一种治疗白血病的药品配方的制作方法

1.本发明涉及一种中药配方，特别涉及一种治疗白血病的药品配方。


背景技术：

2.急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，aml)是一种发生于造血干/祖细胞的、具有异质性的恶性增殖性疾病，主要以大量的白血病细胞在骨髓等造血组织中增殖、积聚，抑制正常造血功能，并向髓外组织侵犯形成浸润病灶为特征。在成人和儿童的发生率分别为90％和15％-20％。急性白血病在我国的发病率每年呈上升趋势，已经达到5.68/10万，目前在恶性肿瘤的发病率中为第17位，死亡率是恶性肿瘤疾病中的第8位。
3.目前aml的治疗主要以化学治疗为主，当前随着化疗方案的改进，50％-85％的患者经标准方案诱导化疗可获得完全缓解，但不少患者会出现复发并进展为难治性白血病导致死亡。因此，进一步深入研究aml的发病机制，探寻aml治疗的新方法，对改善aml患者的生存率具有重要意义。
4.白血病相当于中医学“急劳”、“瘤积”、“癥瘕”、“热劳”、“虚劳”、“温病”、“血证”的范畴。在中医古书中虽然没有“白血病”名称的记载,但其中描述的“急劳”、“热劳”、“虚劳”等病的临床表现与现代医学中白血病的临床病症表现极为相似，因此，根据急性白血病的临床病症表现，可将其归属于“虚劳”、“温病”、“血证”、“积聚”、“瘰疬”、“癥积”、“急劳”、“血癌”、“痰核”等范畴，而急性白血病当属“虚劳”中的“急劳”范畴[3]，“虚”贯穿于aml发生发展的整个阶段。aml又被称为血癌，其病位在骨髓，责之于肝、脾、肾，五脏六腑皆有影响。《张氏医通》中说：“血之源头在乎肾，气之源头在乎脾”，肾乃先天之本，主骨生髓；脾乃后天之本，化水谷而生精气，其精气能摄血生血，由此可知，脾肾乃是血液化生的源头，脾肾亏虚则或气血生化乏源，或血液失于固摄而出血；另外，肝乃藏血之本，肝失疏泄则气血运行失常。
[0005]
在中医中，aml的病因病机分为三种。其一外邪热毒或内火发病，毒淫骨髓，发为急劳、温毒；其二痰瘀、饮食、劳欲,邪毒伤及脾胃，健运失司，湿聚生痰，复感邪毒，痰瘀热互结，日久发为痰核、癥积；其三脏气内损，肺脾肾受损，邪毒乘虚侵入或伏火外发，损及骨髓，耗气伤津，正虚邪恋，痰瘀毒结，形成虚劳癥积、痰毒肿核。《内经》曰：“正气内存，邪不可干，邪之所凑，其气必虚”。aml患者往往是正虚邪实，虚实夹杂。《素问
·
上古天真论》曰：“女子七岁，肾气盛，齿更发长，
……
七七任脉虚，太冲脉衰少，天癸竭，地道不通，故形坏而无子也。丈夫八岁，肾气实，发长齿更
……
八八天癸竭，精少，肾脏衰，形体皆极，则齿发去”。aml患者脏腑虚损，内生邪气，适逢外邪，内外之邪互结而发病，内邪不易消，外邪不易清，则迁延不愈，是为正虚邪实。aml特点是肾精亏虚，脏腑失养，功能失调，尤以肺脾肝肾。脾运失司，气血乏源，内生湿、痰阴邪；肝肾阴虚，肝体失养，肝气郁滞，疏泄失调；肺气不足，布津不畅，津聚成痰。湿、痰为有形之邪可阻于经脉，气机不畅，气滞血瘀。复感外邪(热、火、毒等)入侵，与内生痰、湿、瘀等阴邪合而致病，损及骨髓，出现虚实夹杂临床表现，且内外之邪互结，难以彻底清除。
[0006]
多项现代药理研究证实一些中药均具有抗肿瘤、提高患者免疫功能的作用。研究
发现，黄连解毒汤能增强荷瘤小鼠体内自然杀伤(nk)细胞的杀伤功能及t淋巴细胞分泌白细胞介素4(il-4)的能力，调节体液免疫功能。四君子汤中的药物可激活体内免疫系统释放具有抗肿瘤作用的细胞因子，提高机体免疫力，活化t淋巴细胞；有效保护骨髓造血功能，调节机体内环境。生脉饮可调节t淋巴细胞亚群，改善免疫功能，保护心肌。人参养荣汤能增强机体抵抗力，改善化疗药引起的白细胞减少，保护骨髓，且对小白鼠淋巴细胞转化率有明显增强作用，进而提高机体的免疫功能。
[0007]
中医理论认为，急劳的发病机理是机体正气不足，邪毒外袭，内窜营血，伤及骨髓所引起的邪实正虚、虚实夹杂之证。夏小军等研制的纯中药制剂回生胶囊，具有清热败毒、活血化瘀、化痰散结、补益气血之功效，治疗aml可起到标本同治的目的。综上所述，加用中医序贯治疗能有效改善成人aml患者t淋巴细胞功能抑制，提高免疫球蛋白活性，从而改善患者的免疫功能，可能对恢复患者的肿瘤监视能力、杀伤残留白血病细胞有一定的作用，进而有助于提高其生活质量。
