LNA1蛋白及其相关生物材料在调控玉米穗上叶数和产量中的应用

本发明属于生物，具体涉及lna1蛋白及其相关生物材料在调控玉米穗上叶数和产量中的应用。

背景技术：

1、玉米叶片数目是玉米株型的重要决定因素之一，叶片数的多少最直接地影响玉米生物量，而生物量是玉米作为饲料作物的重要参考指标。近年来不少学者和育种家致力于通过改善玉米株型、增加种植密度来提高玉米籽粒产量。叶片数的增多意味着“源”的扩张，群体光合强度的增大等等。因此，挖掘有利的控制玉米叶片数位点并揭示其分子遗传机理有利于实际生产。

2、世界人口的增加速度已经超过了粮食产量提高的速度，为了应对这一粮食安全问题，如何在有限的耕地面积基础上创造出更多的粮食产量已经成为育种学家要解决的核心问题之一。而应对这一难题的策略包括增强光合效率以及提高作物的种植密度。不同于其他作物，玉米雌雄同株异花的特点造就了玉米独有的农艺性状，基于雌穗的位置，玉米总叶片数（tln，total leaf number）由穗上叶片数（lna，leaf number above the primaryear）和穗下叶片数（lnb，leaf number below the primary ear）构成。玉米的光合效率主要取决于叶面积的大小和叶片的幼嫩程度，叶面积由单叶面积和总叶片数共同决定，而幼嫩程度主要取决于叶片发育阶段。一般来讲，玉米的穗上叶片获得的光强更强且更加幼嫩，光合生理活性更强，而穗下叶相互遮盖程度较高，叶片容易早衰。研究表明，作为主要的“源”器官，穗上叶片所含有的碳水化合物远远高于穗下叶片，在灌浆时期玉米籽粒的碳水化合物主要由穗上叶片提供，玉米穗下叶片则主要供应穗下的节与地下部分。因此，适当提高玉米的穗上叶片数可以增大密植下玉米的“源”容量即群体光合效率，从而提高玉米的产量。

技术实现思路

1、本发明的一个目的是提供lna1蛋白质的新用途。

2、本发明提供了lna1蛋白质在如下a1）-a5）中任一种中的应用：

3、a1）调控植物叶片数；

4、a2）调控植物产量；

5、a3）调控植物株高；

6、a4）培育叶片数增加和/或产量增加和/或株高增加的转基因植物；

7、a5）植物育种；

8、所述lna1蛋白质为如下(a1)-(a4)任一所述的蛋白质：

9、(a1)序列3所示的蛋白质；

10、(a2)在(a1)所述蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白；

11、(a3)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物叶片数和/或产量和/或株高相关的蛋白质；

12、(a4)来源于玉米且与(a1)具有98％以上同一性且与植物叶片数和/或产量和/或株高相关的蛋白质。

13、上述(a2)所述蛋白质中，所述标签是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白质，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。

14、上述(a3)所述蛋白质中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过9个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过8个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过7个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过6个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过5个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过4个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过3个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过2个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过1个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

15、上述(a4)所述蛋白质中，所述同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambdaratio分别设置为11，1和0.85（缺省值）并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值（%）。

16、本发明的另一个目的是提供与lna1蛋白质相关的生物材料的新用途。

17、本发明提供了与lna1蛋白质相关的生物材料在如下a1）-a5）中任一种中的应用：

18、a1）调控植物叶片数；

19、a2）调控植物产量；

20、a3）调控植物株高；

21、a4）培育叶片数增加和/或产量增加和/或株高增加的转基因植物；

22、a5）植物育种；

23、所述与lna1蛋白质相关的生物材料为编码上述lna1蛋白质的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物。

24、所述核酸分子为如下(b1)-(b2)任一所述的dna分子：

25、(b1)序列1或序列2所示的dna分子；

26、(b2)来源于玉米且与(b1)具有75％以上同一性且编码上述lna1蛋白质的dna分子。

27、本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码lna1蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的 lna1核苷酸序列75%或者更高同一性的核苷酸，只要编码lna1蛋白质且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

