株的育种提供新途径。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供gmros1l基因在调控植物籽重中的应用，为揭示gmros1l基因的功能和培育籽重增大的植物品种提供理论基础。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了gmros1l基因在调控植物籽重中的应用，所述gmros1l基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

4、seq id no.1：gatgcactaggttttcccatactaaataattaaatgtaacctaacctaagact tttaatcgatactaaatacatttcttgaaagggaatagaagttataaagtaaattaaactagctgaggatgcatatgcaagctcatagaattttgtgaaagttctattttcttcttctctcacattcagggaaaatgatttatttttcgcataatttgccgcatatagatatatgaaatcagatctccggcattgactcgataaatctacagtaacaatattcgcatgaatttctccgattttctgcttcagcttcggttttggtcgcatggaagttcctattcaccgcgagcaaaaaacggaggtttcaactagaatcagccaatattgtttatgctgtgttgccttcttttccacacacatggtcgacaaacttttgcaatttttactttaattaaatccttttaattatctgtaattactatcttgactagcatcagctttgtcagtcaccggttgctttcagaggtaattcagaaacctacctcgattaatgttgagaaaccgcatcttgttctgtatttaatttatcttatttattgatgtttgtttccccaaaacacatttatttttctttggcaggtttgtccccgaaaatagaccttaaaattgccatctctctgaaaacagaagatgactggataaagtgtgctcttcaacggaaaattgatcactcctgaaacagtttcacgctgctattttgtttgccaaatacttttgttgaacccttttgctcaacaaagatttttctcagttctaactgagaggtctaaagcaactaaatggaggttggagaaacagagagaaacaagcttcaagggcaggttccttgggtccccaccacccctttgatgcccattcttccaaaaccagggccgatctggactcctatggagggaaaccacctatactctcattccaatgggttaacagcatgttttgaaccctcctgttgcgcagagataaacaactggtctcacccccggtcagaacctgtggttttagcctatggcaatgccaaaactcgagtaccaatatcctttgatgaaattcccagttcaagtaacggcattgctgaacttttaactcagggagatgctccatccgcatattcaaatgcaacacatgctgggttttttaaccaatttgctcatgcgtttaatgcacagttcaacccccacccgacctatgcattacttagccatcaatatcatctctctcgtgaggaaccttttgtcaacactgtccatgatcagttccaagatcttcagggtaaggtcaataaatttttgtttatgctttgcattgttttgtagcattgtattaaaacttcttcatttgagaaccatctggcacacagccagcactggcactttgcgggtgtcaattaccagcgatgtgcaccagctgaagaaagtaaaacccatacttacaaaattgaaatgtaacattgaatatgatgtttaagggtggtgcgatagaagtagtgtttggcatataaccgctgtgagaaacgaacttggatcctctcctgcctttaccgccaaaatattcatcttgcataacattctcttccctctctaattgtacaatgactaagatccttcctacatattagctggacaaaaacacctcagaagagaatccaagatcgtgagaagcaactgcagtgggaaaaacaagataaattttaactagtcattgaatagcataggcagcttctactggcttgcaaattctatcttattgagttctgttatttgaccgacttttgtgaacatcaataatgtatttttatgcttgactacacctgttgataattttttccctctccatatcacaagggtaatatttttctcctatcttattatccatcattaatgaattttgaatcagtaggccaattttgaacattttacacactttcaacatttttttatgttccttataataatcagactctaattcacatttatgtaatgtcctgtagcagacacacattttttttctgttccttataataatcagactctaattcacatttatgtaatgtcttgtagcaggcacgtcatacttttcttactgtagcaagacatttccccaaattgccccacatttagataatgccattgcagcagaaaccagacaagatgcaatgacacagatgactatagaagaaaggaaccgagagggagaagagaaaaatgtcccagcagcaaagtgcaataatccacacagcaaactctatgaccctgttacagaaattgctgctgtatctacaccacacaaggagaatcacaaccacaaggaaataagccatgattttgatctgaataaaacacctcaaccaaaaccaagaagaagaaagcaccgccccaaggtcataaaagaaggcaaatccaaaagaactagcaagcaagtcaatgcagaggttctgtcaaaagaaaagctaactgacaagagaaaggcaaggaggaaaggattgaacacaacttctactcctcaaacagaaatgacaggagaatggacaaaaccattgatgcctgaatctgccaaaaagacatgtagaaggtctttgaattttgacattggagaaccaagagatgacaattctgcatatggagaaactatgcactttggcagagacaccagtgtggtgattgaagaaacacgggcttggatgattgcccacaatggacatgaaaagagtgcaaaaacactatcaaaatcagtagcacaatcaagtccaaatgacttgaacagcacagggtcaggattacatatagttggttccaaaagaaaacaatctggtattgaacaggtagataatagcagcattaaccagattggagcacaatacaatgctgtgcaggcatactgccaaaagtattcggttcaatttccaaatgttcagaagaaaaggagaagtgaaaaggggagaatttcaaaggcatcccataaatcttccatgactgccacaaaagatgtacgactggcaacatgcccacaagaagatgctagatcacattcttatgcatcaagtctcaactgctgggcttcttctgaatataatgcagctggggtctctgtaattacagatacagaaagagctattcatgataaacctcaatcattagagtacaacttatctttagggcagaggaggccaaccaaaagaagatcaagagtccctactagaattcatgattgttctttactgaccataaccagaaactctgataccaaactagcacttactgcaaaagaaacatgcagttctgacagacaaacatctggggatgcaaaaagaccacagacatgcattgatgctttagttgcagagatgcgaggatcactcacaaaaaagaaacgaactaggaagagaagtattcctgtcaattcaaaatattcctgcacaaatgaaatgcaacagcaccataaagttgtgttggaaaatcatagcatatcacactcacacaacgcattaggtaactcaactgaatatttttttttttgggtcaataacattattgttgctatagaacaaacaattctaccaaactgtttgtcttaatactttaggtgattgatgcaggtgttgcttgtgaagacatatggaaaaacatacatactgtggacactttaaccgagcaatttgaacgtctaaacatatacagagaagccagagagattgtgttgcatgggcaaaatatgcttgtcccttataaccagcaaaatcagaagaacaagcgtcttgtccatgaatacggcaccatcattccgttcgagggcccatttgatcccataagaaaacagcgcccacgacctaaagttgaccttgatgaggagactaatagagtgtggaagcttctaatgttggatataaacagtcatgggatcaatggaacagatgaagacaaggccaaatggtgggaagatgaacgaaatgtgttccgtggacgagcagaatcatttattgcacggatgcatcttgtacaaggtatctatgatatctttcaagaatgtctatgcactattcacatacacctgacaaataaatactcacctagttgtgcttaaggaggaagaagtgagaacattatccattaggaacataccaataaatttaacaatatctgttttcctgccttacaaaaatcagctgtaaatcccacttacggaaaaccaagagacgaggaacactgaagaaattcacatgaaatataaaataatctttacaatagaccagtaggaaaatcctaatcaaattctaaaactaaaatattaggaagtcccacattgcctgcctcaattcttgaggtgcaacttatatatttgttaggcaacttcacttagtgtcaattggttttaagttgaaatctaacataaaatacattagactaaatacagaaactaaaaatattatctgaagataaagtaaactaaattatcaaaaggaataatcacaaattaacctaaatatgcttatccattctgcatcactcagtttcacagttcacgtactaatgatgtaacatacattcaacaggagacagacgcttttctccatggaaaggatcagttgtggattctgttattggagttttcctcactcaaaatgtctcggaccatctttccaggtagaaattatgcaagcattgttactcagaaacgtacatttaaaagaaacaatacatttgacttttttcccttttttgttggcagttctgcattcatgtccctggctgctcgatttcctctaaggtcaagtagtaactacaaaacatgccccgaggaaagcacaagtttggtaatcaatgagccacaagtgatcattgtggagccagaagaaaatgaaaaactggatgagaaaatatcggatcaatctgtttgtgaattgaattctatgacaatagacatcattgagcattc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5、优选的，通过抑制gmros1l基因的表达，使植物籽重增大。