[0008]
肿瘤细胞的免疫逃逸是肿瘤发生发展的主要动因。通常体内新形成的肿瘤病变很容易被宿主防御系统所排斥，但随着癌细胞的不断增殖，逐渐具备了高度的免疫逃逸性和抗肿瘤免疫的能力下降。因此，通过增强肿瘤细胞的免疫原性，可以恢复有效的抗肿瘤免疫反应。近年研究发现引发损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns，damps)的释放可显著增加死亡肿瘤细胞的免疫原性。这种细胞死亡途径被称为“免疫原性细胞死亡”(immungentic cell death，icd)。因此，icd是激活免疫系统对抗肿瘤的重要途径，是抗肿瘤治疗成功的重要保障。
[0009]
近年来，中医药对一些恶性增殖性疾病治疗的可观疗效引起研究者的广泛关注，已经成为一种肿瘤治疗的新策略。其在临床治疗中可发挥抗肿瘤，平衡机体，提高患者免疫功能的重要作用，因此，天然药材中分离与提取的有效抗肿瘤活性成分对肿瘤细胞的免疫原性的影响以及抗肿瘤分子机制的相关研究也越来越多。
[0010]
木犀草素(luteolin，ltl)是一种天然的黄酮类化合物，广泛存在于多种蔬菜和水果中，其化学名称为：3’，4’，5，7-四羟基黄酮，分子量为：286.23，化学式为：c15h10o6。该物质因最早从木犀草这一草本植物的茎、叶、枝中分离而得名。木犀草素来源于半枝莲，ltl作为半枝莲的主要活性成分在肿瘤的临床治疗中发挥抑制端粒酶活性、诱导肿瘤细胞凋亡以及抑制肿瘤细胞增殖的作用。
[0011]
半枝莲，味辛、苦，性寒，归肺、肝、肾经，能够清热解毒，散瘀止血，利尿消肿。半枝莲在《本草征要》中称其“清解热毒，活血去瘀。治疔毒散黄，涂跌仆蛇伤。此草亦治咽喉肿痛，兼溃烂者宜用之”。《泉州本草》言其有“清热，解毒，祛风，散血，行气，利水，通络，破瘀，止痛”之效。有研究结果证实，半枝莲可发挥其抑制胃癌、肝癌等多种肿瘤细胞的增殖的疗效，进而达到抗肿瘤的作用。大量研究表明，ltl具有抗菌、抗炎，保护心血管及免疫调节及抗肿瘤作用等药理学活性。ltl可显著抑制多种恶性肿瘤的细胞生长、增殖、侵袭、迁移及肿瘤血管形成，包括对肝癌、胃癌、前列腺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤细胞的增殖的抑制，然而，其抗肿瘤的作用机理并不完全清楚。已有的研究显示ltl可以有效杀死白血病细胞，研究发现ltl可以通过促进组蛋白h3的乙酰化，激活fasl/fas信号通路，诱导白血病细胞hl-60的凋亡。研究还显示ltl对白血病细胞的杀伤作用具有pttg1依赖性，高表达的pttg1的白血病细胞对ltl更加敏感。然而ltl在杀伤aml细胞时能否增加白血病细胞的icd尚不明确。
[0012]
nlrp3炎症小体主要由传感器分子nlrp3、asc和pro-caspase1组成，nlrp3炎性小体是一种多聚体蛋白复合物，可引发炎症性细胞死亡，并触发促炎性细胞因子il-1β和il-18的释放。研究发现nlrp3与damps的释放有着密切的关系，nlrp3的生成可以激活caspase-1的产生，进而促使了细胞中il-1β和il-18等炎性细胞因子的成熟与分泌，在肿瘤细胞的icd中发挥重要作用。nlrp3/caspas-1信号通路是否参与了ltl诱导aml细胞的icd尚不明确。


技术实现要素：

[0013]
为了解决现有技术的问题，本发明提供了一种治疗白血病的药品配方，其针对白血病治疗具有明显的效果，其配方选用半枝莲作为主要组分，利用半枝莲内的木犀草素，采用多种生物学方法，阐释ltl可通过激活caspase1/nlrp3信号通路，并且实验证明，通过促进caspase1/nlrp3信号通路相关分子的上调表达进而诱导aml细胞的icd，能够延缓aml发生发展，使得中医药在aml的治疗中发挥靶向治疗作用，为临床中医药对aml的靶向治疗提供新的思路。
[0014]
本发明所采用的技术方案如下：
[0015]
