一种基于生物活性检测的美洲大蠊乙醇提取物质量检测方法与流程

1.本发明涉及一种体外生物活性测定评价的方法,尤其用于美洲大蠊乙醇提取物。
2.

背景技术：

3.目前，中药的质量标准主要是以通过测定某一个或某几个有效成分的含量来对中药的质量加以控制，且该指标成分在很大程度上不一定是该药品的药效成分或主要药效成分，即使为主要药效成分，由于其含量较低与临床有效剂量间缺乏相关性，因此，该指标成分测定也往往不一定能代表总体生物活性。最为关键的是对于组成药物多、成分及其复杂的中药制剂，很难用其中某个化学成分来阐述其药效。其次，中成药虽然经过了主要药效学及临床研究表明其具有有效性，但药效学研究和临床研究时样品的代表性、可靠性以及中药活性成分的可变性，不能保证每批产品是否仍然具有药效作用，其重现性一般未经验证。最后，中药制剂在生产过程中原料来源发生改变时、生产工艺改进时、在考核产品稳定时认为只要满足目前的药品标准即可，一般对生物活性可能发生改变考虑甚少。因此，存在某些药品虽然仍满足目前的药品标准，但其生物活性已经发生了很大的变化。对此，《中国药典》2010年、2015年和2020年版提出了中药生物活性测定指导原则(9105)。由该指导原则指出生物活性测定法是以药物的生物效应为基础，以生物统计为工具，运用特定的实验设计，测定药物有效性的一种方法，从而达到控制药品质量的作用。
4.美洲大蠊乙醇提取物/康复新液系美洲大蠊干燥虫体乙醇提取物制成的一种中药溶液，功能主治为：“通利血脉，养阴生肌”。美洲大蠊乙醇提取物/康复新液主要应用于以皮肤损伤和黏膜损伤为病理特征的疾病，其在抗炎、消除炎性水肿，促进新生肉芽组织生长，迅速修复溃疡面，缩短伤口愈合时间等其它方面具有显著的疗效。目前，国家药品监督管理局国家药品标准（ws3-b3674-2000(z)）美洲大蠊乙醇提取物质量标准收载了性状、鉴别、检查及含量测定等内容，根据现有质量标准难以全面评价美洲大蠊乙醇提取物的品质。
5.本发明专利基于《中国药典》中药生物活性测定指导原则(9105)建立了人永生化表皮细胞（hacat细胞）细胞增殖法/mtt比色法用于美洲大蠊乙醇提取物生物活性质量控制和品质评价方法，可以体现美洲大蠊乙醇提取物/康复新液药物功效特点，补充和完善现有的美洲大蠊乙醇提取物/康复新液质量控制模式的不足，完善现有的质量控制标准，使其临产用药更为安全和有效。
6.

