用于非小细胞肺癌诊断的细胞外囊泡生物标志物及其应用
本发明属于生物，尤其涉及一种用于非小细胞肺癌诊断的细胞外囊泡生物标志物及其应用。
背景技术：
1、肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，2022年引起约182万人死亡。非小细胞肺癌（nsclc）约占所有肺癌病例的80%-90%，最常见的亚型是肺腺癌（luad）和肺鳞癌（lusc）。尽管近年来在诊断技术、靶向治疗和免疫治疗方面取得了进展，但nsclc的5年总体生存率仍然不尽人意。肺癌在诊断时多数为晚期，极大影响了治疗和预后。对于高风险个体而言，早期检测至关重要，因为它可以大大改善临床结果。体检筛查可以有效提高癌症早期检测率，并降低高风险人群进展至中晚期的发生率。
2、肿瘤生物标志物是指在肿瘤发生发展的过程中，由肿瘤细胞合成、释放，以及机体对肿瘤反应而产生的一些物质。这些物质存在于体液循环中，随着疾病进展呈现动态变化，能够提示肿瘤发生、发展，可以用于肿瘤诊断、预后判断和治疗监测。目前广泛应用于非小细胞肺癌临床诊断的标志物主要是血清/血浆中的肿瘤相关抗原，包括癌胚抗原、细胞角蛋白片段19，鳞状上皮细胞癌抗原等。尽管这些标志物作为辅助诊断在临床应用中已经广泛开展，但是肿瘤的早期诊断依然具有巨大的挑战，同时受到巨大的关注。主要原因是，在肿瘤的早期阶段，肿瘤标志物的丰度非常低，精准地对这些标志物进行检测定量存在技术上的难题，即使随着技术的进步，这些检测项目也存在卫生经济学窘境。其次，目前尚无癌肿特异性的肿瘤标志物，仅仅只能在一定程度上发挥辅助诊断的作用，对于判断原发灶和转移灶，以及监测治疗效果，发挥的功能实在有限。因此，肿瘤标志物在临床上的应用仍限于肿瘤的辅助诊断、疗效和预后评价。但是，对于不得不进行侵入性检查的癌肿，开发血浆/血清肿瘤标志物又具有重大价值，不仅能够减轻患者的痛苦，还利于疾病普筛，能够惠及更多人。
3、非小细胞肺癌在临床上诊断主要依据为 ct 为主的影像学和病理学。开发血液学检测以检测循环中肿瘤物质，即所谓的“液体活检”，目前是一个活跃的研究领域。液体活检包括一系列非侵入性生物标志物，如循环肿瘤细胞（circulating tumor cells, ctcs），循环肿瘤dna（circulating tumor dna, ctdna），循环自身抗体（circulatingautoantibodies）和细胞外囊泡（extracellular vesicles, evs）。这类微创性生物标志物允许持续监测肿瘤动态，包括早期出现的治疗抗性、治疗后疾病残留和疾病复发等。越来越多的研究关注各类生物标志物应用于肿瘤的诊断和预后的潜力，与其他循环中的生物标志物相比，由于细胞外囊泡的丰度、稳定性和多样化的表达谱，细胞外囊泡发挥出更加优异的表现。
4、细胞外囊泡是由细胞释放的亚微米或微米尺寸的物质，在细胞间通信中发挥着关键作用。肿瘤细胞来源的细胞外囊泡（tumor cell-derived extracellular vesicles,tdevs）携带能够影响肿瘤微环境和免疫系统的生物活性分子，可能导致不利的肿瘤进展。细胞外囊泡分子表达谱的研究表明其内容物与亲本细胞非常相似。因此，tdevs作为一种非侵入性肿瘤诊断和预后评估的 “液体活检”受到了相当大的关注。体液中含有来自不同细胞来源的异质性细胞外囊泡混合物，而tdevs仅仅是循环细胞外囊泡中很小的一部分。为了将tdevs作为肿瘤细胞或循环肿瘤细胞的可靠替代物应用于临床研究，从由非恶性细胞产生的大量囊泡中分离出tdevs至关重要。该步骤需确保得到的细胞外囊泡来源于肿瘤细胞，而不是身体中的其他类型细胞。然而，鉴于体液中细胞外囊泡的异质性，开发稳健的分离和鉴定方法以确保特异且准确地识别tdevs非常重要。在这一领域持续的研究和技术进步将有助于将tdevs作为癌症疾病诊断和健康管理中有价值的生物标志物进行临床转化。
