用于递送外源多核苷酸的核酸组合物及使用方法与流程

背景技术：

1、各种生物活性化合物(诸如抗原和感兴趣的蛋白)的细胞递送对于基础研究和工业应用都具有高价值。然而，它通常受到两个限制的损害，一个是对正常组织的高毒性，另一个是低递送效率，因为活细胞受到细胞的复杂膜系统的高度限制。在以中枢神经系统(cns)为靶标的递送努力中已经观察到特殊的困难。

技术实现思路

1、在一个方面，为了满足对靶细胞的新的递送方法的需求，本文提供了携带感兴趣的多核苷酸的重组寨卡病毒和寨卡病毒样颗粒。在一些实施方案中，病毒和病毒样颗粒包含寨卡结构蛋白。使用方法涉及将此类重组寨卡病毒或此类寨卡病毒样颗粒施用于靶细胞。在一些情况下，考虑到其有利的cns向性，此类使用方法治疗中枢神经系统的病症。在一些情况下，病毒和病毒样颗粒不包含复制型寨卡病毒。

2、在另一方面，为了满足对靶细胞的新的递送方法的需求，本文提供了携带感兴趣的多核苷酸(例如，外源多核苷酸)和来自寨卡基因组的调节区的核酸组合物的转录物。示例性使用方法涉及用基于脂质的试剂包封此类转录物，并将此类化合物施用于靶细胞。在一些实施方案中，核酸组合物包含寨卡5’utr、感兴趣的多核苷酸以及寨卡3’utr。在一些实施方案中，核酸组合物不编码寨卡结构蛋白。在一些实施方案中，核酸组合物不编码寨卡非结构蛋白。在一些实施方案中，感兴趣的多核苷酸具有高达约5700、5600、5500、5400、5300、5200、5100、5000、4900、4800、4700、4600或4500个核苷酸的大小。在一些实施方案中，感兴趣的多核苷酸具有约10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500个核苷酸直至高达约5700、5600、5500、5400、5300、5200、5100、5000、4900、4800、4700、4600或4500个核苷酸的大小。

3、在一些实施方案中，核酸组合物包含(i)编码寨卡病毒衣壳蛋白(c)或寨卡病毒c的衍生物的多核苷酸、编码寨卡病毒病毒膜蛋白(prm/m)或寨卡病毒prm/m的衍生物的多核苷酸、编码寨卡病毒病毒包膜蛋白(e)或寨卡病毒e的衍生物的多核苷酸，或其任何组合；和(ii)对寨卡病毒外源的多核苷酸。在一些实施方案中，核酸组合物包含寨卡病毒c的衍生物，其中衍生物编码c的至少或约5、10、15、20、25或30个氨基酸。在一些实施方案中，核酸组合物包含寨卡病毒c的衍生物，其中衍生物编码c的约5、10、15、20或25至约30个氨基酸。在一些实施方案中，核酸组合物包含编码c的多核苷酸。在一些实施方案中，核酸组合物不编码编码寨卡病毒病毒膜蛋白(prm/m)或寨卡病毒prm/m的衍生物的多核苷酸以及编码寨卡病毒病毒包膜蛋白(e)或寨卡病毒e的衍生物的多核苷酸。在一些实施方案中，外源多核苷酸具有高达约5700、5600、5500、5400、5300、5200、5100、5000、4900、4800、4700、4600或4500个核苷酸的大小。在一些实施方案中，外源多核苷酸具有约10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500个核苷酸直至高达约5700、5600、5500、5400、5300、5200、5100、5000、4900、4800、4700、4600或4500个核苷酸的大小。在一些实施方案中，核酸组合物是用于将外源多核苷酸递送至对象的靶细胞的递送载体。靶细胞可以是中枢神经系统中的细胞。

4、在一些实施方案中，核酸组合物包含编码寨卡病毒c或寨卡病毒c的衍生物的多核苷酸、编码寨卡病毒prm/m或寨卡病毒prm/m的衍生物的多核苷酸以及编码寨卡病毒e或寨卡病毒e的衍生物的多核苷酸。在一些实施方案中，编码寨卡病毒c或寨卡病毒c的衍生物的多核苷酸、编码寨卡病毒prm/m或寨卡病毒prm/m的衍生物的多核苷酸以及编码寨卡病毒e或寨卡病毒e的衍生物的多核苷酸在一个或多个单独的核酸上表达。

5、在一些实施方案中，与野生型寨卡病毒c相比，编码寨卡病毒c的衍生物的多核苷酸包含至少一个取代、至少一个缺失和/或至少一个插入。在一些实施方案中，寨卡病毒c或寨卡病毒c的衍生物包含与表1a、表1d、表1i、表2或表3的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，寨卡病毒c的衍生物包含表1a、表1d、表1i、表2或表3的序列的约5、10、15、20或25至约30个氨基酸。

6、在一些实施方案中，与野生型寨卡病毒prm/m相比，编码寨卡病毒prm/m的衍生物的多核苷酸包含至少一个取代、至少一个缺失和/或至少一个插入。在一些实施方案中，寨卡病毒prm/m或寨卡病毒prm/m的衍生物包含与表1a、表1f或表1k的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。

7、在一些实施方案中，与野生型寨卡病毒e相比，编码寨卡病毒e的衍生物的多核苷酸包含至少一个取代、至少一个缺失和/或至少一个插入。在一些实施方案中，编码e的多核苷酸被翻译成野生型寨卡病毒e。在一些实施方案中，寨卡病毒e或寨卡病毒e的衍生物包含与表1a、表ie或表1j的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。

8、在一些实施方案中，核酸组合物包含寨卡病毒的5’非翻译区(5’utr)。在一些实施方案中，寨卡病毒5’utr或寨卡病毒5’utr的衍生物包含与表1a、表1c、表1h或表2的序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。

