鸡TRIM13基因SNP分子标记在鸡生长及屠宰性状改良育种中的应用及育种方法

鸡trim13基因snp分子标记在鸡生长及屠宰性状改良育种中的应用及育种方法
技术领域
1.本发明涉及鸡trim13基因snp分子标记在鸡生长及屠宰性状改良育种中的应用及育种方法，属于生物育种技术领域。


背景技术：

2.肉是最有价值的畜产品，尽管发达国家的肉类消费量相对固定，但自1980年以来，发展中国家的人均肉类年消费量翻了一番。人口和收入的增长，以及食品偏好的变化，都增加了对畜产品的需求。纵观全球，鸡肉是仅次于猪肉的世界第二大肉类消费品，鸡肉消费在所有肉类消费总量中比例最高约为35％(猪肉为37％)，且在2012-2014年间鸡肉消费总量每年仍以约1.6％(大于猪肉的1.1％)比例上升(http://www.fao.org/ag/againfo/themes/en/meat/background.html)，提高鸡体重及鸡肉产量是现代育种工作的重要任务。生长性状如体重作为畜禽主要的经济性状，如何在种质特性不改变的情况下提高地方畜禽品种的经济性状，维护地方畜禽的可持续发展是急需解决的问题。因此，有必要开发新的遗传标记，借助分子生物学手段加快遗传改良工作进程，从而缩短育种时间，加快育种进程。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供鸡trim13基因snp分子标记在鸡生长及屠宰性状改良育种中的应用。
4.本发明的另一个目的是提供一种基于鸡trim13基因snp分子标记的鸡生长及屠宰性状改良育种的方法，该方法能够用于选育高体重或大体型鸡种。
5.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
6.本发明提供鸡trim13基因snp分子标记在鸡生长及屠宰性状改良育种中的应用，所述snp分子标记的核苷酸序列如seq id no.1所示，5’端起第123位碱基为c或t；所述应用为对鸡trim13基因snp分子标记的基因型进行检测，当snp分子标记的基因型为cc时，待测鸡为高体重、大体型个体，当snp分子标记的基因型为tt时，待测鸡为低体重、小体型个体。
7.具体的，通过试剂盒检测鸡trim13基因snp分子标记的基因型。
8.所述试剂盒包含如seq id no.3和seq id no.4所示的引物对，以及限制性内切酶bsp1286i。
9.优选的，所述试剂盒还包括dntps、pcr反应缓冲液、dna聚合酶中的一种或几种。
10.本发明提供一种基于鸡trim13基因snp分子标记的鸡生长及屠宰性状改良育种的方法，该方法包括以下步骤：以待测鸡的基因组dna为模板，用seq id no.3和seq id no.4所示的引物对进行pcr扩增，对pcr产物用bsp1286i内切酶进行酶切反应，若酶切产物为189bp，突变处碱基为纯合tt型，若酶切产物为122/67bp，则突变处碱基为纯合cc型，若酶切产物为189/122/67bp，则突变处碱基为杂合ct型；当snp分子标记的基因型为cc时，待测鸡为高体重、大体型个体，当snp分子标记的基因型为tt时，待测鸡为低体重、小体型个体；选
留cc基因型的鸡个体。
11.优选的，所述pcr扩增的反应体系为：2
×
taq pcr mastermix 10μl，ddh2o 6μl，上游引物p-f 1μl，下游引物p-r 1μl，dna模板2μl。
12.优选的，所述pcr扩增的反应程序为：95℃5min；95℃15s，60℃15s，72℃5s，共35个循环；72℃5min，4℃保存。
13.优选的，所述酶切反应的体系为25ul，包括pcr产物22.5ul、10
×
buffer 2ul以及bsp1286i 0.5ul。
14.优选的，通过琼脂糖凝胶电泳检测所述酶切产物的大小，以判断snp分子标记的基因型。
15.优选的，所述琼脂糖凝胶电泳检测采用的琼脂的质量分数为2.0％，电压为120v，电泳时间为30min。
16.上述基于鸡trim13基因snp分子标记的鸡生长及屠宰性状改良育种方法，能够应用于选育高体重或大体型鸡种。
17.本发明的有益效果在于：