一种治疗白血病的药品配方，包括黄芪27-33质量份，灵芝25-35质量份，茯苓12-18质量份，山药12-18质量份，山慈菇12-18质量份，重楼8-12质量份，夏枯草12-18质量份，白花蛇舌草25-35质量份，半枝莲25-35质量份。
[0016]
配方具体包括：黄芪27质量份，灵芝25质量份，茯苓12质量份，山药12质量份，山慈菇12质量份，重楼8质量份，夏枯草12质量份，白花蛇舌草25质量份，半枝莲25质量份。
[0017]
配方具体包括：黄芪33质量份，灵芝35质量份，茯苓18质量份，山药18质量份，山慈菇18质量份，重楼12质量份，夏枯草18质量份，白花蛇舌草35质量份，半枝莲35质量份。
[0018]
配方具体包括：黄芪30质量份，灵芝30质量份，茯苓15质量份，山药15质量份，山慈菇15质量份，重楼10质量份，夏枯草15质量份，白花蛇舌草30质量份，半枝莲30质量份。
[0019]
本发明提供的技术方案带来的有益效果是：
[0020]
本发明采用半枝莲为主要成分制成的药物，作为急性髓系白血病的中西医结合治疗过程中的辅助保健药物，扶正解毒，攻补兼施，可增强化疗疗效，降低耐药性，减轻化疗药物的不良反应，延长生存期，改善患者生命质量。本发明的一种治疗白血病的药品配方，对急性髓系白血病的中西医结合治疗起到促进caspase1/nlrp3信号通路激活进而诱导急性髓系白血病细胞免疫原性细胞死亡的作用，在增加人体正气，提高身体的免疫力方面具有可观的前景。
附图说明
[0021]
图1为mtt检测各组u937/hl-60细胞的细胞活性率示意图；
[0022]
图2为u937/hl-60细胞经不同浓度药物干预24h后细胞凋亡水平的示意图；
[0023]
图3为u937/hl-60细胞经不同浓度药物干预24h后细胞周期变化示意图；
[0024]
图4为edu检测中，u937细胞经不同浓度配方药物干预24h后细胞增殖水平的示意图；
[0025]
图5为edu检测中，hl-60细胞经不同浓度配方药物干预24h后细胞增殖水平的示意
图；
[0026]
图6为pcr检测中，u937细胞经不同浓度配方药物干预24h后，hsp70、hmgb1、crt及nlrp3mrna的表达水平变化状态示意图；
[0027]
图7为pcr检测中，hl-60细胞经不同浓度配方药物干预24h后，hsp70、hmgb1、crt及nlrp3mrna的表达水平变化的示意图；
[0028]
图8为u937/hl-60细胞经不同浓度配方药物干预24h后atp水平变化的示意图；
[0029]
图9为u937/hl-60细胞经不同浓度配方药物干预24h后，hmgb1/crt蛋白的表达水平变化的示意图；
[0030]
图10为western blot检测中，u937/hl-60细胞经不同浓度配方药物干预24h后，icd相关蛋白、caspase1以及nlrp3蛋白表达水平的示意图；
[0031]
图11为western blot检测中，u937/hl-60细胞经不同浓度配方药物干预24h后，parp、bax、bcl-2以及caspase3蛋白的表达水平变化的示意图；
[0032]
图12为免疫荧光共焦显微镜观察u937细胞经不同浓度配方药物干预24h后细胞表面暴露的crt的状态示意图；
[0033]
图13为免疫荧光共焦显微镜观察hl-60细胞经不同浓度配方药物干预24h后细胞表面暴露的crt的状态示意图；
[0034]
图14为u937/hl-60细胞中cy-09-nc组、ltl组和ltl+cy-09组的atp水平变化示意图；
[0035]
图15为u937/hl-60细胞中cy-09-nc组、ltl组和ltl+cy-09组的hmgb1蛋白的表达水平变化示意图；
[0036]
图16为western blot检测中，u937/hl-60细胞cy-09-nc组、ltl组和ltl+cy-09组icd相关蛋白表达水平的示意图；
[0037]
图17为免疫荧光共焦显微镜观察u937细胞的cy-09-nc组、ltl组和ltl+cy-09组细胞表面暴露的crt的示意图；
[0038]
