一种基于SlFAR3基因编辑的番茄雄性不育突变体的创制方法
本发明涉及一种基于slfar3基因编辑的番茄雄性不育突变体的创制方法，属于遗传工程。
背景技术：
1、雄性不育是自然界有花植物中广泛存在的一类现象，是由雄性生殖器官或花粉发育异常造成的雄性功能的丧失。尽管雄性不育不利于生物个体基因的传递，但在农业生产当中，雄性不育系的应用，为农业生产提供极大的生产力，因此受科研工作者密切关注。
2、作为世界性蔬菜作物，番茄是典型自花授粉植物，其杂种优势显著，当前番茄生产以杂交种使用占主导地位，但传统杂交制种受限于人工去雄授粉，不但费时、费力、制种成本高，而且影响杂交种纯度。基于此，创制败育完全的番茄雄性不育系应用于杂种制种，具有生产实践价值。
3、早在1945年，已有学者将雄性不育系应用到番茄杂交制种当中，如 ms10、 ms15、 ps12及长花柱类型，但受限于花粉败育率较低、不育基因导入时间过长及不育系材料难以保存等，效果均不理想。
4、基于crispr-cas9的基因编辑技术，可以通过设计grna来精确地定位目标基因，并通过cas9酶的切割来实现基因编辑，允许在分子水平上对基因进行精确修改，其构建简单、成本低、效率高。
5、番茄中脂酰辅酶a还原酶（简称为slfar3），其高度富集于花药组织当中，表明其参与番茄花药及花粉壁代谢形成，slfar3基因是调控番茄早期花药发育的关键性基因。
6、cn117887754a公开了一种通过crispr-cas9基因编辑创制番茄雄性不育材料的方法及应用，其应用pegcas9pubi-b载体为骨架，采用单一靶向编辑位点，对模式番茄micro-tom进行slfac基因编辑，最终获取花粉败育阳性株系，但是其获得番茄雄性不育材料中仍然存在花粉。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的不足，本发明提供一种基于slfar3基因编辑的番茄雄性不育突变体的创制方法，实现以下发明目的：提高slfar3基因的编辑率，创制典型的无花粉型雄性不育突变体。
2、为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：
3、一种基于slfar3基因编辑的番茄雄性不育突变体的创制方法，番茄野生型slfar3基因的第一外显子第88bp后单碱基插入c或a，得到番茄雄性不育突变体；所述番茄雄性不育突变体中slfar3基因的核苷酸序列如序列表中seq id no.11所示。
4、所述slfar3基因编辑的靶向位点包括第一靶向位点和第二靶向位点，所述第一靶向位点的核苷酸序列如序列表中seq id no.3所示；所述第二靶向位点的核苷酸序列如序列表中seq id no.4所示。
5、扩增含有第一靶向位点和第二靶向位点的目的片段，插入ptx041质粒中，构建重组质粒，转化农杆菌后，再使用农杆菌侵染番茄，筛选获得番茄雄性不育突变体。
6、与现有技术相比，本发明取得以下有益效果：
7、本发明通过对slfar3基因进行特定位点的编辑，基因编辑率达87%，并且得到了纯合的番茄雄性不育突变体，相较于野生型，其营养生长和雌蕊外形没有明显差别，但柱头更为突出，其早期的柱头外露，花药瘦小呈淡黄绿色，成熟期花粉ttc染色显示，突变体株系成熟时期花药中无花粉粒，属于典型的无花粉型雄性不育突变体。
技术特征：
1.一种基于slfar3基因编辑的番茄雄性不育突变体的创制方法，其特征在于：番茄野生型slfar3基因的第一外显子第88bp后单碱基插入c或a，得到番茄雄性不育突变体；所述番茄雄性不育突变体中slfar3基因的核苷酸序列如序列表中seq id no.11所示。
2.根据权利要求1所述的一种基于slfar3基因编辑的番茄雄性不育突变体的创制方法，其特征在于：所述slfar3基因编辑的靶向位点包括第一靶向位点和第二靶向位点，所述第一靶向位点的核苷酸序列如序列表中seq id no.3所示；所述第二靶向位点的核苷酸序列如序列表中seq id no.4所示。
3.根据权利要求2所述的一种基于slfar3基因编辑的番茄雄性不育突变体的创制方法，其特征在于：扩增含有第一靶向位点和第二靶向位点的目的片段，插入ptx041质粒中，构建重组质粒，转化农杆菌后，再使用农杆菌侵染番茄，筛选获得番茄雄性不育突变体。
技术总结
本发明提供一种基于SlFAR3基因编辑的番茄雄性不育突变体的创制方法，属于遗传工程技术领域，番茄野生型SlFAR3基因的第一外显子第88bp后单碱基插入C或A，得到番茄雄性不育突变体；所述番茄雄性不育突变体中SlFAR3基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.11所示；本发明通过对SlFAR3基因进行特定位点的编辑，基因编辑率达87%，并且得到了纯合的番茄雄性不育突变体，相较于野生型，其营养生长和雌蕊外形没有明显差别，但柱头更为突出，其早期的柱头外露，花药瘦小呈淡黄绿色，成熟期花粉TTC染色显示，突变体株系成熟时期花药中无花粉粒，属于典型的无花粉型雄性不育突变体。
技术研发人员：刘家林,李媛媛,韩敏,韩童
受保护的技术使用者：潍坊学院
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5