9、在一些实施方案中，核酸组合物包含寨卡病毒的3’非翻译区(3’utr)。在一些实施方案中，寨卡病毒3’utr或寨卡病毒3’utr的衍生物包含与表1a、表1b、表1g或表2的序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。

10、在一些实施方案中，核酸组合物不包含编码一种或多种非结构(ns)蛋白的多核苷酸，所述非结构(ns)蛋白选自(i)ns1、(ii)ns2a、(iii)ns2b、(iv)ns3、(v)ns4a、(vi)ns4b、(vii)ns5、或(viii)(i)-(vii)中的两种或更多种。在其他实施方案中，核酸组合物包含编码一种或多种非结构(ns)蛋白的多核苷酸，所述非结构(ns)蛋白选自(i)ns1、(ii)ns2a、(iii)ns2b、(iv)ns3、(v)ns4a、(vi)ns4b、(vii)ns5、或(viii)(i)-(vii)中的两种或更多种。在一些实施方案中，ns1是寨卡病毒ns1，ns2a是寨卡病毒ns2a，ns2b是寨卡病毒ns2b，ns3是寨卡病毒ns3，ns4a是寨卡病毒ns4a，ns4b是寨卡病毒ns4b，或者ns5是寨卡病毒ns5，或其两个或更多个的任何组合。

11、在一些实施方案中，核酸组合物的组分包含非洲寨卡病毒组分、亚洲寨卡病毒组分、或巴西寨卡病毒组分、或其组合。在一个具体实施方案中，寨卡病毒是非洲mr766毒株。

12、在一些实施方案中，外源多核苷酸是抗原或其抗原性表位。在一些实施方案中，抗原或其抗原性表位是疾病相关的。在具体实施方案中，抗原或其抗原性表位来自病原体。

13、在一些实施方案中，病原体是病毒。在具体实施方案中，病毒是人sars冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、埃博拉病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、人免疫缺陷病毒(hiv)、人乳头瘤病毒(hpv-6、hpv-11)、麻疹病毒、狂犬病病毒、脊髓灰质炎病毒或黄热病病毒。

14、在一些实施方案中，病原体是细菌。在具体实施方案中，细菌是鲍曼不动杆菌(acinetobacter baumanii)、伴放线杆菌(aggregatobacter actinomycetemcomitans)、杆菌状巴尔通体(bartonella bacilliformis)、汉氏巴尔通体(bartonella.henselae)、五日热巴尔通体(bartonella quintana)、双歧杆菌疏螺旋体(bifidobacterium borrelia)、百日咳博德特氏菌(bortadella pertussis)、布鲁氏菌属种(brucella sp)、洋葱伯克霍尔德菌(burkholderia cepacis)、类鼻疽伯克霍尔德菌(burkholderia psedomallei)、空肠弯曲杆菌(campylobacter jejuni)、人心杆菌(cardiobacterium hominis)、胎儿弯曲杆菌(campylobacter fetus)、肺炎衣原体(chlamydia pneumonia)、沙眼衣原体(chlymydiatrahomatis)、艰难梭菌(clostridium difficile)、蓝藻细菌(cyanobacteria)、侵蚀艾肯菌(eikennella corrodens)、肠杆菌(enterobacter)、粪肠球菌(enterococcus faccium)、大肠杆菌(escherichia coli)、大肠杆菌0157、土拉弗朗西斯菌(franceillatularensis)、具核梭杆菌(fusobacterium nucleatum)、流感嗜血杆菌(haemophilusinfluenza)、嗜沫嗜血杆菌(haemophilus aphrophilus)、杜克雷嗜血杆菌(haemophilusducreyi)、副流感嗜血杆菌(haemophilus parainfluenzae)、幽门螺杆菌(helicobacterpylori)、金格杆菌(kingella kingae)、肺炎克雷伯杆菌(klebsiella pneumonia)、军团杆菌(legionella bacteria)、嗜肺军团菌血清1型(legionella pneumophila serogroup1)、钩端螺旋体属(leptospria)、摩氏摩根菌(morganella morganii)、淋病奈瑟氏菌(neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(neisseria meningitidis)、奇异变形杆菌(proteus mirabilis)、普通变形杆菌(proteus vulgaris)、粘化变形杆菌(proteusmyxofaciens)、雷氏普罗威登斯菌(providencia rettgeri)、产碱普罗威登斯菌(providencia alcalifaciens)、斯氏普罗威登斯菌(providencia stuartii)、绿脓假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、少动假单胞菌(pseudomonas paucimobilis)、恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)、荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)、食酸假单胞菌(pseudomonas acidovorans)、立克次体属(rickettsiae)、肠道沙门氏菌(salmonellaenterica)、伤寒沙门氏菌(salmonella typhi)、甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌(salmonella.dublin)、亚利桑那沙门氏菌(salmonella arizonae)、猪霍乱沙门氏菌(salmonella choleraesuis)、粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)、痢疾志贺氏菌(schigella dysenteriae)、福氏志贺氏菌(schigella flexneri)、鲍氏志贺氏菌(schigella boydii)、宋内志贺氏菌(schigella sonnei)、密螺旋体属(treponema)、嗜麦芽窄食单胞菌(stenotrophomonas maltophilia)、霍乱弧菌(vibrio cholerae)、拟态弧菌(vibrio mimicus)、溶藻弧菌(vibrio alginolyticus)、霍氏弧菌(vibrio hollisae)、副溶血性弧菌(vibrio parahaemolyticus)、创伤弧菌(vibrio vulnificus)、鼠疫耶尔森杆菌(yersinia pestitis)、放线菌属(actinomycetes)、炭疽杆菌(bacillus anthracis)、枯草杆菌(bacillus subtilis)、破伤风梭菌(clostridium tetani)、产气荚膜梭菌(clostridium.perfingens)、肉毒梭菌(clostridium botulinum)、破伤风梭菌(clostridium tetani)、白喉棒状杆菌(corynebacterium diphtheriae)、粪肠球菌(enterococcus faecalis)、屎肠球菌(enterococcus faecium)、红斑丹毒丝菌(erysipelothrix ruhsiopathiae)、单核细胞增生利斯特菌(listeria monocytogenes)、麻风分枝杆菌(mycobacterium leprae)、结核分支杆菌(mycobacterium tuberculosis)、支原体属(mycoplasma)、诺卡氏菌属(nocardia)、丙酸菌属(propionibacerium)、绿脓假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、肺炎双球菌(pneumococci)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(vancomycin resistant staphylococcus aureus)(mrsa)、耐万古霉素金黄色葡萄球菌(vancomycin resistant staphylococcus aureus)(vrsa)、路邓葡萄球菌(staphylococcus lugdunensis)、腐生葡萄球菌(staphylococcus saprophyticus)、肺炎链球菌(streptococcus pneumonia)、化脓链球菌(streptococcus pyogenes)或突变链球菌(streptococcus mutants)。