图18为免疫荧光共焦显微镜观察hl-60细胞的cy-09-nc组、ltl组和ltl+cy-09组细胞表面暴露的crt的示意图；
[0039]
图19为u937/hl-60细胞中sirna-nc组、ltl组和ltl+nlrp3sirna组的atp水平变化状态示意图；
[0040]
图20为u937/hl-60细胞中sirna-nc组、ltl组和ltl+nlrp3sirna组的hmgb1蛋白的表达水平变化状态示意图；
[0041]
图21为western blot检测中，u937/hl-60细胞中sirna-nc组、ltl组和ltl+nlrp3sirna组icd相关蛋白表达水平示意图；
[0042]
图22为免疫荧光共焦显微镜观察u937细胞的sirna-nc组、ltl组和ltl+nlrp3sirna组细胞表面暴露的crt的示意图；
[0043]
图23为免疫荧光共焦显微镜观察hl-60细胞的sirna-nc组、ltl组和ltl+nlrp3sirna组细胞表面暴露的crt的示意图。
具体实施方式
[0044]
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施方式作进一
步地详细描述。
[0045]
实施例一
[0046]
一种治疗白血病的药品配方，包括：黄芪27克，灵芝25克，茯苓12克，山药12克，山慈菇12克，重楼8克，夏枯草12克，白花蛇舌草25克，半枝莲25克。
[0047]
本实施例的药品配方的各个组分，经过粉碎，研磨，混合搅拌后，通过常规的制作工艺，可以形成颗粒、水剂等多种药品形式，便于病人服用。
[0048]
实施例二
[0049]
本实施例的一种治疗白血病的药品配方，包括：黄芪33克，灵芝35克，茯苓18克，山药18克，山慈菇18克，重楼12克，夏枯草18克，白花蛇舌草35克，半枝莲35克。
[0050]
实施例三
[0051]
本实施例的一种治疗白血病的药品配方，包括：黄芪30克，灵芝30克，茯苓15克，山药15克，山慈菇15克，重楼10克，夏枯草15克，白花蛇舌草30克，半枝莲30克。
[0052]
下面针对以上配方，以水剂验证本发明的配方药物对于治疗白血病的疗效及病理机制的有效性。
[0053]
一、本发明的配方药物对急性髓系白血病细胞中细胞免疫原性死亡以及caspase1/nlrp3信号通路相关分子的影响。
[0054]
1.1mtt实验。
[0055]
mtt法又称mtt比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。
[0056]
mtt实验结果显示可见20μm、40μm和80μm三个浓度点的配方药物对u937/hl-60细胞均有不同程度的抑制作用(见图1)。
[0057]
如图1中所示，为mtt检测各组u937/hl-60细胞的细胞活性率。
[0058]
其中，a:u937细胞；b：hl-60细胞。与对照组(0μm)相比，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。
[0059]
1.2细胞凋亡水平
[0060]
细胞凋亡实验结果表明，20μm、40μm和80μm三个浓度点的配方药物对u937/hl-60细胞均有不同程度的凋亡促进作用(见图2)。
[0061]
如图2中所示，为u937/hl-60细胞经不同浓度ltl干预24h后细胞凋亡水平。
[0062]
其中，a：u937/hl-60细胞经不同浓度的ltl干预24h后的细胞凋亡水平；b：各组u937细胞的凋亡水平的直方图分析；c：各组hl-60细胞的凋亡水平的直方图分析。
[0063]
与对照组(0μm)相比，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001
[0064]
1.3细胞周期变化
[0065]
细胞周期实验表明，20μm、40μm和80μm三个浓度点的ltl可减少u937/hl-60细胞的g2/m期细胞数量，增加g0/g1期细胞数量，引起u937/hl-60细胞产生g1期的细胞阻滞(见图3)。
[0066]
如图3中所示，为u937/hl-60细胞经不同浓度ltl干预24h后细胞周期变化。