6、优选的，所述植物为大豆。

7、本发明还提供了一种大豆gmros1l基因突变体植株的构建方法，包括如下步骤：

8、(1)以所述的gmros1l基因为模板，设计引物sgrna1和sgrna2并制备引物二聚化产物；

9、(2)将步骤(1)得到的引物二聚化产物与线性化载体连接后转入大肠杆菌，检测阳性克隆后提取质粒；

10、(3)将步骤(2)提取得到的质粒转入农杆菌，得到侵染液；

11、(4)用步骤(3)得到的侵染液侵染大豆子叶，经组织培养后得到籽重增大的大豆gmros1l基因突变体植株。

12、优选的，步骤(1)中所述sgrna1的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述sgrna2的核苷酸序列如seq id no.3所示。

13、优选的，步骤(2)中所述载体为psc1载体，所述大肠杆菌为大肠杆菌dh5α。

14、优选的，步骤(3)中所述农杆菌为农杆菌gv3101，所述质粒与农杆菌的质量比为0.8～1.2：8～12。

15、优选的，步骤(4)中所述侵染时在大豆子叶顶端生长点处切0.5～1.2cm后加入到侵染液中，所述侵染的时间为2.5～3.5h。

16、优选的，步骤(4)中所述组织培养包括诱导培养、伸长培养和生根培养。

17、本发明利用crispr/cas9技术对大豆同源基因gmros1l(glyma.03g190800)进行靶向编辑并成功构建了大豆gmros1l纯合突变体。本发明通过对大豆gmros1l纯合突变体和野生型大豆中gmros1l调控的甲基化水平功能进行验证并对植株表型进行分析，发现沉默gmros1l基因后可以使大豆籽重增大。本发明方法为培育籽重增大的大豆植株品种提供了理论依据。

技术特征：

1.gmros1l基因在调控植物籽重中的应用，其特征在于，所述gmros1l基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，通过抑制gmros1l基因的表达，使植物籽重增大。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述植物为大豆。

4.一种大豆gmros1l基因突变体植株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述sgrna1的核苷酸序列如seqid no.2所示，所述sgrna2的核苷酸序列如seq id no.3所示。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述载体为psc1载体，所述大肠杆菌为大肠杆菌dh5α。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述农杆菌为农杆菌gv3101，所述质粒与农杆菌的质量比为0.8～1.2：8～12。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述侵染时在大豆子叶顶端生长点处切0.5～1.2cm后加入到侵染液中，所述侵染的时间为2.5～3.5h。

9.如权利要求4～8任一项所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述组织培养包括诱导培养、伸长培养和生根培养。

技术总结
本发明提供了GmROS1L基因在调控植物籽重中的应用，属于基因工程技术领域。所述GmROS1L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，通过抑制GmROS1L基因的表达，使植物籽重增大。本发明利用CRISPR/Cas9技术对大豆同源基因GmROS1L进行靶向编辑并成功构建了大豆gmros1l纯合突变体。本发明通过对大豆gmros1l纯合突变体和野生型大豆中GmROS1L调控的甲基化水平功能进行验证并对植株表型进行分析，发现沉默GmROS1L基因后可以使大豆籽重增大。本发明方法为培育籽重增大的大豆植株品种提供了理论依据。

技术研发人员：王敏,周伟,解莉楠,陈博伟,张子辉,王立山,张永康,王杰,赵笑,贾宁,刘松涛,张庆祝
受保护的技术使用者：河北北方学院
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5