15、在一些实施方案中，病原体是真菌、阿米巴原虫或寄生虫。在具体实施方案中，真菌、阿米巴原虫或寄生虫是棘阿米巴属种(acanthamoeba spp)、美洲锥虫病(americantryppanosomiasis)、狒狒巴拉姆希阿米巴(balamuthia mandnillanis)、分歧巴贝虫(babesia divergenes)、双芽巴贝虫(babesia bigemina)、马巴贝虫(babesia equi)、微小巴贝虫(babesia microfti)、邓肯巴贝虫(babesia duncani)、结肠小袋绦虫(balantidiumcoli)、芽囊原虫属种(blastocystis spp)隐孢子虫属种(cryptosporidium spp)、环孢子虫(cyclospora cayetanensis)、脆弱双核阿米巴(dientamoeba fragilis)、阔节裂头绦虫(diphyllobothrium latum)、亚马逊利什曼原虫(leishmania amazonesis)、福氏纳格里原虫(naegleria fowderi)、恶性疟原虫(plasmodium falciparum)、间日疟原虫(plasmodiumvivax)、卵形疟原虫柯氏亚种(plasmodium ovale curtisi)、三日疟原虫(plasmodiummalariae)、西伯氏鼻孢子虫(rhinosporidium seeberi)、牛人肉孢子虫(sarcocystisbovihominis)、猪人肉孢子虫(sarcocystiss suihominis)、刚地弓形虫(toxoplasmagondii)、阴道滴虫(trichmonas vaginalis)、布氏锥虫(trypanosoma brucei)、克氏锥虫(trypanosoma cruzi)和多头绦虫(taenia multiceps)。

16、在一些实施方案中，外源多核苷酸编码基因编辑工具。在具体实施方案中，基因编辑工具选自大核酸酶相关药剂、crispr相关药剂、talen相关药剂和锌指相关药剂。

17、在一些实施方案中，外源多核苷酸是小干扰rna(sirna)、反义rna、微rna(mirna)、小或短发夹rna(shrna)、引导rna(grna)、成簇的规则间隔的短回文重复rna(crrna)、反式激活的成簇的规则间隔的短回文重复rna(tracrrna)、免疫刺激寡核苷酸、反义核酸或核酶。在具体实施方案中，外源多核苷酸靶向β-分泌酶1(bace1)和/或淀粉样前体蛋白(app)。

18、在一些实施方案中，外源多核苷酸编码与遗传病症相关的多肽。在具体实施方案中，多肽是脑源性神经营养因子(bdnf)、神经生长因子(ngf)、脑啡肽酶抑制剂(nep)、内皮素转化酶(ece)、组织蛋白酶b(ctsb)、载脂蛋白e 2(apoe2)、sh3和多锚蛋白重复结构域蛋白(shank)、神经秩蛋白(nrtn)、胶质细胞源性神经营养因子(gdnf)、脑多巴胺神经营养因子(cdnf)、血管内皮生长因子a(vegf-a)或芳香族l-氨基酸脱羧酶(aadc)。

19、在一些实施方案中，外源多核苷酸编码治疗剂或诊断剂。在具体实施方案中，治疗剂是基于抗体的治疗剂、激素、细胞因子、免疫检查点调节剂的抑制剂或拮抗剂、免疫刺激分子或免疫共刺激分子的激动剂。在另外的实施方案中，免疫检查点调节剂的抑制剂或拮抗剂是抗pd1抗体。在另一实施方案中，基于抗体的治疗剂是抗体、抗体的功能片段、嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr)。在另一些实施方案中，细胞因子包括淋巴因子、单核因子、多肽激素、生长激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、糖蛋白激素、促卵泡激素(fsh)、促甲状腺激素(tsh)、黄体刺激素(lh)、肝生长因子、成纤维细胞生长因子、催乳素、胎盘催乳素、肿瘤坏死因子-a和肿瘤坏死因子-β、苗勒氏抑制物质、小鼠促性腺激素相关肽、抑制素、激活素、血管内皮生长因子、整合素、血小板生成素(tpo)、神经生长因子、ngf-β、血小板生长因子、转化生长因子(tgf)、tgf-a、tgf-β、胰岛素样生长因子-i和胰岛素样生长因子-ii、红细胞生成素(epo)、骨诱导因子、干扰素(诸如干扰素-a、干扰素-β和干扰素-γ)、集落刺激因子(csf)、巨噬细胞-csf(m-csf)、粒细胞-巨噬细胞-csf(gm-csf)、粒细胞-csf(gcsf)、白细胞介素(il)、肿瘤坏死因子、tnf-a、tnf-β、lif或试剂盒配体(kl)，或其两种或更多种的组合。