[0067]
其中，a：u937/hl-60细胞经不同浓度的ltl干预24h后的细胞周期变化；b：各组u937细胞的细胞周期变化的直方图分析；c：各组hl-60细胞的细胞周期变化的直方图分析。
[0068]
与对照组(0μm)相比，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。
[0069]
1.4细胞增殖的检测
[0070]
edu实验表明20μm、40μm和80μm三个浓度点的ltl可明显抑制u937/hl-60细胞的增殖水平(见图4-5)。
[0071]
如图4中所示，为edu检测u937细胞经不同浓度ltl干预24h后细胞增殖水平。
[0072]
其中，a：u937细胞经不同浓度的ltl干预24h后的细胞增殖水平；b：各组u937细胞的细胞增殖水平的直方图分析；与对照组(0μm)相比，*p《0.05，，***p《0.001。
[0073]
如图5中所示，为edu检测hl-60细胞经不同浓度ltl干预24h后细胞增殖水平。
[0074]
其中，a：hl-60细胞经不同浓度的ltl干预24h后的细胞增殖水平；b：各组hl-60细胞的细胞增殖水平的直方图分析；
[0075]
与对照组(0μm)相比，***p《0.001
[0076]
1.5pcr检测
[0077]
pcr检测表明ltl可明显升高u937/hl-60细胞的icd以及caspase1/nlrp3信号通路相关基因的表达水平(见图6-7)。
[0078]
如图6中所示，为pcr检测u937细胞经不同浓度ltl干预24h后hsp70、hmgb1、crt及nlrp3mrna的表达水平变化。
[0079]
其中，a：hsp70mrna表达水平的直方图分析；b：hmgb1mrna的表达水平的直方图分析；c：crt mrna表达水平变化的直方图分析；d：nlrp3mrna表达水平的直方图分析。
[0080]
与对照组(0μm)相比，**p《0.01，***p《0.001
[0081]
如图7中所示，为pcr检测hl-60细胞经不同浓度ltl干预24h后hsp70、hmgb1、crt及nlrp3mrna的表达水平变化。
[0082]
其中，a：hsp70mrna表达水平的直方图分析；b：hmgb1mrna的表达水平的直方图分析；c：crt mrna表达水平变化的直方图分析；d：nlrp3mrna表达水平的直方图分析。
[0083]
与对照组(0μm)相比，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001
[0084]
1.6atp检测
[0085]
如图8中所示，为u937/hl-60细胞经不同浓度ltl干预24h后atp水平变化。
[0086]
其中，a：各组u937细胞的atp水平变化的直方图分析；b：各组hl-60细胞的atp水平变化的直方图分析。
[0087]
与对照组(0μm)相比，**p《0.01，***p《0.001。
[0088]
1.7elisa检测
[0089]
elisa检测表明ltl可明显促进u937和hl-60细胞的hmgb1和crt蛋白的表达和分泌。提示ltl对白血病细胞hl-60和u937杀伤过程中伴随damps分子的表达和释放，进而证实ltl可诱导hl-60和u937细胞的icd(见图9)。
[0090]
如图9中所示，为u937/hl-60细胞经不同浓度ltl干预24h后hmgb1/crt蛋白的表达水平变化。
[0091]
其中，a：各组u937细胞hmgb1蛋白变化水平的直方图分析；b：各组hl-60细胞hmgb1蛋白变化水平的直方图分析；c：各组u937细胞crt蛋白变化水平的直方图分析；d：各组hl-60细胞crt蛋白变化水平的直方图分析。
[0092]
与对照组(0μm)相比，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。
[0093]
1.8western blot检测
[0094]
western blot结果表明ltl可以升高hsp70和hsp90蛋白的表达水平，同时激活