18.本发明提供了鸡trim13基因snp分子标记在鸡生长及屠宰性状改良育种中的应用：首先以766个表型数据记录完整的固始-安卡f2资源群鸡为研究对象进行全基因组关联分析，然后对表型记录详细的f2资源群trim13基因第3内含子区第87位碱基进行了大规模的snp分型工作以验证以上snp位点的准确性。本发明证明了位于鸡trim13基因第3内含子区第87位碱基存在的1处snp分子标记，其核苷酸序列如seq id no.1所示，5’端起第123位碱基为c或t；(t-c，rs732405671)，与鸡生长性状(体重、胫长、胫围、胸深、胸宽、胸骨长、体斜长、盆骨宽)及屠宰性状(全净膛、肝脏重、心脏重、脾重、爪重)显著相关。该snp位点的等位基因t与低体重性状正相关，等位基因c与高体重性状正相关，杂合等位基因ct的表型性状处于中间值。体重是鸡的重要经济性状，而胫围和胸骨长等性状与鸡体型大小强相关，该snp位点为筛选出纯合高品质的地方鸡群体奠定基础。对该snp分子标记基因型进行检测，能够早期、有效的预测鸡成熟期体重，可作为鸡品种遗传改良的分子标记，从而缩短育种时间，加快育种进程，具有很大的经济应用价值和科研价值。
19.本发明进一步提供了基于鸡trim13基因snp分子标记的鸡生长及屠宰性状改良育种方法：在鸡trim13基因第3内含子区第87位碱基snp位点上下游设计引物，并利用bsp1286i酶采用pcr-rflp方法检测snp分子标记的基因型。本发明提供了引物核苷酸序列、pcr扩增反应体系及反应条件、pcr扩增程序、酶切反应体系以及酶切产物电泳条件，并明确了snp分子标记基因型与鸡生长性状的对应关系，即当snp分子标记的基因型为cc时，待测鸡为高体重、大体型个体，当snp分子标记的基因型为tt时，待测鸡为低体重、小体型个体。选留cc纯合基因型的鸡个体进行培育，弃去tt、ct基因型的鸡个体，即可获得具有高体重、大体型的优良生长性状的鸡种质资源。该方法可操作性强，不需要特殊的仪器，易推广普及，能够早期、快速、低成本、有效的预测鸡的体重和体型大小，可以用于鸡的辅助选择和分子育种，在鸡种质资源改良方面具有广阔的应用前景。
附图说明
20.图1是不同基因型突变位置序列峰图；
21.图2是bsp1286i内切酶分析示意图；
22.图3是三种基因型bsp1286i酶切后琼脂糖电泳结果图。
具体实施方式
23.下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此；若未特别指明，实施例中所用的设备和试剂均常规市售可得。
24.实施例1：与鸡生长及屠宰性状相关的snp分子标记的获得
25.以766个表型数据记录完整的固始-安卡f2资源群鸡为研究对象进行全基因组关联分析。由河南省家禽种质资源创新研究中心已构建的固始-安卡f2资源群由4个正交家系(安卡公鸡
×
固始母鸡)和3个反交家系(固始公鸡
×
安卡母鸡)组成，经济性状测定方法如下：每2周测定体重、每4周测量体尺指标，饲喂至12周龄时屠宰。宰前停料12小时(不停水)后称重。测定的生长、屠宰指标及肉质指标共57项指标。(参考han r l,li z j,li m j,et al.novel9-bp indel in visfatin gene and its associations with chicken growth.br poult sci,2011,52(1):52-57.)。本研究利用简化基因组测序对该资源群的766只鸡进行基因分型，质控和去除性染色体上的snp后，共余734只鸡的321314个snp。基于基因分型数据和表型数据对该资源群不同周龄体重(2周、4周、6周、8周、10周和12周)，4周、8周和12周胫长、胫围、体斜长、胸骨长等生长性状以及12周屠宰性状进行全基因组关联分析，研究发现，位于鸡trim13基因第3内含子区第87位碱基存在的1处snp分子标记，其核苷酸序列如seq id no.1所示，5’端起第123位碱基为c或t；(t-c，rs732405671)，与鸡10周体重、12周体重、8周胫围、12周胫围、12周胸骨长、肌胃重和爪重均显著相关(表1)。
26.表1全基因组关联分析中该snp与固始-安卡鸡f2资源群多个性状显著相关
[0027][0028]
注：全基因组关联分析中-log
10
(p)》5.72表明达到了显著水平。