28、这里使用的术语“同一性”是指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75%或更高，或80%或更高，或85%或更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比（%）表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

29、所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达lna1蛋白质的dna，该dna不但可包括启动 lna1转录的启动子，还可包括终止 lna1转录的终止子。进一步的，所述表达盒还可包括增强子序列。

30、所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述重组载体可为用于表达lna1蛋白质的dna分子的载体。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（gus基因、荧光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是抗化学试剂标记基因（如抗除莠剂基因）等。

31、所述重组微生物可为含有上述核酸分子或上述表达盒或上述重组载体的酵母、细菌、藻和真菌。所述细菌具体可为农杆菌。

32、上述应用中，所述调控为提高，具体体现为：当玉米中lna1蛋白质含量提高，或 lna1基因表达量提高时，玉米的叶片数、产量和株高增加。

33、本发明还有一个目的是提供抑制lna1的物质在如下b1）-b5）中任一种中的应用：

34、b1）减少植物叶片数；

35、b2）降低植物产量；

36、b3）降低植物株高；

37、b4）培育叶片数减少和/或产量降低和/或株高降低的转基因植物；

38、b5）植物育种；

39、所述抑制lna1的物质可为降低植物中lna1蛋白质活性和/或含量的物质，或抑制植物中 lna1基因表达的物质，或敲除植物中 lna1基因的物质。

40、进一步的，所述降低lna1蛋白质活性的物质可为抑制lna1蛋白质功能的蛋白质、多肽或小分子化合物。

41、所述降低lna1蛋白质含量的物质可为抑制lna1蛋白质合成或促进lna1蛋白质降解或敲低（敲减）或敲除lna1蛋白质编码基因的物质。

42、所述抑制植物中 lna1基因表达的物质可为任何能够抑制或干扰上述lna1蛋白质编码基因表达的物质，如grna（如sgrna）、mrna、sirna、dsrna、shrna、mirna、反义rna等。

43、所述敲除植物中 lna1基因的物质可为以任何方式实现宿主细胞不产生 lna1基因的功能性蛋白质产物的物质，具体方式如去除全部或部分编码基因序列、引入突变使得不产生功能性蛋白质、去除或改变调节组分（例如启动子编辑）使得编码基因序列不被转录、通过与mrna的结合阻止翻译等。通常，敲除在基因组dna水平上进行，使得细胞的后代也永久地携带敲除。

44、更进一步的，所述敲除植物中 lna1基因的物质可为crispr/cas9基因编辑系统。所述crispr/cas9基因编辑系统表达cas9蛋白和sgrna。

45、在一些实施方案中，所述sgrna的靶序列如序列4所示。

46、本发明还有一个目的是提供一种培育叶片数增加和/或产量增加和/或株高增加的转基因植物的方法。

47、本发明提供的培育叶片数增加和/或产量增加和/或株高增加的转基因植物的方法包括提高受体植物中lna1蛋白质的含量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的叶片数和/或产量和/或株高高于所述受体植物。

48、进一步的，所述提高受体植物中lna1蛋白质的含量和/或活性的方法为在受体植物中过表达lna1蛋白质的编码基因。

49、所述过表达的方法为将lna1蛋白质的编码基因导入受体植物。

50、更进一步的，所述lna1蛋白质的编码基因通过重组表达载体导入受体植物。所述重组表达载体为将pbecxun-myc载体中的两个xcmi酶切位点之间的片段替换为序列2所示的 lna1基因cds片段，且保持pbecxun-myc载体其他序列不变后得到的载体。

51、本发明还有一个目的是提供一种培育叶片数减少和/或产量降低和/或株高降低的转基因植物的方法。

52、本发明提供的培育叶片数减少和/或产量降低和/或株高降低的转基因植物的方法包括降低受体植物中lna1蛋白质的含量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的叶片数和/或产量和/或株高低于所述受体植物。