nlrp3炎性小体，进而促进nlrp3和caspase1的表达，提示ltl在诱导hl-60和u937细胞的icd的过程中出现caspase1/nlrp3信号通路的激活(见图10)。
[0095]
如图10中所示，为western blot检测u937/hl-60细胞经不同浓度ltl干预24h后icd相关蛋白、caspase1以及nlrp3蛋白表达水平。
[0096]
其中，a：u937/hl-60细胞经不同浓度的ltl干预24h后的hsp70、hsp90、caspase1以及nlrp3蛋白的表达水平；b：各组u937细胞的的hsp70、hsp90、caspase1以及nlrp3蛋白的表达水平变化的直方图分析；c：各组hl-60细胞的的hsp70、hsp90、caspase1以及nlrp3蛋白的表达水平变化的直方图分析。
[0097]
与对照组(0μm)相比，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。
[0098]
1.9western blot检测
[0099]
western blot检测提示ltl可明显升高促凋亡蛋白bax和caspase3的表达，同时能够引起parp的剪切增加，进而降低抑凋亡蛋白bcl-2的表达(见图11)。
[0100]
如图11中所示，为western blot检测u937/hl-60细胞经不同浓度ltl干预24h后parp、bax、bcl-2以及caspase3蛋白的表达水平变化。
[0101]
其中，a：u937/hl-60细胞经不同浓度的ltl干预24h后的parp、bax、bcl-2以及caspase3蛋白的表达水平；b：各组u937细胞的parp、bax、bcl-2以及caspase3蛋白的表达水平变化的直方图分析；c：各组hl-60细胞的parp、bax、bcl-2以及caspase3蛋白的表达水平变化的直方图分析。
[0102]
与对照组(0μm)相比，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001
[0103]
1.10免疫荧光观察细胞表面暴露的crt
[0104]
免疫荧光检测显示采用不同浓度ltl干预的u937/hl-60细胞中的crt蛋白出现膜转移(见图12-13)，提示ltl可引起u937和hl-60细胞中crt蛋白的膜转移。
[0105]
如图12中所示，为免疫荧光共焦显微镜观察u937细胞经不同浓度ltl干预24h后细胞表面暴露的crt。
[0106]
如图13中所示，为免疫荧光共焦显微镜观察hl-60细胞经不同浓度ltl干预24h后细胞表面暴露的crt。
[0107]
二、本发明的配方药物通过激活caspase1/nlrp3信号通路诱导急性髓系白血病细胞免疫原性死亡的机制研究
[0108]
2.1caspase1抑制剂对ltl诱导的icd的影响
[0109]
2.1.1细胞上清液中atp的含量
[0110]
atp含量检测表明ltl可明显降低u937/hl-60细胞的atp含量，抑制nlrp3表达后atp含量明显升高(见图14)。
[0111]
如图14所示，为u937/hl-60细胞中cy-09-nc组、ltl组和ltl+cy-09组的atp水平变化。
[0112]
其中，a：各组u937细胞的atp水平变化的直方图分析；b：各组hl-60细胞的atp水平变化的直方图分析。与cy-09组相比，**p《0.01，***p《0.001；与ltl组相比，###p《0.001。
[0113]
2.1.2细胞上清液中hmgb1蛋白的表达水平变化
[0114]
elisa检测表明ltl可明显升高u937/hl-60细胞的hmgb1蛋白的表达，抑制nlrp3表达后可使其hmgb1蛋白表达水平明显降低，说明nlrp3抑制剂可有效抑制ltl通过激活nlrp3
信号通路诱导的aml细胞的icd(见图15)。
[0115]
如图15所示，为u937/hl-60细胞中cy-09-nc组、ltl组和ltl+cy-09组的hmgb1蛋白的表达水平变化。
[0116]