技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种用于美洲大蠊乙醇提取物体外生物活性测定评价的方法。
8.本发明的用于美洲大蠊乙醇提取物体外生物活性测定评价的方法包括下述步骤：a. 标准品溶液和标准品稀释液的配制：将标准品冻干粉用无菌 pbs溶液重悬为500 μ
g/ml；再用维持培养基稀释至每 1ml 含 200 ng/ml的标准品稀释液；b. 供试品溶液和供试品稀释液的配制：美洲大蠊乙醇提取物样品，首先用bca 法测定样品的浓度，根据样品起始浓度用维持培养基将其稀释至31.25ug/ml ～125 ug/ml 范围内。
9.c. 测定实验操作如下：（1）hacat细胞株用完全培养基于 37℃，5% co2条件下培养，控制细胞浓度为1.0
×
10 5 ~5.0
×
10 5
细胞/ml 进行传代，传代后 24~36 小时用于生物学活性检测；（2）弃上清，消化并收集细胞，用完全培养基配成 5.0
×
10 4
细胞/ml；（3）接种于 96 孔细胞培养板中，每孔 100 μl，于 37℃，5% co2条件下过夜培养；（4）制备的细胞培养板弃去维持液，加入 200μl 标准品溶液和不同浓度的供试品溶液样品，于37℃，5% co 2 条件下培养，以维持培养基培养的细胞作为空白对照；（5）在培养 48 小时时，每孔加入 20 μl mtt，继续培养 4 小时直至紫色沉淀出现，终止培养，小心弃上清，每孔加入 100 μl dmso，吹打混匀，使晶体充分溶解；（6）使用酶标仪测定吸光值，根据测得的吸光值，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
10.d. 结果判定与现有技术相比，本技术的生物效价检定方法是以美洲大蠊乙醇提取物的“功能与主治”为基础，在细胞水平上从整体上对美洲大蠊乙醇提取物的生物活性进行直观测定评价。
11.具体地，与现有的美洲大蠊乙醇提取物质量评价方法相比，本技术的美洲大蠊乙醇提取物生物效价检定方法具有如下优点：（1）在含量测定评价的基础上增加生物评价的方法，以补充和完善质量控制模式的不足，同时满足生产和临床上对可靠、有效的药物质量评价方法的需求。
12.（2）以生物评价为核心的中药质量控制模式及方法与临床功效关联更为紧密，可有效反映其内在质量和临床疗效。
13.（3）对于美洲大蠊乙醇提取物化学成分复杂、理化方法不能表征其含量及理化测定不能反映生物活性和临床疗效的中药而言，生物活性检测方法更具有优越性。
14.总之，本发明提供的hacat细胞株/mtt比色法是以美洲大蠊乙醇提取物的“功能与主治”为基础，可以准确、系统地检测美洲大蠊乙醇提取物临床药效，对美洲大蠊提取物进程统一的生物效价标示，在美洲大蠊乙醇提取物生产过程中作为质量控制的手段。
15.附图说明
16.图1在不同血清浓度条件下hacat细胞株细胞增殖情况；图2 1%血清浓度下egf和fgf对hacat细胞增殖影响；图3 2%血清浓度下egf和fgf对hacat细胞增殖影响；图4 美洲大蠊乙醇提取液对hacat细胞增殖影响图5 不同批次的美洲大蠊乙醇提取液对hacat细胞增殖影响
具体实施方式
17.实施例1不同浓度的血清对hacat细胞株增殖的影响(1) 相关实验试剂及不同浓度血清的配制（a）rpmi 1640培养基；（b）完全培养基：在900 ml rpmi 1640培养基中加入100 ml hyclone公司的胎牛血清，血清终浓度为10%；（c）mtt溶液：采购自sigma公司，货号：m2128，使用pbs配制浓度5 mg/ml mtt，0.22 μm过滤除菌，-20度冻存；（d）国产dmso；（e）不同血清浓度培养基的制备：制备血清浓度分别为0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、10%的细胞培养基。在96孔细胞培养板中，做不同血清浓度稀释，共10个稀释度，每个稀释度做3个复孔。
18.(2) 实验步骤（a）hacat细胞株用完全培养基于37℃，5% co2条件下培养，控制细胞浓度为1.0
×
105~5.0
×
105细胞/ml进行传代，传代后24~36小时用于生物学活性检测；（b）弃上清，消化并收集细胞，用完全培养基配成5
×
104细胞/ml；（c）接种于96孔细胞培养板中，每孔100 μl，即5000个细胞/孔，于37℃，5% co2条件下培养；(d) 弃去细胞完全培养基，换成不同血清浓度的细胞培养基，于37℃，5% co2条件下培养，并于24小时和48小时观察细胞的生长状况；（e）细胞培养48小时时检测hacat细胞株增殖情况。
19.(3) 实验结果与分析实验结果显示：在血清含量为0.5%和1%的条件下，hacat细胞株能够保持一定的活力。在血清含量大于等于2%的条件下，hacat细胞株保持较好的活力，说明在血清含量大于等于2%的条件情况下，可维持细胞的形态和正常的生长。在不同血清浓度的条件下培养hacat细胞株，细胞增殖情况如图1所示。
20.实施例2重组人表皮生长因子和重组人碱性成纤维细胞生长因子对hacat细胞增殖影响(1) 相关实验试剂及相关溶液的配制（a）rpmi 1640培养基（b）维持培养基：在9.9 ml rpmi 1640培养基中加入0.1 ml hyclone公司的胎牛血清，血清终浓度为1%；在19.6 ml rpmi 1640培养基中加入0.4 ml hyclone公司的胎牛血清，血清终浓度为2%；（c）完全培养基：在900 ml rpmi 1640培养基中加入100 ml hyclone公司的胎牛血清，血清终浓度为10%；（d）mtt溶液：采购自sigma公司，货号：m2128，使用pbs配制浓度5 mg/ml mtt，0.22 μm过滤除菌，-20度冻存；（e）国产dmso（f）重组人碱性成纤维细胞生长因子：采购自r&d systems，货号：233-fb-025/cf，规格
25μg，活力为800iu/μg。
21.标准品溶液的制备：取重组人碱性成纤维细胞生长因子，用无菌pbs重悬为100 μg/ml，即在25 μg的冻干粉中加入250 μl无菌pbs，活力为80 iu/μl。分装为5μl/支，冻存于-70℃。