[0029]
对表型记录详细的f2资源群trim13基因第3内含子区第87位碱基进行了大规模的snp酶切分型工作以验证以上snp位点的准确性，进一步对snp分型结果与f2资源群经济性状进行关联分析发现该分子标记与鸡的多个生长性状密切相关及屠宰性状(表2)。cc基因型群体的平均体重、胫围、胸骨长略高于ct群体平均体重、胫围、胸骨长，显著高于tt型群体平均体重、胫围、胸骨长。体重是鸡的重要经济性状，而胫围和胸骨长与鸡体型大小强相关；
cc基因型群体的平均全净膛重、肝脏重、爪重略高于ct群体平均全净膛重、肝脏重、爪重，显著高于tt型群体平均全净膛重、肝脏重、爪重。全净膛率是鸡的重要屠宰指标，是衡量畜禽产肉性能的主要指标；以上结果进一步证实了上述的关联分析结果：鸡trim13基因第3内含子区第87位碱基的t-c突变(图1)的snp位点与鸡生长性状、屠宰性状显著相关，其中等位基因c与高体重性状正相关，等位基因t与低体重性状正相关。当snp分子标记的基因型为cc时，待测鸡为高体重、大体型个体，当snp分子标记的基因型为tt时，待测鸡为低体重、小体型个体。
[0030]
表2固始-安卡f2资源群不同基因型对应的表型统计量
[0031][0032]
注：a,b同一行上标不同者表明达到了极显著水平(p《0.01)。
[0033]
实施例2：用于检测鸡trim13基因snp分子标记基因型的试剂盒
[0034]
本实施例中的剂盒包括检测实施例1获得鸡trim13基因snp分子标记的引物和限制性内切酶bsp1286i，引物序列如表3所示：
[0035]
表3trim13基因snp检测引物
[0036][0037]
还包括dntps、pcr反应缓冲液、dna聚合酶中的一种或几种。
[0038]
实施例3：基于鸡trim13基因snp分子标记的鸡生长及屠宰性状改良育种方法
[0039]
根据实施例1中获得的snp分子标记的基因组信息和ncbi公布的鸡trim13基因序列(ensgalg00000017011:ensgalt00000027478.6)，设计引物扩增trim13基因第3内含子区的部分序列，引物核苷酸序列如seq id no.3以及seq id no.4所示。
[0040]
首先，以待测鸡的基因组dna为模板，用seq id no.3和seq id no.4所示的引物对进行pcr扩增：
[0041]
pcr扩增的反应体系为：2
×
taq pcr mastermix 10μl，ddh2o 6μl，上游引物p-f 1μl，下游引物p-r 1μl，dna模板2μl；
[0042]
pcr扩增的反应程序为：95℃5min；95℃15s，60℃15s，72℃5s，共35个循环；72℃5min，4℃保存。
[0043]
其次，利用限制性内切酶长度多态性(rflp,restriction fragment length polymorphism)，对pcr产物用bsp1286i内切酶进行酶切鉴定：该位置碱基为c时则能被bsp1286i酶切，为t时则不能被bsp1286i酶切，借此用于分型(如图2)。
[0044]
酶切反应的体系为25ul，包括pcr产物22.5ul、10
×
buffer 2ul以及bsp1286i 0.5ul(见表4)；
[0045]
表4 trim13酶切反应体系
[0046][0047]
最后，通过琼脂糖凝胶电泳检测所述酶切产物的大小，以判断snp分子标记的基因型；琼脂糖凝胶电泳检测采用的琼脂的质量分数为2.0％，电压为120v，电泳时间为30min；
[0048]
若酶切产物为189bp，突变处碱基为纯合tt型，若酶切产物为122/67bp，则突变处碱基为纯合cc型，若酶切产物为189/122/67bp，则突变处碱基为杂合ct型；当snp分子标记的基因型为cc时，待测鸡为高体重、大体型个体，当snp分子标记的基因型为tt时，待测鸡为低体重、小体型个体；选留cc纯合基因型的鸡个体进行培育，弃去tt、ct基因型的鸡个体，即可获得具有高体重、大体型的优良生长性状的鸡种质资源。
[0049]
