利用幼胚挽救技术获得羊草与新麦草远缘杂交后代的方法

本发明属于牧草生物育种，具体涉及一种利用幼胚挽救技术获得羊草与新麦草远缘杂交后代的方法。

背景技术：

1、羊草（ leymus chinensis）具有较强的适应性，抗寒、抗旱、耐碱，耐瘠薄，耐风沙，而且叶量多，营养价值高，适口性好，各类家禽一年四季均喜食，其根茎穿透侵占能力较强，能够防风固沙，是较为重要的禾本科牧草和生态草。羊草分布范围广泛，种质资源较多。虽然目前羊草种质资源在某些特性方面也存在一定的差异，但由于分子育种以及常规的种内或种间育种方式存在局限性，在培育高产、优质、抗逆性强的羊草新品种上较难有更好的突破。

2、远缘杂交是不同种、属或亲缘关系更远的物种之间的杂交方式。通过远缘杂交获得的后代遗传变异较大，这样能够为筛选到草产量高、种子产量高、营养品质更好、抗逆性更好的材料提供更多的资源，从而创造出新变异类型或新物种。

3、远缘杂交胚发育的过程中夭亡的机率较大，杂交结实率较低。羊草为异花授粉植物，且本身结实率就较低，再加上存在生殖隔离，通过远缘杂交获得杂交后代就更难成功。羊草与灰色赖草的杂交育种（杜建材等1998，用远缘杂交方法改良羊草结实性的研究）已有相关报道，作者去雄授粉了360个小花数，结实数为76个，但播种6粒仅有2粒出苗，最终成株1苗。羊草与灰色赖草的远缘杂交为同属、同倍数的种间杂交，而羊草与其他属的物种很大可能存在染色体倍性上的差异，羊草与其他属的物种杂交，即使获得了杂交后代也极易夭亡或不育，杂交育种工作难度更大。

4、胚挽救技术是基于组织培养技术将幼胚从未发育完成的种子中剥出，经消毒后接种到培养基上培养成苗的过程，通过给予幼胚合适的激素水平、温度、光照等生长环境，提高幼胚的成活率和杂交后代的成功率，获得更多的杂交后代。目前胚挽救技术已成功应用在较多植物，如特早熟桃（专利授权公告号cn 105284620 b）、茉莉花（专利申请公布号cn112470920 a）、水稻（专利申请公布号cn 111264386 a）、芝麻（专利申请公布号cn105104185 b）、无核葡萄（专利授权公告号cn 104782474 b），而在羊草的育种中，还未见关于胚挽救技术的报道。

5、新麦草为多年生密丛型下繁禾草，具有返青早、分蘖多、耐牧、抗旱、耐盐碱多重优良特性，是干旱、半干旱地区一种放牧与刈割兼用型牧草。新麦草具有较丰富的种质资源，遗传变异较大，可以为改良羊草种子产量、牧草产量、抗病性提供较多的基因库。通过羊草与新麦草杂交，可以将新麦草的优异基因转入羊草，提高羊草的种子产量、牧草产量以及抗锈病、抗蚜虫特性，通过鉴定评价杂交后代可以筛选出具有更优异特性的羊草种质资源，进而培育羊草新品种。

6、然而，羊草与新麦草属于不同属的物种，杂交育种难度较大，如何通过胚挽救技术，解决羊草与亲缘关系较远的新麦草在进行远缘杂交时存在的获得杂种f1植株较难及所用时间长的问题，是目前亟需研究的内容。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了克服现有技术存在的不足，提供一种利用幼胚挽救技术获得羊草与新麦草远缘杂交后代的方法，以解决羊草与亲缘关系较远的新麦草在进行远缘杂交时存在的获得杂种f1植株较难及所用时间长的问题。

2、本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种利用幼胚挽救技术获得羊草与新麦草远缘杂交后代的方法，包括以下步骤：

3、1）杂交：

4、羊草作为母本，新麦草作为父本；在母本散粉前24 h，将穗顶部和基部小穗去掉，再将其余小穗的中间小花去掉，只留下最外面的两朵小花，然后去雄并套袋；采集父本的花粉，将花粉用镊子点在母本雌蕊柱头上进行授粉，并立即套袋；

