固相富集O-GlcNAc糖肽的制备方法

聚糖后得到固相结合的o-糖肽和o-glcnac糖肽，包括：
13.通过氧化剂将所述多肽混合物中糖肽上的聚糖氧化成具有醛基的氧化糖肽，提取所述氧化糖肽，将其与表面具有酰肼或氨基的固相材料共价结合；
14.向混合物中加入n-糖苷酶将固相上的n-聚糖酶解，得到固相结合的o-糖肽和o-glcnac糖肽。
15.进一步地，所述去除所述多肽混合物的n-聚糖后，将所述多肽混合物通过亲和结合在所述固相材料上，得到固相结合的o-糖肽和o-glcnac糖肽，包括：
16.向所述多肽混合物中加入n-糖苷酶，酶切去除n-聚糖，得到含有无聚糖多肽、粘蛋白型o-糖肽、o-glcnac糖肽和n-聚糖的混合溶液，再通过纯化去除n-聚糖得到样本溶液；
17.将所述样本溶液溶于凝集素缓冲液中并加入到凝集素树脂中，具有o-glcnac结构的o-糖肽与所述凝集素树脂亲和结合得到固相结合的o-glcnac糖肽。
18.进一步地，所述s3包括：
19.向所述固相结合的o-糖肽和o-glcnac糖肽中加入o-glcnac糖苷酶，将所述o-glcnac糖肽从丝氨酸或苏氨酸酶解，收集上清液并纯化得到具有o-glcnac位点的去o-glcnac多肽。
20.进一步地，所述s3包括：
21.向所述固相结合的o-糖肽和o-glcnac糖肽中加入酸性溶液，使所述o-glcnac糖肽与酰肼固相材料形成的腙键水解，收集上清液得到具有o-glcnac位点和氧化o-glcnac的o-糖肽。
22.进一步地，所述向所述固相结合的o-glcnac糖肽中加入酸性溶液，还包括使加入酸性溶液后的混合液的ph小于3。
23.进一步地，所述固相材料为树脂。
24.进一步地，所述s3包括：
25.向所述固相结合的o-糖肽和o-glcnac糖肽加入溶于重水配制的mes的o-glcnac糖苷酶，酶解o-glcnac糖肽，并通过生物信息学方法对成分进行分析。
26.进一步地，所述多肽混合物来源于组织细胞，所述组织细胞为良性和/或癌症组织细胞。
27.进一步地，还包括：
28.s0、分别取5-10毫克良性和癌症组织，将组织冷冻后用组织均质仪打碎，在打碎的组织中加入裂解液和蛋白质酶解抑制剂。
29.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本技术的固相富集o-糖肽的制备方法首先提取蛋白质，然后用蛋白酶水解得到多肽，接着将纯化多肽共价或亲和富集到固相上，在固相上用n-糖苷酶将n-糖肽上的多肽去除，固相保留的即为o-糖肽和o-glcnac糖肽，且所富集的o-glcnac糖肽和位点特异性均处于较高水平。
30.同时，再通过o-glcnacase糖苷酶将o-糖肽酶解，可以确定o-glcnac糖肽位点及其序列。本方法对研究癌症、糖尿病、退行神经中o-glcnacylation蛋白质底物的发现和功能的研究等方面有着重要意义。
31.上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
32.图1为本技术的固相富集o-glcnac糖肽的制备方法的流程图；
33.图2为本技术实施例一的固相富集o-glcnac糖肽的制备方法的步骤示意图；
34.图3为本技术实施例二的固相富集o-glcnac糖肽的制备方法的步骤示意图；
35.图4为本技术实施例三的oga酶解确定o-glcnac位点的步骤示意图；
36.图5为本技术实施例四的酸性条件水解确定o-glcnac位点的步骤示意图；
37.图6为本技术实施例五的确定o-glcnac糖基化位点的步骤示意图；
38.图7为本技术实施例六的制备方法在人体中的应用的步骤示意图。
具体实施方式
39.下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
40.需要说明的是：本发明的“上”、“下”、“左”、“右”、“内”、“外”等用语只是参考附图对本发明进行说明，不作为限定用语。
41.请参见图1，本技术公开了一种固相富集o-glcnac糖肽的制备方法，其包括以下步骤：