三种基因型bsp1286i酶切后琼脂糖电泳结果如图3所示，其中泳道7：dna marker(700，600，500，400，300，200和100bp)；泳道1、2、3为两条带，条带大小为122和67bp，命名为基因型纯合cc型；泳道4、5、6为一条带，条带大小为189bp，命名为基因型纯合tt型；泳道7、8、9为三条带，条带大小分别为189、122和67bp，命名为基因型杂合ct型；由图3可知，1、2、3个体为高体重、大体型的鸡，需留作种用；4、5、6、7、8、9个体为低体重、小体型的鸡，需弃去；基于以上trim13基因snp分子标记的基因分型结果进行高体重、大体型鸡种的选育。

技术特征：
1.一种鸡trim13基因snp分子标记在鸡生长及屠宰性状改良育种中的应用，其特征在于，所述snp分子标记的核苷酸序列如seq id no.1所示，5’端起第123位碱基为c或t。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，对鸡trim13基因snp分子标记的基因型进行检测，当snp分子标记的基因型为cc时，待测鸡为高体重、大体型个体，当snp分子标记的基因型为tt时，待测鸡为低体重、小体型个体。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，通过试剂盒检测鸡trim13基因snp分子标记的基因型，所述试剂盒包含如seq id no.3和seq id no.4所示的引物对，以及限制性内切酶bsp1286i。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括dntps、pcr反应缓冲液、dna聚合酶中的一种或几种。5.一种基于鸡trim13基因snp分子标记的鸡生长及屠宰性状改良育种方法，其特征在于：包括以下步骤：以待测鸡的基因组dna为模板，用seq id no.3和seq id no.4所示的引物对进行pcr扩增，对pcr产物用bsp1286i内切酶进行酶切反应，若酶切产物为189bp，突变处碱基为纯合tt型，若酶切产物为122/67bp，则突变处碱基为纯合cc型，若酶切产物为189/122/67bp，则突变处碱基为杂合ct型；当snp分子标记的基因型为cc时，待测鸡为高体重、大体型个体，当snp分子标记的基因型为tt时，待测鸡为低体重、大体型个体；选留cc纯合基因型的鸡个体。6.根据权利要求5所述的鸡生长及屠宰性状改良育种方法，其特征在于：所述pcr扩增的反应体系为：2
×
taq pcr mastermix 10μl，ddh2o 6μl，上游引物p-f 1μl，下游引物p-r 1μl，dna模板2μl。7.根据权利要求5所述的鸡生长及屠宰性状改良育种方法，其特征在于：所述酶切反应的体系为25ul，包括pcr产物22.5ul、10
×
buffer 2ul以及bsp1286i 0.5ul。8.根据权利要求5所述的鸡生长及屠宰性状改良育种方法，其特征在于：通过琼脂糖凝胶电泳检测所述酶切产物的大小，以判断snp分子标记的基因型。9.根据权利要求8所述的鸡生长及屠宰性状改良育种方法，其特征在于：所述琼脂糖凝胶电泳检测采用的琼脂的质量分数为2.0％，电压为120v，电泳时间为30min。10.如权利要求5所述的鸡生长及屠宰性状改良育种方法在选育高体重或大体型鸡种中的应用。

技术总结
本发明涉及鸡TRIM13基因SNP分子标记在鸡生长及屠宰性状改良育种中的应用及育种方法，属于生物育种技术领域。本发明通过研究发现鸡TRIM13基因第3内含子区第87位碱基的1处SNP位点(T-C，rs732405671)与鸡生长性状及屠宰性状显著相关。该SNP位点的等位基因T与低体重性状正相关，等位基因C与高体重性状正相关，杂合等位基因CT的表型性状处于中间值。对该SNP分子标记基因型进行检测，能够早期、有效的预测鸡成熟期体重，可作为鸡品种遗传改良的分子标记，从而缩短育种时间，加快育种进程。本发明提供了基于鸡TRIM13基因SNP分子标记的鸡生长及屠宰性状改良育种方法，能够用于选育高体重或大体型鸡品种。大体型鸡品种。大体型鸡品种。


技术研发人员：康相涛 张彦华 李转见 韩瑞丽 李东华 孙桂荣 田亚东 闫峰宾 蒋瑞瑞 李红 李国喜 刘小军 王彦彬 李文婷 黄河天 宋素芳
受保护的技术使用者：河南农业大学
技术研发日：2020.09.08
技术公布日：2022/3/7