5、2）消毒：

6、取授粉后的杂交穗，剥出未败育的子房，采用体积分数75%酒精浸泡1 min，无菌水冲洗三次，10% v/v次氯酸钠浸泡10min，后无菌水冲洗5次；

7、3）采用一步成苗法或诱导愈伤扩繁、分化成苗法成苗；

8、所述一步成苗法包括如下步骤：剥出杂交幼胚，放置于萌发培养基中，放置有杂交幼胚的萌发培养基放置在温度为25℃、光照16 h、黑暗8 h的培养箱培养28天，直接萌发发育成苗；所述萌发培养基包括4.4 g/l ms、30 g/l蔗糖、8 g/l琼脂及0.5 mg/l赤霉素，萌发培养基的ph值为5.8；

9、所述诱导愈伤扩繁、分化成苗法包括如下步骤：剥出杂交幼胚，接种于诱导愈伤培养基，放置在温度25℃黑暗的培养箱中培养28天；采用诱导愈伤培养基，在诱导愈伤培养相同条件下继代增值培养14 d后，转移到分化培养基中，置于25℃、光照16h、黑暗8h的培养箱中培养28d；转移到生根培养基中培养21天；所述诱导愈伤培养基包括4.4 g/l ms、30 g/l蔗糖、8 g/l琼脂、0.5 mg/l赤霉素、2 mg/l 2,4-d及1mg/l酵母提取物ye，诱导愈伤培养基的ph值为5.8；所述分化培养基包括4.4 g/l ms、30 g/l蔗糖、8 g/l琼脂、1.0 mg/l-2.0mg/l赤霉素及0.5 mg/l-2 mg/l 6-ba，分化培养基的ph值为5.8；所述生根培养基包括2.2g/l ms、30 g/l蔗糖、8 g/l琼脂及1.0 mg/l naa，生根培养基的ph值为5.8；

10、4）练苗移栽：组培苗生长至10 cm-15 cm时，向培养瓶中加入超纯水，室内炼苗7d后，将植株根部培养基冲洗干净，移栽到灭菌的营养土中培养。

11、在所述步骤1）中，第一次授粉24 h后再次重复授粉。

12、在所述步骤2）中，所述杂交穗为授粉后14d-18d的杂交穗。

13、在所述步骤2）中，所述未败育的子房为绿色、饱满、无病虫害的未败育子房。

14、本发明的有益效果是：本发明采用亲缘关系较远的新麦草与羊草进行远缘杂交，采用幼胚挽救技术，通过杂交方法优化，成功地在较短时间内获得了杂交后代植株。

技术特征：

1.一种利用幼胚挽救技术获得羊草与新麦草远缘杂交后代的方法，其特征在于包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的利用幼胚挽救技术获得羊草与新麦草远缘杂交后代方法，其特征在于：在所述步骤1）中，第一次授粉24 h后再次重复授粉。

3.根据权利要求1所述的利用幼胚挽救技术获得羊草与新麦草远缘杂交后代方法，其特征在于：在所述步骤2）中，所述杂交穗为授粉后14d-18d的杂交穗。

4.根据权利要求1所述的利用幼胚挽救技术获得羊草与新麦草远缘杂交后代方法，其特征在于：在所述步骤2）中，所述未败育的子房为绿色、饱满、无病虫害的未败育子房。

技术总结
本发明公开了一种利用幼胚挽救技术获得羊草与新麦草远缘杂交后代的方法，包括以下步骤：1）杂交：羊草作为母本，新麦草作为父本；采集父本花粉，将花粉用镊子点在母本雌蕊柱头上进行授粉，并立即套袋；2）消毒：取授粉后的杂交穗，剥出未败育的子房，采用体积分数75%酒精浸泡1min，无菌水冲洗三次，次氯酸钠浸泡10min，后无菌水冲洗5次；3）采用一步成苗法或诱导愈伤扩繁、分化成苗法成苗；4）练苗移栽：组培苗生长至10cm‑15cm时，向培养瓶中加入超纯水，室内炼苗7d后，将植株根部培养基冲洗干净，移栽到灭菌营养土中培养。本发明具有较高幼胚萌发率、诱导愈伤率及分化率，在较短时间内获得羊草与新麦草的杂交后代。

技术研发人员：杨艳婷,陈晓菲,武自念,田春育,宫文龙,冯玉梅,刘乐萌,万文雅
受保护的技术使用者：中国农业科学院草原研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5