22.用1%血清浓度的维持培养基稀释至每1ml含50 ng/ml b-fgf，即1.5 ml 1%血清浓度的维持培养基中加入0.75 μl上述b-fgf的蛋白重悬液。在96孔细胞培养板中，做2倍系列稀释，共2个稀释度，每个稀释度做3孔。
23.用2%血清浓度的维持培养基稀释至每1ml含50 ng/ml b-fgf，即3 ml 2%血清浓度的维持培养基中加入1.5 μl上述b-fgf的蛋白重悬液。在96孔细胞培养板中，做2倍系列稀释，共2个稀释度，每个稀释度做3孔。
24.（g）重组人表皮生长因子：采购自r&d systems，货号：236-eg-200，规格200μg，活力为1400iu/μg。
25.hregf标准品溶液的制备：重组人表皮生长因子，用无菌pbs重悬为500 μg/ml，即在200μg的冻干粉中加入400μl无菌pbs，活力为700iu/μl。分装为5μl/支，冻存于-70℃。
26.用1%血清浓度的维持培养基稀释至每1ml含100 ng/ml hregf，即1.5 ml 1%血清浓度的维持培养基中加入0.3 μl上述hregf的蛋白重悬液。在96孔细胞培养板中，做2倍系列稀释，共2个稀释度，每个稀释度做3孔。
27.用2%血清浓度的维持培养基稀释至每1ml含100 ng/ml hregf，即3ml 2%血清浓度的维持培养基中加入0.6 μl上述hregf的蛋白重悬液。在96孔细胞培养板中，做2倍系列稀释，共2个稀释度，每个稀释度做3孔。
28.(2)实验步骤（a）hacat细胞株用完全培养基于37℃，5% co2条件下培养，控制细胞浓度为1.0
×
105~5.0
×
105细胞/ml进行传代，传代后24~36小时用于生物学活性检测；（b）弃上清，消化并收集细胞，用完全培养基配成5.0
×
104细胞/ml；（c）接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl，即5000个细胞/孔，于37℃，5% co2条件下过夜培养；（d）制备的细胞培养板弃去完全培养基，分别加入200μl不同浓度的标准品溶液hregf和b-fgf，于37℃，5% co2条件下培养24小时和48小时，以不同血清浓度的维持培养基培养的细胞作为空白对照；（e）检测细胞的生长状况。
29.(3) 实验结果与分析在1%和2%血清浓度的维持培养基下，100 ng/ml和200 ng/ml重组人表皮细胞生长因子以及50 ng/ml和100 ng/ml b-fgf b-fgf均能够促进hacat细胞生长；具体细胞增殖情况见图2和图3。
30.实施例3美洲大蠊乙醇提取物中间体对hacat细胞株增殖的影响(1) 相关实验试剂及相关溶液的配制（a）rpmi 1640培养基；（b）维持培养基：在27 ml rpmi 1640培养基中加入3 ml含10%胎牛血清的rpmi 1640培养基，血清终浓度为1%；
（c）完全培养基：在900 ml rpmi 1640培养基中加入100 ml胎牛血清，血清终浓度为10%；（d）mtt溶液：采购自sigma公司，货号：m2128，使用pbs配制浓度5 mg/ml mtt，0.22 μm过滤除菌，-20度冻存；（e）国产dmso；（f）重组人表皮生长因子：采购自r&d systems，货号：236-eg-200，规格200μg，活力为1400iu/μg。hregf标准品溶液的制备同实施例2。
31.（g）美洲大蠊乙醇提取物（批号b190311，标记为kfx
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b190311）来自四川好医生攀西药业集团有关责任公司；不同浓度的kfx-b190311溶液的制备：用1%血清浓度的维持培养基稀释至每1ml含0.5 mg/ml kfx-b190311中间体，即3.69 ml 1%血清浓度的维持培养基中加入310 μl上述的kfx-b190311。在96孔细胞培养板中，做2倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做4孔（最终选取三个孔进行统计分析）。
32.(2) 实验步骤（a）hacat细胞株用完全培养基于37℃，5% co2条件下培养，控制细胞浓度为1.0
×
105~5.0
×
105细胞/ml进行传代，传代后24~36小时用于生物学活性检测；（b）弃上清，消化并收集细胞，用完全培养基配成5.0
×
104细胞/ml；（c）接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl，即5000个细胞/孔，于37℃，5% co2条件下过夜培养；（d）制备的细胞培养板弃去完全培养基，分别加入200μl标准品溶液hregf和kfx-b190311，于37℃，5% co2条件下培养24小时和48小时，以不同血清浓度的维持培养基培养的细胞作为空白对照；（e）检测细胞的生长状况。
33.(3) 实验结果实验结果显示：在1%血清浓度的维持培养基下，重组人表皮生长因子能够显著促进hacat细胞生长；在1%血清浓度的维持培养基下，48小时时低浓度kfx-b190311（小于等于62.5 μg/ml）具有促进hacat细胞增殖的作用，见图4。
34.实施例4不同批次的美洲大蠊乙醇提取物中间体对hacat细胞株增殖的影响(1) 相关实验试剂及相关溶液的配制相关实验试剂同实施例3，4个不同批次的美洲大蠊乙醇提取物（b190303、b190307、b190310及b190502）来自四川好医生攀西药业集团有关责任公司；不同浓度的美洲大蠊乙醇提取物溶液制备同实施例3。
35.(2) 实验步骤：同实施例3中实验步骤(3) 实验结果实验结果显示：在1%血清浓度的维持培养基下，48小时时不同批次的美洲大蠊乙醇提取物一定范围内浓度条件下（31.25ug/ml ～125 ug/ml）均具有促进hacat细胞增殖的作用，具体见图5。
36.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明做了详尽的描述，但在本发明的基础上，可以对之做一些修改或改进，如利用不同的细胞系如：小鼠胚胎成纤维细
胞系balb/c 3t3、大鼠正常胃粘膜上皮细胞rgm1、人胃粘膜上皮细胞ges-1等等，用类似的方法进行相关研究，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改和改进，均落入本发明的保护范围内。

