一种肿瘤组织解离液、解离肿瘤组织的方法及其在培养肿瘤类器官中的应用与流程

本发明涉及类器官培养，具体涉及一种肿瘤组织解离液、解离肿瘤组织的方法及其在培养肿瘤类器官中的应用。

背景技术：

1、癌症是全球范围内导致死亡的主要原因之一。肿瘤组织的分离纯化是肿瘤研究和治疗中的关键步骤。通过有效的组织分离方法，可以获得高质量的细胞样本，为后续的基因分析、药物筛选和个性化治疗提供可靠的基础。传统的组织分离方法通常涉及机械解离和酶解处理，虽然能够获取细胞，但往往会破坏细胞的生物学特性，影响后续的研究结果。

2、随着对肿瘤生物学特性的不断深入研究，传统的二维细胞培养模型逐渐暴露出其局限性，难以真实地模拟体内肿瘤微环境。类器官技术是近年来发展起来的一种新型三维培养方法，具有自我更新和自我组织的能力，是研究组织器官发育、疾病机制和药物筛选的重要工具。类器官技术的出现为肿瘤研究提供了一种新的三维细胞培养方法，能够更真实地反映肿瘤的复杂结构和功能。

3、因此，研究肿瘤组织高效解离和细胞纯化的方法，以获得数量更多杂质更少的肿瘤细胞，再结合类器官培养构建方法将其培养为特定类型的类器官，具有重要的意义。

技术实现思路

1、本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

2、因此，本发明第一方面提供一种肿瘤组织解离液。根据本发明的实施方案，所述组织解离液包括基础培养基组分、抗氧化组分、解离酶和添加剂，其中，所述抗氧化组分包含牛磺酸、超氧化物歧化酶和维生素e中的至少之一。根据本发明实施例的肿瘤组织解离液解离肿瘤组织的效率较高，且本技术筛选获得的抗氧化物质能够充分保障肿瘤细胞的活性，该解离液在后续细胞培养、肿瘤类器官的培养中具有重要作用。

3、根据本发明的实施方案，上述肿瘤组织解离液还可以包括下列附加技术特征中的至少之一：

4、根据本发明的实施方案，所述牛磺酸的浓度为1-50 μm，优选为5-20 μm，进一步优选为10 μm。

5、根据本发明的实施方案，所述超氧化物歧化酶的浓度为0-100 nm，优选为20-80nm，进一步优选为50 nm。

6、根据本发明的实施方案，所述维生素e的浓度为0-100 nm，优选为20-80 nm，进一步优选为50 nm。

7、本技术经过筛选优化后发现，添加上述抗氧化成分并使其浓度在上述浓度范围内能够保护细胞免受氧化损伤，维持细胞内氧化还原平衡，减少解离过程中肿瘤细胞的死亡，此外，抗氧化成分能够减少细胞解离过程中的氧化应激，从而提高细胞解离的效率，更加有效的保障肿瘤细胞的健康和活性，使获得的肿瘤细胞能够更适合于后续研究。

8、根据本发明的实施方案，所述解离酶包括胶原蛋白水解酶、中性蛋白酶和脱氧核糖核酸酶中的至少之一。

9、解离酶是一类能够分解细胞间质中的大分子物质，从而使细胞分散的酶类。在本技术中，解离酶用于从肿瘤组织中分离出单细胞，以便进行后续的细胞培养或其他实验操作。基于本技术中使用的组织的类型、细胞外基质的组成以及后续对肿瘤单细胞的具体需求进行组织解离酶成分和浓度的优化和筛选，获得的酶及其浓度可以更有效地分离出单细胞，同时保持细胞的活性和功能。

10、根据本发明的实施方案，所述胶原蛋白水解酶的浓度为30-100 u/ml，优选为40-80 u/ml，进一步优选为70 u/ml。胶原蛋白水解酶（胶原酶）是一种能够特异性识别并水解胶原蛋白中的特定序列的酶。它在细胞培养、肿瘤研究等领域有着重要的作用，本技术所述的胶原酶的类型并不受特别限制，包括i型、ii型、iii型和iv型中的至少之一，它们可以通过配比用于不同类型组织样本的解离。

11、根据本发明的实施方案，所述中性蛋白酶的浓度为70-200 μg/ml，优选为100~150μg/ml，进一步优选为120 μg/ml。中性蛋白酶是一种非特异性金属蛋白酶，它对细胞损伤小，能维持细胞膜完整性，且不受温度、ph及血清组分的影响，本技术将其用于从肿瘤组织中分离单细胞，本领域技术人员可知，其也可以用于后续细胞培养，如原代细胞的分离，细胞传代等。