20、在一些实施方案中，外源多核苷酸为约或高达约10000、9000、8000、7000、6000或5000个核苷酸长。例如，外源多核苷酸为约50至约10000、9000、8000、7000、6000或5000个核苷酸长。

21、在一些实施方案中，本文所述的核酸组合物的组分在一种核酸或两种或更多种单独的核酸上表达。在一些实施方案中，核酸组合物进一步包含一个或多个呈可操作连接的表达控制元件，其赋予核酸组合物在体外或体内的表达。在一些实施方案中，表达控制元件是驱动核酸复合物在体外表达的启动子。在具体实施方案中，启动子是t7、t3、sp6或任何噬菌体启动子。

22、在一些实施方案中，表达控制元件是驱动核酸复合物在靶细胞中表达的启动子。在一些具体实施方案中，启动子是cmv、sv40或任何真核启动子。在一些实施方案中，靶细胞是神经元或非神经元细胞、vero、cos、cho、c6/36、hela、hek、hepg2。在一些实施方案中，靶细胞是少突胶质细胞、小胶质细胞或星形胶质细胞。

23、在另一方面，本文提供了一种药物组合物，该药物组合物包含本文所述的核酸组合物及其药学上可接受的盐或衍生物。

24、在另一方面，本文提供了一种重组寨卡病毒或寨卡病毒样颗粒，该重组寨卡病毒或寨卡病毒样颗粒由在生产细胞中表达本文所述的核酸组合物产生，其中生产细胞进一步被第二寨卡病毒感染，使得寨卡病毒c或寨卡病毒c的衍生物、寨卡病毒prm/m或寨卡病毒prm/m的衍生物以及寨卡病毒e或寨卡病毒e的衍生物存在于重组寨卡病毒中。

25、在一些实施方案中，第二寨卡病毒是野生型寨卡病毒。在一些实施方案中，野生型寨卡病毒是非洲、亚洲和巴西毒株。在其他实施方案中，第二寨卡病毒是经修饰的寨卡病毒。在一些具体实施方案中，经修饰的寨卡病毒包含一种或多种基于微rna的基因沉默机制。在一些具体实施方案中，一种或多种基于微rna的基因沉默机制控制病毒复制。

26、在另一方面，本文提供了一种重组寨卡病毒或寨卡病毒样颗粒，该重组寨卡病毒或寨卡病毒样颗粒在没有第二寨卡病毒的感染的情况下由在生产细胞中表达如本文所述的核酸组合物产生，其中寨卡病毒c或寨卡病毒c的衍生物、寨卡病毒prm/m或寨卡病毒prm/m的衍生物以及寨卡病毒e或寨卡病毒e的衍生物存在于重组寨卡病毒或寨卡病毒样颗粒中。

27、在一些实施方案中，生产细胞是vero e6、hek、hek 293t、hek 293tt、freestyletm293-f细胞、hek-293.2sus或c6/36细胞。

28、在一些实施方案中，重组寨卡病毒具有复制能力。在其他实施方案中，重组寨卡病毒在不降低载体滴度或不损害外源多核苷酸的表达的情况下是复制无能的。在一些实施方案中，重组寨卡病毒具有减少的插入突变。在其他实施方案中，重组寨卡病毒具有降低的免疫应答。

29、在另一方面，本文提供了一种药物组合物，该药物组合物包含本文所述的重组寨卡病毒或寨卡病毒样颗粒及其药学上可接受的盐或衍生物。

30、在另一方面，本文提供了一种将外源多核苷酸递送至靶细胞的方法，该方法包括向靶细胞施用包含外源多核苷酸的本文所述的重组寨卡病毒或寨卡病毒样颗粒。

31、在一些实施方案中，靶细胞是神经元或非神经元细胞。在具体实施方案中，神经元是少突胶质细胞、小胶质细胞或星形胶质细胞。在另一具体实施方案中，非神经元细胞是前列腺上皮细胞、尿道上皮细胞、支持细胞(sertoli cell)、来狄吉氏细胞(leydig cell)、精原细胞或视网膜细胞。

32、在一些实施方案中，方法在体外、离体或体内进行。

33、在一些实施方案中，靶细胞在递送后瞬时地表达外源多核苷酸。在其他实施方案中，靶细胞在递送之后持续地表达外源多核苷酸。

34、在另一方面，本文提供了一种治疗有需要的对象的阿尔茨海默病的方法，该方法包括向对象施用有效量的如本文所述的重组寨卡病毒或寨卡病毒样颗粒，该重组寨卡病毒或寨卡病毒样颗粒包含编码脑源性神经营养因子(bdnf)的多核苷酸。

35、在另一方面，本文提供了一种治疗有需要的对象的自闭症的方法，该方法包括向对象施用有效量的如本文所述的重组寨卡病毒或寨卡病毒样颗粒，该重组寨卡病毒或寨卡病毒样颗粒包含编码sh3和多锚蛋白重复结构域蛋白(shank)的多核苷酸。

36、在又一方面，本文提供了一种治疗有需要的对象的帕金森病的方法，该方法包括向对象施用有效量的如本文所述的重组寨卡病毒或寨卡病毒样颗粒，该重组寨卡病毒或寨卡病毒样颗粒包含编码芳香族l-氨基酸脱羧酶(aadc)的多核苷酸。