a：各组u937细胞hmgb1蛋白变化水平的直方图分析；b：各组hl-60细胞hmgb1蛋白变化水平的直方图分析。与cy-09组相比，***p《0.001；与ltl组相比，###p《0.001。
[0117]
2.1.3western blot检测icd相关蛋白的表达水平
[0118]
western blot检测表明ltl可明显升高u937/hl-60细胞的icd相关蛋白的表达，抑制nlrp3的活性后，ltl诱导的icd相关蛋白hsp70和hsp90的表达同时也被抑制，进一步说明ltl诱导的icd是通过nlrp3信号通路介导的(见图16)。
[0119]
如图16所示，为western blot检测u937/hl-60细胞cy-09-nc组、ltl组和ltl+cy-09组icd相关蛋白表达水平。
[0120]
其中，a：u937/hl-60细胞中cy-09-nc组、ltl组和ltl+cy-09组的hsp70和hsp90蛋白表达水平；b：各组u937细胞的hsp70和hsp90蛋白的表达水平变化的直方图分析；c：各组hl-60细胞的的hsp70和hsp90蛋白的表达水平变化的直方图分析。
[0121]
与cy-09组相比，*p《0.05，**p《0.01；；与ltl组相比，#p《0.05，##p《0.01。
[0122]
2.1.4免疫荧光共焦显微镜观察表面暴露的crt
[0123]
免疫荧光显示抑制nlrp3表达后，ltl诱导的crt蛋白的膜转移同时也会被抑制，提示ltl可引起u937和hl-60细胞中crt蛋白的膜转移，nlrp3抑制剂cy-09可抑制ltl诱导的crt蛋白的膜转移(见图17-18)。
[0124]
如图17所示，为免疫荧光共焦显微镜观察u937细胞的cy-09-nc组、ltl组和ltl+cy-09组细胞表面暴露的crt。
[0125]
如图18所示，为免疫荧光共焦显微镜观察hl-60细胞的cy-09-nc组、ltl组和ltl+cy-09组细胞表面暴露的crt。
[0126]
2.2nlrp3sirna敲降nlrp3表达对ltl诱导的icd的影响
[0127]
2.2.1细胞上清液中atp的含量
[0128]
atp含量表明ltl可明显降低u937/hl-60细胞的atp含量，敲降nlrp3后可使其atp含量明显升高(见图19)。
[0129]
如图19所示，为u937/hl-60细胞中sirna-nc组、ltl组和ltl+nlrp3sirna组的atp水平变化。
[0130]
其中，a：各组u937细胞的atp水平变化的直方图分析；b：各组hl-60细胞的atp水平变化的直方图分析。与sirna-nc组相比，**p《0.01，***p《0.001；与ltl组相比，###p《0.001。
[0131]
2.2.2细胞上清液中hmgb1蛋白的表达水平变化
[0132]
elisa检测表明ltl可明显促进u937和hl-60细胞的hmgb1蛋白的表达和分泌，敲降nlrp3表达后可使其hmgb1蛋白表达水平明显降低，说明nlrp3抑制剂cy-09可有效抑制ltl通过激活nlrp3信号通路诱导的aml细胞的icd(见图20)。
[0133]
如图20所示，为u937/hl-60细胞中sirna-nc组、ltl组和ltl+nlrp3sirna组的hmgb1蛋白的表达水平变化。
[0134]
其中，a：各组u937细胞hmgb1蛋白变化水平的直方图分析；b：各组hl-60细胞hmgb1蛋白变化水平的直方图分析。
[0135]
与sirna-nc组相比，**p《0.01，***p《0.001；与ltl组相比，###p《0.001。
[0136]
2.2.3western blot检测icd相关蛋白的表达水平
[0137]
western blot表明ltl可明显升高u937/hl-60细胞的icd相关蛋白的表达，敲降nlrp3表达后，ltl诱导的icd相关蛋白hsp70和hsp90的表达也被抑制，进一步说明ltl诱导的icd是通过nlrp3信号通路介导的(见图21)。
[0138]
如图21所示，为western blot检测u937/hl-60细胞中sirna-nc组、ltl组和ltl+nlrp3sirna组icd相关蛋白表达水平。