12、根据本发明的实施方案，所述脱氧核糖核酸酶的浓度为1000~5000 u/ml，优选为2000~4000 u/ml，进一步优选为3000 u/ml。脱氧核糖核酸酶是一种内切酶，它优先分裂与嘧啶核苷酸相邻的磷酸二酯键，产生5'-磷酸端多核苷酸，在3'位置有一个游离羟基，该酶可以去除细胞培养过程中的dna污染。

13、根据本发明的实施方案，所述添加剂包括hepes、牛血清白蛋白和y27632中的至少之一。

14、根据本发明的实施方案，所述hepes的浓度为5-15 mm，优选为8-12 mm，进一步优选为10 mm。所述hepes为氢离子缓冲剂。hepes能够在肿瘤细胞内外环境中提供稳定的ph环境，有利于细胞的正常生长和代谢。在肿瘤组织解离过程中，这种稳定的ph环境有助于保护细胞结构和功能，减少因ph波动引起的细胞损伤。

15、根据本发明的实施方案，所述牛血清白蛋白的质量百分比为0.5%-5%，优选为0.5%-3%，进一步优选为1%。牛血清白蛋白（bovine serum albumin，bsa）不仅能够减少解离过程中细胞受到的损伤，还能够作为酶的反应稳定剂，防止酶的分解和非特异性吸附，提高酶的稳定性和切割效率，bsa的浓度需要适宜，过高的浓度可能会抑制消化酶的活性。

16、根据本发明的实施方案，所述y27632的浓度为5-20 μm，优选为5-15 μm，进一步优选为10 μm。所述y27632是一种高效、选择性、atp竞争性的抗凋亡因子rock抑制剂，y27632在组织解离中能够通过抑制rock的活性，减少细胞失巢凋亡，促进细胞增殖，维持细胞功能，保护细胞免受解离过程中的损伤，以及调节细胞骨架，从而提高解离后细胞的存活率和功能。

17、根据本发明的实施方案，所述添加剂进一步包括抗菌成分。

18、根据本发明的实施方案，所述抗菌成分为抗生素。通过添加抗生素能够有效防止细菌和真菌污染。

19、根据本发明的实施方案，所述抗生素包括庆大霉素、两性霉素、青霉素和链霉素中的至少之一。

20、根据本发明的实施方案，所述庆大霉素的浓度为50-500 μg/ml，优选为50-200 μg/ml，进一步优选为100 μg/ml。

21、根据本发明的实施方案，所述两性霉素的浓度为1-5 μg/ml，优选为1-3μg/ml，进一步优选为2.5μg/ml。

22、根据本发明的实施方案，所述青霉素的浓度为50-500 u/ml，优选为50-200 u/ml，进一步优选为100 u/ml。

23、根据本发明的实施方案，所述链霉素的浓度为50-500 μg/ml，优选为50-200 μg/ml，进一步优选为100 μg/ml。

24、根据本发明的实施方案，所述基础培养基包括选自advanced dmem/f12、ham’s f-12、silac advanced dmem/f-12 flex、dmem/f-12、william's e培养基中的任意一种。

25、在本发明的第二方面，本发明提出了第一方面所述的肿瘤组织解离液在解离肿瘤组织中的用途，所述肿瘤组织包括肺腺癌组织、结直肠癌组织和乳腺癌组织中的至少之一。根据本发明实施例的肿瘤组织解离液解离肿瘤组织的效率较高，且本技术筛选获得的抗氧化物质能够充分保障肿瘤细胞的活性，该解离液在后续细胞培养、肿瘤类器官的培养中具有重要作用，且操作方法简单、效果稳定。

26、在本发明的第三方面，本发明提出了第一方面所述的肿瘤组织解离液在培养肿瘤类器官中的用途，所述肿瘤类器官包括肺腺癌类器官、结直肠癌类器官和乳腺癌类器官中的至少之一。根据本发明实施例的肿瘤组织解离液能够有效的应用于类器官的培养过程中，即该培养类器官结合了高效的组织分离技术和类器官培养技术，不仅提高了细胞活性和分离效率，还减少了细胞损伤，再通过本技术获得的类器官构建方法，成功模拟了体内肿瘤的三维结构和生物学特性。根据本发明的具体实施方案，利用本技术所述的肿瘤组织解离液能够有效解离肺腺癌、结直肠癌和乳腺癌组织，并将解离后获得的单细胞成功培养为肺腺癌类器官、结直肠癌类器官和乳腺癌类器官。