37、在一些实施方案中，施用经由全身递送进行。

38、在一些实施方案中，施用静脉内和/或肿瘤内进行。

39、在一些实施方案中，施用靶向脑室内、枕大池、软脑膜下和/或鞘内的脑脊液。在其他实施方案中，施用不在脑实质内进行。

40、在一些实施方案中，核酸组合物包含(i)编码核酶的多核苷酸(ii)寨卡病毒的5’非翻译区(utr)；(iii)寨卡病毒的3’utr；以及(iv)对寨卡病毒外源的多核苷酸。在一些实施方案中，核酶是锤头状核酶或丁型肝炎病毒(hdv)核酶。在一些实施方案中，核酸进一步包含编码第二核酶的多核苷酸。在一些具体实施方案中，第二核酶是锤头状核酶或丁型肝炎病毒(hdv)核酶。在一些实施方案中，编码核酶的多核苷酸编码锤头状核酶，并且编码第二核酶的多核苷酸编码hdv核酶。在一些实施方案中，核酸组合物进一步包含c-部分。c-部分可以指编码c的一部分，例如c的约5、10、15、20或25个氨基酸至约30个氨基酸的多核苷酸。在一些实施方案中，外源多核苷酸具有高达约5700、5600、5500、5400、5300、5200、5100、5000、4900、4800、4700、4600或4500个核苷酸的大小。在一些实施方案中，外源多核苷酸具有约10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500个核苷酸直至高达约5700、5600、5500、5400、5300、5200、5100、5000、4900、4800、4700、4600或4500个核苷酸的大小。在一些实施方案中，核酸组合物是用于将外源多核苷酸递送至对象中的靶细胞的递送载体。靶细胞可以是中枢神经系统中的细胞。

41、在一些实施方案中，寨卡病毒是非洲寨卡病毒、亚洲寨卡病毒、巴西寨卡病毒组分或其一种或两种的组合。在具体实施方案中，寨卡病毒是非洲mr766毒株。

42、在一些实施方案中，外源多核苷酸是抗原或其抗原性表位。在一些实施方案中，抗原或其抗原性表位是疾病相关的。在具体实施方案中，抗原或其抗原性表位来自病原体。

43、在一些实施方案中，病原体是病毒。在具体实施方案中，病毒是人sars冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、埃博拉病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、人免疫缺陷病毒(hiv)、人乳头瘤病毒(hpv-6、hpv-11)、麻疹病毒、狂犬病病毒、脊髓灰质炎病毒或黄热病病毒。

44、在一些实施方案中，病原体是细菌。在具体实施方案中，细菌是鲍曼不动杆菌、伴放线杆菌、杆菌状巴尔通体、汉氏巴尔通体、五日热巴尔通体、双歧杆菌疏螺旋体、百日咳博德特氏菌、布鲁氏菌属种、洋葱伯克霍尔德菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、空肠弯曲杆菌、人心杆菌、胎儿弯曲杆菌、肺炎衣原体、沙眼衣原体、艰难梭菌、蓝藻细菌、侵蚀艾肯菌、肠杆菌、粪肠球菌、大肠杆菌、大肠杆菌0157、土拉弗朗西斯菌、具核梭杆菌、流感嗜血杆菌、嗜沫嗜血杆菌、杜克雷嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、金格杆菌、肺炎克雷伯杆菌、军团杆菌、嗜肺军团菌血清1型、钩端螺旋体属、摩氏摩根菌、淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、粘化变形杆菌、雷氏普罗威登斯菌、产碱普罗威登斯菌、斯氏普罗威登斯菌、绿脓假单胞菌、少动假单胞菌、恶臭假单胞菌、荧光假单胞菌、食酸假单胞菌、立克次体属、肠道沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、亚利桑那沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌、宋内志贺氏菌、密螺旋体属、嗜麦芽窄食单胞菌、霍乱弧菌、拟态弧菌)、溶藻弧菌、霍氏弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、鼠疫耶尔森杆菌、放线菌属、炭疽杆菌、枯草杆菌、破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌、破伤风梭菌、白喉棒状杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、红斑丹毒丝菌、单核细胞增生利斯特菌、麻风分枝杆菌、结核分支杆菌、支原体属、诺卡氏菌属、丙酸菌属、绿脓假单胞菌、肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)、耐万古霉素金黄色葡萄球菌(vrsa)、路邓葡萄球菌、腐生葡萄球菌、肺炎链球菌、化脓链球菌或突变链球菌。

45、在一些实施方案中，病原体是真菌、阿米巴原虫或寄生虫。在具体实施方案中，真菌、阿米巴原虫或寄生虫是棘阿米巴属种、美洲锥虫病、狒狒巴拉姆希阿米巴、分歧巴贝虫、双芽巴贝虫、马巴贝虫、微小巴贝虫、邓肯巴贝虫、结肠小袋绦虫、芽囊原虫属种、隐孢子虫属种、环孢子虫、脆弱双核阿米巴、阔节裂头绦虫、亚马逊利什曼原虫、福氏纳格里原虫、恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫柯氏亚种、三日疟原虫、西伯氏鼻孢子虫、牛人肉孢子虫、猪人肉孢子虫、刚地弓形虫、阴道滴虫、布氏锥虫、克氏锥虫和多头绦虫。

46、在一些实施方案中，外源多核苷酸编码基因编辑工具。在具体实施方案中，基因编辑工具选自大核酸酶相关药剂、crispr相关药剂、talen相关药剂和锌指相关药剂。

47、在一些实施方案中，外源多核苷酸是小干扰rna(sirna)、反义rna、微rna(mirna)、小或短发夹rna(shrna)、引导rna(grna)、成簇的规则间隔的短回文重复rna(crrna)、反式激活的成簇的规则间隔的短回文重复rna(tracrrna)、免疫刺激寡核苷酸、反义核酸或核酶。在具体实施方案中，外源多核苷酸靶向β-分泌酶1(bace1)和/或淀粉样前体蛋白(app)。