[0139]
其中，a：u937/hl-60细胞中sirna-nc组、ltl组和ltl+nlrp3sirna组的hsp70和hsp90蛋白表达水平；b：各组u937细胞的的hsp70和hsp90蛋白的表达水平变化的直方图分析；c：各组hl-60细胞的的hsp70和hsp90蛋白的表达水平变化的直方图分析。与sirna-nc组相比，*p《0.05，**p《0.01；与ltl组相比，#p《0.05。
[0140]
2.2.4免疫荧光共焦显微镜观察表面暴露的crt
[0141]
免疫荧光提示ltl可引起u937和hl-60细胞中crt蛋白的膜转移，敲降nlrp3表达后可抑制ltl诱导的crt蛋白的膜转移，表明ltl诱导的u937和hl-60的icd是通过nlrp3信号通路介导的(见图22-23)。
[0142]
如图22所示，为免疫荧光共焦显微镜观察u937细胞的sirna-nc组、ltl组和ltl+nlrp3sirna组细胞表面暴露的crt。
[0143]
如图23所示，为免疫荧光共焦显微镜观察hl-60细胞的sirna-nc组、ltl组和ltl+nlrp3sirna组细胞表面暴露的crt。
[0144]
综上所述，本发明的一种治疗白血病的药品配方：
[0145]
1、可以用于aml靶向治疗的研究，利用多种生物学方法，证明本配方药物可通过激活caspase1/nlrp3信号通路，促进caspase1/nlrp3信号通路相关分子的上调表达进而诱导aml细胞的icd，延缓aml发生发展，使得中医药在aml的治疗中发挥靶向治疗作用，为临床中医药对aml的靶向治疗提供新的思路。
[0146]
2、揭示本配方药物诱导的u937和hl-60细胞的icd与caspase1/nlrp3信号通路激活发生之间的关系，通过nlrp3抑制剂cy-09以及敲降nlrp3表达，并且采用caspase1抑制剂vx-765和配方药物共同作用于hl-60和u937细胞，进一步阐释配方药物通过调控caspase1/nlrp3信号通路激活，进而诱导aml细胞icd的作用机制，为临床采用中医药治疗aml提供有力的分子基础和理论依据。
[0147]
本发明的药品配方，可按照现有技术下的常用工艺，制作成粉剂，颗粒、胶囊、针剂等药物形式。
[0148]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种治疗白血病的药品配方，包括黄芪27-33质量份，灵芝25-35质量份，茯苓12-18质量份，山药12-18质量份，山慈菇12-18质量份，重楼8-12质量份，夏枯草12-18质量份，白花蛇舌草25-35质量份，半枝莲25-35质量份。2.根据权利要求1所述的一种治疗白血病的药品配方，其特征在于，所述的配方具体包括：黄芪27质量份，灵芝25质量份，茯苓12质量份，山药12质量份，山慈菇12质量份，重楼8质量份，夏枯草12质量份，白花蛇舌草25质量份，半枝莲25质量份。3.根据权利要求1所述的一种治疗白血病的药品配方，其特征在于，所述的配方具体包括：黄芪33质量份，灵芝35质量份，茯苓18质量份，山药18质量份，山慈菇18质量份，重楼12质量份，夏枯草18质量份，白花蛇舌草35质量份，半枝莲35质量份。4.根据权利要求1所述的一种治疗白血病的药品配方，其特征在于，所述的配方具体包括：黄芪30质量份，灵芝30质量份，茯苓15质量份，山药15质量份，山慈菇15质量份，重楼10质量份，夏枯草15质量份，白花蛇舌草30质量份，半枝莲30质量份。

技术总结
本发明涉及一种中药配方，特别涉及一种治疗白血病的药品配方。其配方包括黄芪27-33质量份，灵芝25-35质量份，茯苓12-18质量份，山药12-18质量份，山慈菇12-18质量份，重楼8-12质量份，夏枯草12-18质量份，白花蛇舌草25-35质量份，半枝莲25-35质量份。本发明的一种治疗白血病的药品配方，其针对白血病治疗具有明显的效果。效果。效果。


技术研发人员：陈涵 徐瑞荣 殷学伟
受保护的技术使用者：陈涵
技术研发日：2020.09.08
技术公布日：2022/3/7