技术特征：
1.一种既于美洲大蠊乙醇提取物体外生物活性评价方法包括以下步骤：a.标准品溶液和标准品稀释液的配制：将标准品冻干粉用无菌 pbs溶液重悬为500 μg/ml；再用维持培养基稀释至每 1ml 含 200 ng/ml的标准品稀释液；b.供试品溶液和供试品稀释液的配制：美洲大蠊乙醇提取物样品，首先用bca 法测定样品的浓度；根据样品起始浓度用维持培养基将其稀释至31.25ug/ml～125 ug/ml范围内；c.测定实验操作如下：（1）hacat细胞株用完全培养基于 37℃，5% co2条件下培养，控制细胞浓度为1.0
×
10 5 ~5.0
×
10 5
细胞/ml 进行传代，传代后 24~36 小时用于生物学活性检测；（2）弃上清，消化并收集细胞，用完全培养基配成 5.0
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细胞/ml；（3）接种于 96 孔细胞培养板中，每孔 100 μl，于 37℃，5% co2条件下过夜培养；（4）制备的细胞培养板弃去维持液，加入 200μl 标准品溶液和不同浓度的供试品溶液样品，于37℃，5% co 2 条件下培养，以维持培养基培养的细胞作为空白对照；（5）在培养 48 小时时，每孔加入 20 μl mtt，继续培养 4 小时直至紫色沉淀出现，终止培养，小心弃上清，每孔加入 100 μl dmso，吹打混匀，使晶体充分溶解；（6）使用酶标仪测定吸光值，根据测得的吸光值，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线；d.结果判定。2.如权利要求1所述的生物检定方法，其特征在于所述阳性对照标准品为重组人表皮生长因子hegf。3.如权利要求1所述的生物检定方法，其特征在于所述细胞为非肿瘤来源的人正常皮肤永生化角质形成细胞株hacat细胞。

技术总结
本发明提供一种基于生物活性检测的美洲大蠊乙醇提取物质量检测方法，可有效解决美洲大蠊乙醇提取物质量控制问题。该方法以美洲大蠊乙醇提取物的“功能与主治”为基础，通过建立的人永生化表皮细胞（HaCAT细胞）细胞增殖法/MTT比色法可以实现对美洲大蠊乙醇提取物生物活性质量控制和品质进行很好的评价。本发明方法重新现好、直观，可用于对美洲大蠊乙醇提取物生物活性进行测定，以达到综合评介和控制产品质量的目的，是中药质量控制和评价方法上的创新。创新。创新。


技术研发人员：耿福能 姜顺日 王杉杉 刘彬 吴桃清 张扬 沈咏梅 林庆华 耿越飞
受保护的技术使用者：四川好医生攀西药业有限责任公司
技术研发日：2020.09.08
技术公布日：2022/3/7