5、在实现本发明的过程中，发明人发现在现有技术中至少存在以下问题：体液中含有来自不同细胞来源的异质性细胞外囊泡混合物，而tdevs仅仅是循环细胞外囊泡中很小的一部分。然而，由于来自非肿瘤细胞的细胞外囊泡的干扰，使用总细胞外囊泡进行诊断和预后评估一直面临挑战。另一方面，分析癌症患者血浆细胞外囊泡的分子表达谱可以发现潜在的生物标志物。可是，这种方法无法明确这些分子是源于肿瘤，这一点在寻找用于治疗监测的生物标志物时至关重要。因为当研究目标是用于治疗监测的生物标志物时，抗癌治疗不仅影响肿瘤细胞，也可能影响非恶性细胞。
技术实现思路
1、基于上述问题，本发明一方面提供一种用于非小细胞肺癌诊断的血清/血浆细胞外囊泡七种蛋白质标志物，所述标志物为mvp、gys1、serpina3、hectd3、serping1、tpm4和apod。
2、本发明的另一方面还提供一种血清/血浆细胞外囊泡七种蛋白质标志物的检测试剂盒。所提供的用于非小细胞肺癌诊断的血清/血浆细胞外囊泡7个蛋白质标志物的检测试剂盒包含由7个蛋白质构成的混淆矩阵诊断模型，还可以包括蛋白质组学常用的酶和试剂，如胰酶，缓冲液等；还可以含有标准品和/或对照品。所述标志物为mvp、gys1、serpina3、hectd3、serping1、tpm4和apod。
3、优选的，上述蛋白质的定量方法可以为本领域常用方法，如酶联免疫吸附测定（elisa）、比色法、荧光法或lc-ms/ms中的一种或多种。
4、更优选的，选择lc-ms/ms对蛋白标志物进行定量。
5、另一方面，本发明还提供上述试剂盒的用途，可以通过检测血浆/血清细胞外囊泡中上述蛋白质的水平而对高危人群进行nsclc的筛查，用于通过检测血浆/血清细胞外囊泡中上述蛋白质的水平而对患者的预后进行判断。或用于检测血浆/血清中上述蛋白质的水平而判断对nsclc的手术、药物治疗等是否有效或何时停止治疗。
技术特征：
1.一种用于非小细胞肺癌诊断的蛋白质生物标志物，其特征在于，包含如下蛋白：mvp、gys1、serpina3、hectd3、serping1、tpm4和apod。
2.根据权利要求1所述的标志物，其样本来源于血浆或血清细胞外囊泡。
3.一种用于非小细胞肺癌诊断的试剂盒，其包含检测权利要求1所述标志物表达量的试剂。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其还包含蛋白质组学常用的酶和试剂，以及标准品和/或对照品。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，所述标志物的表达量测定使用酶联免疫吸附法（elisa）、比色法、荧光法或lc-ms/ms中的一种或多种。
6.权利要求3-5任一项所述的试剂盒在制备诊断非小细胞肺癌中产品的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其样本来源于血浆或血清细胞外囊泡。
8.根据权利要求6所述的应用，其包含如下步骤：
9.权利要求6所述的应用，其包括通过检测血浆或血清细胞外囊泡中上述蛋白质的水平而对判断对nsclc的手术、药物治疗是否有效或何时停止治疗。
10.权利要求1所述的标志物在筛选非小细胞肺癌治疗药物中的用途。
技术总结
本发明提供基于患者体外获得血浆细胞外囊泡中的蛋白质MVP、GYS1、SERPINA3、HECTD3、SERPING1、TPM4和APOD作为非小细胞肺癌诊断的蛋白质生物标志物。这些生物标志物具有高灵敏度和高特异性的优点，具有重要的科学研究和临床应用价值。通过本发明提供的生物标志物，无需活检取材肺结节组织或进行影像学检查，即可对非小细胞肺癌进行前期诊断，患者痛苦小，且通过蛋白免疫分析技术或蛋白质组学技术即可进行检测，检测效率高；由此可便于临床应用的辅助诊断试剂盒，为非小细胞肺癌的筛查和诊断治疗提供实验室支持。通过组学技术获得的数据信息与临床信息整合将有助于更好地了解非小细胞肺癌病理过程，寻找新的干预靶点，从而改善患者的临床管理。
技术研发人员：张先恩,王殿冰,袁也
受保护的技术使用者：中国科学院生物物理研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5