27、根据本发明的实施方案，所述用途包括：

28、（a）利用第一方面所述的肿瘤组织解离液对肿瘤组织进行解离，以获得肿瘤细胞团或单细胞；

29、（b）将所述肿瘤细胞团或单细胞于双层套筒滤网中进行过滤，以获得过滤后的单细胞沉淀；

30、（c）将所述单细胞沉淀于肿瘤类器官培养基中进行培养，以获得所述肿瘤类器官。

31、在本发明的第四方面，本发明提出了一种解离肿瘤组织的方法。根据本发明的实施方案，所述方法包括：将待解离的所述肿瘤组织在第一方面所述的肿瘤组织解离液中进行解离。如前所述，根据本发明实施例的肿瘤组织解离液解离肿瘤组织的效率较高，且本技术筛选获得的抗氧化物质能够充分保障肿瘤细胞的活性，该解离液在后续细胞培养、肿瘤类器官的培养中具有重要作用，且该方法操作简单、效果稳定。

32、根据本发明的实施方案，上述解离肿瘤组织的方法还可以包括下列附加技术特征中的至少之一：

33、根据本发明的实施方案，所述肿瘤组织预先进行洗涤处理和/或剪切处理。

34、根据本发明的实施方案，所述洗涤处理是利用基础培养基进行洗涤的，洗涤次数为2~5次，优选为3次。

35、根据本发明的实施方案，所述基础培养基包括选自advanced dmem/f12、ham’s f-12、silac advanced dmem/f-12 flex、dmem/f-12、william's e培养基中的任意一种。

36、根据本发明的实施方案，所述解离是在37℃、震荡条件下进行的。

37、根据本发明的实施方案，所述解离的时间为5-10 min。

38、在本发明的第五方面，本发明提出了一种构建肿瘤类器官的方法。根据本发明的实施方案，所述方法包括：

39、（a）利用第四方面所述的方法对肿瘤组织进行解离，以获得肿瘤细胞团或单细胞；

40、（b）将所述肿瘤细胞团或单细胞于双层套筒滤网中进行过滤，以获得过滤后的单细胞沉淀；

41、（c）将所述单细胞沉淀于肿瘤类器官培养基中进行培养，以获得所述肿瘤类器官。

42、根据本发明实施例的方法不仅结合了第四方面所述的高效的组织分离技术，还使用了本技术自行设计的双层套筒滤网和类器官培养技术，能够一次性去除免疫细胞，不仅提高了细胞活性和分离效率，还减少了肿瘤细胞损伤，再通过本技术获得的类器官构建方法，成功模拟了体内肿瘤的三维结构和生物学特性。

43、根据本发明的实施方案，所述双层套筒滤网包括上层滤网和下层滤网，其中，所述上层滤网中滤孔的直径为50-100 μm，所述下层滤网中滤孔的直径为10-40 μm。

44、根据本发明的实施方案，所述上层滤网中滤孔的直径为60-80 μm，所述下层滤网中滤孔的直径为10-30 μm。

45、根据本发明的实施方案，所述上层滤网中滤孔的直径为70 μm，所述下层滤网中滤孔的直径为20 μm。

46、所述双层套筒滤网采用套筒设计，上小下大，可拆卸组装，为本技术自行设计的一种的装置，具体的结构参考图1。从肿瘤组织解离出的细胞包括肿瘤细胞团、淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、红细胞和免疫细胞等，不同种类的细胞尺寸大小不同，肿瘤细胞团块直径40-60 μm，淋巴细胞直径一般在6-10 μm之间；单核细胞直径约为12-20 μm，粒细胞直径在12-18 μm左右，红细胞7 μm，免疫细胞10-18 μm，该套筒上层滤网能去除未解离完全的组织块和大的细胞杂质，保证分离出的细胞得率，下层滤网能去除细胞中的红细胞和各种免疫相关细胞，保证分离的细胞纯度，该套筒设计，能一次性分离纯化出肿瘤细胞，大幅提高实验效率。

47、根据本发明的实施方案，所述肿瘤类器官包括任意一种肿瘤的类器官。本领域技术人员可以理解，肿瘤组织的结构以及组成成分差异并不大，在结构和组成成分相似的情况下，基于本技术验证的效果，所述肿瘤组织解离液可以解离的肿瘤并不受特别限制。