48、在一些实施方案中，外源多核苷酸编码与遗传病症相关的多肽。在具体实施方案中，多肽是脑源性神经营养因子(bdnf)、神经生长因子(ngf)、脑啡肽酶抑制剂(nep)、内皮素转化酶(ece)、组织蛋白酶b(ctsb)、载脂蛋白e 2(apoe2)、sh3和多锚蛋白重复结构域蛋白(shank)、神经秩蛋白(nrtn)、胶质细胞源性神经营养因子(gdnf)、脑多巴胺神经营养因子(cdnf)、血管内皮生长因子a(vegf-a)或芳香族l-氨基酸脱羧酶(aadc)。

49、在一些实施方案中，外源多核苷酸编码治疗剂或诊断剂。在具体实施方案中，治疗剂是基于抗体的治疗剂、激素、细胞因子、免疫检查点调节剂的抑制剂或拮抗剂、免疫刺激分子或免疫共刺激分子的激动剂。在另外的实施方案中，免疫检查点调节剂的抑制剂或拮抗剂是抗pd1抗体。在其他实施方案中，基于抗体的治疗剂是抗体、抗体的功能片段、嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr)。在另一些实施方案中，细胞因子包括淋巴因子、单核因子、多肽激素、生长激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、糖蛋白激素、促卵泡激素(fsh)、促甲状腺激素(tsh)、黄体刺激素(lh)、肝生长因子、成纤维细胞生长因子、催乳素、胎盘催乳素、肿瘤坏死因子-a和肿瘤坏死因子-β、苗勒氏抑制物质、小鼠促性腺激素相关肽、抑制素、激活素、血管内皮生长因子、整合素、血小板生成素(tpo)、神经生长因子、ngf-β、血小板生长因子、转化生长因子(tgf)、tgf-a、tgf-β、胰岛素样生长因子-i和胰岛素样生长因子-ii、红细胞生成素(epo)、骨诱导因子、干扰素(诸如干扰素-a、干扰素-β和干扰素-γ)、集落刺激因子(csf)、巨噬细胞-csf(m-csf)、粒细胞-巨噬细胞-csf(gm-csf)、粒细胞-csf(gcsf)、白细胞介素(il)、肿瘤坏死因子、tnf-a、tnf-β、lif或试剂盒配体(kl)，或其两种或更多种的组合。

50、在一些实施方案中，外源多核苷酸为约或高达约10000、9000、8000、7000、6000或5000个核苷酸长。例如，外源多核苷酸为约50至约10000、9000、8000、7000、6000或5000个核苷酸长。

51、在一些实施方案中，核酸组合物进一步包含一个或多个呈可操作连接的表达控制元件，其赋予核酸组合物在体外的表达。在一些实施方案中，表达控制元件是驱动核酸复合物在体外表达的启动子。在具体实施方案中，启动子是t7、t3、sp6或任何噬菌体启动子。

52、在另一方面，本文提供了一种药物组合物，该药物组合物包含本文所述的核酸组合物及其药学上可接受的盐或衍生物。

53、在另一方面，本文提供了将外源多核苷酸递送至靶细胞的方法，该方法包括向靶细胞施用由包含外源多核苷酸的如本文所述的核酸组合物产生的化合物。

54、在一些实施方案中，化合物通过用基于脂质的药剂包封由本文所述的核酸组合物产生的转录物来产生。在具体实施方案中，转录物是无帽的。在另一具体实施方案中，转录物通过体外转录核酸组合物来产生。

55、在一些实施方案中，基于脂质的药剂是lipofectamine相关试剂、脂质体或脂质纳米颗粒。

56、在另一方面，本文提供了一种在对象中触发或增强免疫应答的方法，该方法包括向对象施用有效量的由包含抗原或其抗原性表位的如本文所述的核酸组合物产生的化合物。

57、在一些实施方案中，化合物通过用基于脂质的药剂包封由本文所述的核酸组合物产生的转录物来产生。在具体实施方案中，转录物是无帽的。在另一具体实施方案中，转录物通过体外转录核酸组合物来产生。

58、在一些实施方案中，基于脂质的药剂是lipofectamine相关试剂、脂质体或脂质纳米颗粒。

59、在一些实施方案中，施用肌内进行。

60、在一些实施方案中，抗原或其抗原性表位来自病原体。

61、在一些实施方案中，病原体是病毒。在具体实施方案中，病毒是人sars冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、埃博拉病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、人免疫缺陷病毒(hiv)、人乳头瘤病毒(hpv-6、hpv-11)、麻疹病毒、狂犬病病毒、脊髓灰质炎病毒或黄热病病毒。

62、在一些实施方案中，病原体是细菌。在具体实施方案中，细菌是鲍曼不动杆菌、伴放线杆菌、杆菌状巴尔通体、汉氏巴尔通体、五日热巴尔通体、双歧杆菌疏螺旋体、百日咳博德特氏菌、布鲁氏菌属种、洋葱伯克霍尔德菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、空肠弯曲杆菌、人心杆菌、胎儿弯曲杆菌、肺炎衣原体、沙眼衣原体、艰难梭菌、蓝藻细菌、侵蚀艾肯菌、肠杆菌、粪肠球菌、大肠杆菌、大肠杆菌0157、土拉弗朗西斯菌、具核梭杆菌、流感嗜血杆菌、嗜沫嗜血杆菌、杜克雷嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、金格杆菌、肺炎克雷伯杆菌、军团杆菌、嗜肺军团菌血清1型、钩端螺旋体属、摩氏摩根菌、淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、粘化变形杆菌、雷氏普罗威登斯菌、产碱普罗威登斯菌、斯氏普罗威登斯菌、绿脓假单胞菌、少动假单胞菌、恶臭假单胞菌、荧光假单胞菌、食酸假单胞菌、立克次体属、肠道沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、亚利桑那沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌、宋内志贺氏菌、密螺旋体属、嗜麦芽窄食单胞菌、霍乱弧菌、拟态弧菌)、溶藻弧菌、霍氏弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、鼠疫耶尔森杆菌、放线菌属、炭疽杆菌、枯草杆菌、破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌、破伤风梭菌、白喉棒状杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、红斑丹毒丝菌、单核细胞增生利斯特菌、麻风分枝杆菌、结核分支杆菌、支原体属、诺卡氏菌属、丙酸菌属、绿脓假单胞菌、肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)、耐万古霉素金黄色葡萄球菌(vrsa)、路邓葡萄球菌、腐生葡萄球菌、肺炎链球菌、化脓链球菌或突变链球菌。