53、进一步的，所述降低受体植物中lna1蛋白质的含量和/或活性的方法为将上述抑制lna1的物质导入受体植物。

54、更进一步的，所述抑制lna1的物质为将序列4所示的dna分子连入pxue411c载体的酶切位点bsai位置处，且保持pxue411c载体其他序列不变后得到的载体。

55、本发明最后一个目的是提供一种转基因植物的制备方法。

56、本发明提供的转基因植物的制备方法为如下1）-3）中任一种：

57、1）用序列5所示的dna分子替换玉米基因组中 lna1基因上的序列4所示的dna分子，得到转基因植物；

58、2）用序列6所示的dna分子替换玉米基因组中 lna1基因上的序列4所示的dna分子，得到转基因植物；

59、3）用序列7所示的dna分子替换玉米基因组中 lna1基因上的序列4所示的dna分子，得到转基因植物；

60、所述转基因植物的叶片数和/或产量和/或株高低于所述受体植物。

61、进一步的，所述1）-3）中的替换均为纯合型替换，即同源染色体中发生相同的替换。

62、上述任一所述应用或方法中，所述叶片数可为穗上叶片数和/或总叶片数。

63、上述任一所述应用或方法中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为玉米。所述玉米具体可为玉米自交系lh244。

64、本发明首先在野生型玉米中过表达 lna1，得到转 lna1基因玉米并对其叶片数进行统计分析发现：过表达 lna1可增加玉米穗上叶片数和总叶片数。为了进一步验证lna1的功能，本发明敲除了野生型玉米中的 lna1，得到 lna1敲除玉米并对其叶片数和株高进行统计分析发现：敲除 lna1可减少玉米穗上叶片数和株高。此外，本发明还通过构建nil-popcorn和nil-ms71证明了提高 lna1基因表达量可增加玉米产量。以上结果说明：lna1蛋白质及其相关生物材料可调控植物叶片数、产量和株高，将在培育高产小麦品种中发挥重要的作用。

技术特征：

1.lna1蛋白质在如下a1）-a5）中任一种中的应用：

2.与权利要求1中所述lna1蛋白质相关的生物材料在如下a1）-a5）中任一种中的应用：

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述核酸分子为如下(b1)-(b2)任一所述的dna分子：

4.抑制lna1的物质在如下b1）-b5）中任一种中的应用：

5.根据权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于：所述叶片数包括穗上叶片数和/或总叶片数。

6.一种培育叶片数增加和/或产量增加和/或株高增加的转基因植物的方法，包括提高受体植物中权利要求1中所述lna1蛋白质的含量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的叶片数和/或产量和/或株高高于所述受体植物。

7.一种培育叶片数减少和/或产量降低和/或株高降低的转基因植物的方法，包括降低受体植物中权利要求1中所述lna1蛋白质的含量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的叶片数和/或产量和/或株高低于所述受体植物。

8.一种转基因植物的制备方法，为如下1）-3）中任一种：

9.根据权利要求6-8任一所述的方法，其特征在于：所述叶片数包括穗上叶片数和/或总叶片数。

10.根据权利要求1-5任一所述的应用或权利要求6-9任一所述的方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物；和/或，所述单子叶植物为玉米。

技术总结
本发明公开了LNA1蛋白及其相关生物材料在调控玉米穗上叶数和产量中的应用。本发明首先在野生型玉米中过表达lna1，得到转lna1基因玉米并对其叶片数进行统计分析发现：过表达lna1可增加玉米穗上叶片数和总叶片数。为了进一步验证LNA1的功能，本发明敲除了野生型玉米中的lna1，得到lna1敲除玉米并对其叶片数和株高进行统计分析发现：敲除lna1可减少玉米穗上叶片数和株高。此外，本发明还通过构建NIL‑Popcorn和NIL‑MS71证明了提高lna1基因表达量可增加玉米产量。以上结果说明：LNA1蛋白质及其相关生物材料可调控植物叶片数、产量和株高，将在培育高产小麦品种中发挥重要的作用。

技术研发人员：林中伟,李艳
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5