48、根据本发明的一些具体实施方案，所述肿瘤类器官包括肺腺癌类器官、结直肠癌类器官和乳腺癌类器官中的至少之一。

49、根据本发明的实施方案，所述培养是在37℃、5％ co2条件下进行的。

50、本发明的有益效果至少包括：

51、（1）本发明中所提及的肿瘤组织解离的方法，简单、稳定、在组织解离步骤中，在解离液中添加的抗氧化物质能够充分保障肿瘤细胞的活性，得到活性更高的肿瘤细胞。

52、（2）本发明中提出的构建肿瘤类器官的方法，结合了高效的组织分离、纯化技术和类器官培养技术，不仅提高了细胞活性和分离效率，还减少了细胞损伤，为肿瘤研究和个性化治疗提供了高效、精准的工具。通过优化的组织解离液和纯化方式，保证了细胞的高活性和高纯度；通过科学的类器官构建方法，成功模拟了体内肿瘤的三维结构和生物学特性。本发明的应用将极大地推动癌症基础研究和临床转化研究的发展，为开发新的癌症治疗策略提供重要支持。

53、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

技术特征：

1.一种肿瘤组织解离液，其特征在于，所述组织解离液包括基础培养基组分、抗氧化组分、解离酶和添加剂，其中，所述抗氧化组分包含牛磺酸、超氧化物歧化酶和维生素e中的至少之一。

2.根据权利要求1所述的肿瘤组织解离液，其特征在于，所述牛磺酸的浓度为1-50 μm；和/或

3.根据权利要求1所述的肿瘤组织解离液，其特征在于，所述解离酶包括胶原蛋白水解酶、中性蛋白酶和脱氧核糖核酸酶中的至少之一；和/或

4.根据权利要求1所述的肿瘤组织解离液，其特征在于，所述添加剂包括抗菌成分。

5.根据权利要求3所述的肿瘤组织解离液，其特征在于，所述胶原蛋白水解酶的浓度为30-100 u/ml；和/或

6.根据权利要求3所述的肿瘤组织解离液，其特征在于，所述hepes的浓度为5-15 mm；和/或

7.根据权利要求4所述的肿瘤组织解离液，其特征在于，所述抗菌成分为抗生素。

8.根据权利要求7所述的肿瘤组织解离液，其特征在于，所述抗生素包括庆大霉素、两性霉素、青霉素和链霉素中的至少之一。

9.权利要求1-8中任一项所述的肿瘤组织解离液在解离肿瘤组织中的用途，所述肿瘤组织包括肺腺癌组织、结直肠癌组织和乳腺癌组织中的至少之一。

10.权利要求1-8中任一项所述的肿瘤组织解离液在培养肿瘤类器官中的用途，所述肿瘤类器官包括肺腺癌类器官、结直肠癌类器官和乳腺癌类器官中的至少之一。

11.一种解离肿瘤组织的方法，其特征在于，所述方法包括：将待解离的所述肿瘤组织在权利要求1-8中任一项所述的肿瘤组织解离液中进行解离。

12.一种构建肿瘤类器官的方法，其特征在于，包括：

13.根据权利要求12所述构建肿瘤类器官的方法，其特征在于，所述双层套筒滤网包括上层滤网和下层滤网，其中，所述上层滤网中滤孔的直径为50-100 μm，所述下层滤网中滤孔的直径为10-40 μm。

14.根据权利要求13所述构建肿瘤类器官的方法，其特征在于，所述肿瘤类器官包括肺腺癌类器官、结直肠癌类器官和乳腺癌类器官中的至少之一。

技术总结
本发明涉及类器官培养技术领域。本发明提供一种肿瘤组织解离液、解离肿瘤组织的方法及其在培养肿瘤类器官中的应用，所述组织解离液包括基础培养基组分、抗氧化组分、解离酶和添加剂，其中，所述抗氧化组分包含牛磺酸、超氧化物歧化酶和维生素E中的至少之一。所述肿瘤组织解离液是优化获得的，该组织解离液对多种肿瘤组织具有较高的细胞分离效率，能够有效保证细胞的活性、减少细胞损伤，在此基础上结合本申请自行设计的双层套筒滤网对解离后的产物进行过滤，并使用合适的类器官培养方法和条件，能够成功获得多种肿瘤类器官，本发明的应用将极大地推动癌症基础研究和临床转化研究的发展，为开发新的癌症治疗策略提供重要支持。

技术研发人员：赵冰,倪超,关钰波,王新月
受保护的技术使用者：山东伯桢生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5