63、在一些实施方案中，病原体是真菌、阿米巴原虫或寄生虫。在具体实施方案中，真菌、阿米巴原虫或寄生虫是棘阿米巴属种、美洲锥虫病、狒狒巴拉姆希阿米巴、分歧巴贝虫、双芽巴贝虫、马巴贝虫、微小巴贝虫、邓肯巴贝虫、结肠小袋绦虫、芽囊原虫属种、隐孢子虫属种、环孢子虫、脆弱双核阿米巴、阔节裂头绦虫、亚马逊利什曼原虫、福氏纳格里原虫、恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫柯氏亚种、三日疟原虫、西伯氏鼻孢子虫、牛人肉孢子虫、猪人肉孢子虫、刚地弓形虫、阴道滴虫、布氏锥虫、克氏锥虫和多头绦虫。

64、某些实施方案包括一种将多核苷酸递送至对象中的靶细胞的方法，该方法包括向对象施用包含多核苷酸的寨卡病毒或寨卡病毒样颗粒，其中该多核苷酸不是寨卡病毒多核苷酸，并且该靶细胞是中枢神经系统的细胞。某些实施方案包括一种向对象递送多核苷酸的方法，该方法包括向对象施用包含多核苷酸的寨卡病毒或寨卡病毒样颗粒，其中该多核苷酸不是寨卡病毒多核苷酸，并且该寨卡病毒或寨卡病毒样颗粒不包含复制型寨卡病毒。某些实施方案包括一种向对象递送多核苷酸的方法，该方法包括向对象施用包含多核苷酸的寨卡病毒或寨卡病毒样颗粒，其中该多核苷酸不是寨卡病毒多核苷酸，并且该多核苷酸具有高达约10000个核苷酸的长度。在一些实施方案中，对象患有中枢神经系统的疾病或病症。在一些实施方案中，多核苷酸具有大于约6000个核苷酸的长度。在一些实施方案中，对象是人类或非人类动物。

65、某些实施方案包括一种寨卡病毒或寨卡病毒样颗粒，该寨卡病毒或寨卡病毒样颗粒包含长度为约6,000个核苷酸至约10,000个核苷酸的对寨卡病毒外源的多核苷酸，任选地其中该多核苷酸不编码全长病毒结构蛋白或全长病毒非结构蛋白。在一些实施方案中，根据权利要求7所述的寨卡病毒或寨卡病毒样颗粒，其中该寨卡病毒或寨卡病毒样颗粒由包含该多核苷酸的核酸产生。在一些实施方案中，核酸进一步包含寨卡病毒5’utr和寨卡病毒3’utr。在一些实施方案中，寨卡病毒5’utr与表2、表1a、表1c或表1h的寨卡病毒5’utr至少90％同源或相同。在一些实施方案中，寨卡病毒3’utr与表2、表1a、表1b或表1g的寨卡病毒3’utr至少90％同源或相同。在一些实施方案中，核酸进一步包含编码第一核酶的多核苷酸。在一些实施方案中，核酸进一步包含编码第二核酶的多核苷酸。在一些实施方案中，核酸包含编码寨卡病毒c的衍生物的多核苷酸，其中该寨卡病毒c的衍生物是寨卡病毒c的约或少于约5、10、15、20、25或30个氨基酸的截短物。在一些实施方案中，核酸不包含编码寨卡病毒衣壳蛋白(c)或寨卡病毒c的衍生物的多核苷酸。在一些实施方案中，核酸不包含编码寨卡病毒病毒膜蛋白(prm/m)或寨卡病毒prm/m的衍生物的多核苷酸。在一些实施方案中，核酸不包含编码寨卡病毒病毒包膜蛋白(e)或寨卡病毒e的衍生物的多核苷酸。在一些实施方案中，核酸不包含编码一种或多种非结构(ns)蛋白：(i)ns1、(ii)ns2a、(iii)ns2b、(iv)ns3、(v)ns4a、(vi)ns4b、(vii)ns5或(viii)(i)-(vii)中的两种或更多种的多核苷酸。在一些实施方案中，核酸进一步包含启动子。在一些实施方案中，核酸包含表1a-1k、表2或表3的序列。

66、某些实施方案包括一种核酸组合物，该核酸组合物包含(i)第一寨卡病毒的5’非翻译区(5’utr)，(ii)第二寨卡病毒的3’utr，其中第一寨卡病毒任选地与第二寨卡病毒相同，以及(iii)对第一寨卡病毒和第二寨卡病毒外源的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸的长度为约5000个碱基至约10000个碱基。在一些实施方案中，核酸不包含编码寨卡病毒病毒包膜蛋白(e)或寨卡病毒e的衍生物的多核苷酸；并且核酸不包含编码一种或多种非结构(ns)蛋白：(i)ns1、(ii)ns2a、(iii)ns2b、(iv)ns3、(v)ns4a、(vi)ns4b、(vii)ns5或(viii)(i)-(vii)中的两种或更多种的多核苷酸。在一些实施方案中，核酸组合物包含表1a-1k、表2或表3的序列。在一些实施方案中，对第一寨卡病毒和第二寨卡病毒外源的多核苷酸是本文所述的外源多核苷酸。

技术特征：

1.一种将多核苷酸递送至对象中的靶细胞的方法，所述方法包括向所述对象施用包含所述多核苷酸的寨卡病毒或寨卡病毒样颗粒，其中所述多核苷酸不是寨卡病毒多核苷酸，并且所述靶细胞是中枢神经系统的细胞。

2.一种向对象递送多核苷酸的方法，所述方法包括向所述对象施用包含所述多核苷酸的寨卡病毒或寨卡病毒样颗粒，其中所述多核苷酸不是寨卡病毒多核苷酸，并且所述寨卡病毒或寨卡病毒样颗粒不包含复制型寨卡病毒。

3.一种向对象递送多核苷酸的方法，所述方法包括向所述对象施用包含所述多核苷酸的寨卡病毒或寨卡病毒样颗粒，其中所述多核苷酸不是寨卡病毒多核苷酸，并且所述多核苷酸具有高达约10000个核苷酸的长度。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述对象患有中枢神经系统的疾病或病症。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸具有大于约6000个核苷酸的长度。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述对象为人类或非人类动物。

7.一种寨卡病毒或寨卡病毒样颗粒，所述寨卡病毒或寨卡病毒样颗粒包含对长度为约6,000个核苷酸至约10,000个核苷酸的寨卡病毒外源的多核苷酸，任选地其中所述多核苷酸不编码全长病毒结构蛋白或全长病毒非结构蛋白。

8.根据权利要求1-6中任一项所述的方法或根据权利要求7所述的寨卡病毒或寨卡病毒样颗粒，其中所述寨卡病毒或寨卡病毒样颗粒由包含所述多核苷酸的核酸产生。

9.根据权利要求8所述的方法或寨卡病毒或寨卡病毒样颗粒，其中所述核酸进一步包含寨卡病毒5’utr和寨卡病毒3’utr。

10.根据权利要求9所述的方法或寨卡病毒或寨卡病毒样颗粒，其中所述寨卡病毒5’utr与表2、表1a、表1c或表1h的寨卡病毒5’utr至少90％同源或相同。

11.根据权利要求9或权利要求10所述的方法或寨卡病毒或寨卡病毒样颗粒，其中所述寨卡病毒3’utr与表2、表1a、表1b或表1g的寨卡病毒3’utr至少90％同源或相同。

12.根据权利要求7-11中任一项所述的方法或寨卡病毒或寨卡病毒样颗粒，其中所述核酸进一步包含编码第一核酶的多核苷酸。

13.根据权利要求12所述的方法或寨卡病毒或寨卡病毒样颗粒，其中所述核酸进一步包含编码第二核酶的多核苷酸。

14.根据权利要求7-13中任一项所述的方法或寨卡病毒或寨卡病毒样颗粒，其中所述核酸包含编码寨卡病毒c的衍生物的多核苷酸，其中所述寨卡病毒c的所述衍生物是寨卡病毒c的约或少于约5、10、15、20、25或30个氨基酸的截短物。

15.根据权利要求7-13中任一项所述的方法或寨卡病毒或寨卡病毒样颗粒，其中所述核酸不包含编码寨卡病毒衣壳蛋白(c)或所述寨卡病毒c的衍生物的多核苷酸。

16.根据权利要求7-15中任一项所述的方法或寨卡病毒或寨卡病毒样颗粒，其中所述核酸不包含编码寨卡病毒病毒膜蛋白(prm/m)或寨卡病毒prm/m的衍生物的多核苷酸。

17.根据权利要求7-16中任一项所述的方法或寨卡病毒或寨卡病毒样颗粒，其中所述核酸不包含编码寨卡病毒病毒包膜蛋白(e)或寨卡病毒e的衍生物的多核苷酸。

18.根据权利要求7-17中任一项所述的方法或寨卡病毒或寨卡病毒样颗粒，其中所述核酸不包含编码一种或多种非结构(ns)蛋白：(i)ns1、(ii)ns2a、(iii)ns2b、(iv)ns3、(v)ns4a、(vi)ns4b、(vii)ns5或(viii)(i)-(vii)中的两种或更多种的多核苷酸。

19.根据权利要求7-18中任一项所述的方法或寨卡病毒或寨卡病毒样颗粒，其中所述核酸进一步包含启动子。

20.根据权利要求7-19中任一项所述的方法或寨卡病毒或寨卡病毒样颗粒，其中所述核酸包含表1a-1k、表2或表3的序列。

21.一种核酸组合物，所述核酸组合物包含(i)第一寨卡病毒的5’非翻译区(5’utr)，(ii)第二寨卡病毒的3’utr，其中所述第一寨卡病毒任选地与所述第二寨卡病毒相同，以及(iii)对所述第一寨卡病毒和所述第二寨卡病毒外源的多核苷酸。

22.根据权利要求21所述的核酸组合物，其中所述多核苷酸的长度为约5000个碱基至约10000个碱基。

23.根据权利要求21或权利要求22所述的核酸组合物，其中所述核酸不包含编码寨卡病毒病毒包膜蛋白(e)或寨卡病毒e的衍生物的多核苷酸；并且所述核酸不包含编码一种或多种非结构(ns)蛋白：(i)ns1、(ii)ns2a、(iii)ns2b、(iv)ns3、(v)ns4a、(vi)ns4b、(vii)ns5或(viii)(i)-(vii)中的两种或更多种的多核苷酸。

24.根据权利要求21-23中任一项所述的核酸组合物，其包含表1a-1k、表2或表3的序列。

技术总结
本文公开了用于递送外源多核苷酸的核酸组合物及使用方法。

技术研发人员：卡罗利尼·凯德·达维拉,莫罗·费雷拉·德阿泽维多
受保护的技术使用者：维罗生物公司
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5