42.s1、提供多肽混合物和固相材料，所述多肽混合物包括无聚糖多肽、n-聚糖多肽、粘蛋白型o-糖肽和o-glcnac糖肽；
43.s21、氧化所述多肽混合物并通过共价结合到所述固相材料上，去除n-聚糖后得到固相结合的o-糖肽和o-glcnac糖肽；
44.或者，
45.s22、去除所述多肽混合物的n-聚糖后，将所述多肽混合物通过亲和结合在所述固相材料上，得到固相结合的o-糖肽和o-glcnac糖肽；
46.以及，
47.s3、进一步酶切或水解得到o-glcnac糖肽。
48.具体的，s21中，所述氧化所述多肽混合物并通过共价结合到所述固相材料上，去除n-聚糖后得到固相结合的o-糖肽和o-glcnac糖肽，包括：
49.通过氧化剂将所述多肽混合物中糖肽上的聚糖氧化成具有醛基的氧化糖肽，提取所述氧化糖肽，将其与表面具有酰肼或氨基的固相材料共价结合；
50.向混合物中加入n-糖苷酶将固相上的n-聚糖酶解，得到固相结合的o-糖肽和o-glcnac糖肽。
51.具体的，s22中，所述去除所述多肽混合物的n-聚糖后，将所述多肽混合物通过亲和结合在所述固相材料上，得到固相结合的o-糖肽和o-glcnac糖肽，包括：
52.向所述多肽混合物中加入n-糖苷酶，酶切去除n-聚糖，得到含有无聚糖多肽、粘蛋白型o-糖肽、o-glcnac糖肽和n-聚糖的混合溶液，再通过纯化去除n-聚糖得到样本溶液；
53.将所述样本溶液溶于凝集素缓冲液中并加入到凝集素树脂中，具有o-glcnac结构的o-糖肽与所述凝集素树脂亲和结合得到固相结合的o-glcnac糖肽。
54.可选的，s3包括：
55.向所述固相结合的o-糖肽中加入o-glcnac糖苷酶，将所述o-glcnac糖肽从丝氨酸
或苏氨酸酶解，收集上清液并纯化得到具有o-glcnac位点的去o-glcnac多肽。
56.可选的，s3包括：
57.向所述固相结合的o-糖肽中加入酸性溶液，使所述o-glcnac糖肽与酰肼固相材料形成的腙键水解，收集上清液得到具有o-glcnac位点和氧化o-glcnac的o-糖肽。其中，所述向所述固相结合的o-糖肽中加入酸性溶液，还包括使加入酸性溶液后的混合液的ph小于3。
58.可选的，所述固相材料为树脂。
59.可选的，s3还包括：
60.向所述固相结合的o-糖肽加入溶于重水配制的mes的o-glcnac糖苷酶，酶解o-glcnac糖肽，并通过生物信息学方法对成分进行分析。其中，所述多肽混合物来源于组织细胞，所述组织细胞为良性和/或癌症组织细胞。
61.可选的，还包括：
62.s0、分别取5-10毫克良性和癌症组织，将组织冷冻后用组织均质仪打碎，在打碎的组织中加入裂解液和蛋白质酶解抑制剂。
63.下面将结合具体实施例来对本技术进行进一步说明。
64.实施例一共价结合制备固相结合的o-糖肽
65.请参见图2，具体的：
66.将组织在干冰或-80℃冷冻2-3小时，取出后立即将组织破碎；
67.在组织中加入400-600μl 1倍ripa裂解液，用超声破碎仪30-40％能量，破碎30秒后将样本放入冰中冷却，重复这一步骤4-6次，直至样本溶液澄清为止；
68.取2-4μl样本，稀释5-10倍，用bca测试蛋白的浓度；
69.根据浓度取800-1000μg蛋白溶于总体积为400-600μl，终浓度为8m的尿素中，轻微振荡样本，确保蛋白完全溶解；
70.加入80-100μl 120mm二苏硫糖醇(dtt)，37℃反应1-1.5小时；
71.再加入80-100μl 160mm碘乙酰胺，室温暗室反应1-1.5小时；
72.将样本稀释5-6倍，加入新配制的1m碳酸氢铵，最终碳酸氢铵浓度为20-25mm，测试样本ph介于7-9之间；
73.加入20-25μg测序级胰蛋白酶，轻微振荡在37℃反应16-18小时水解得到多肽；
74.在溶液中加入三氟乙酸(tfa，》99％，w/v)(约10-20μl)，直至ph下调至2-3；
75.将c18萃取柱预处理后，加入样本，将过滤液再加入萃取柱，再用0.1％tfa清洗萃取柱5-6次(1.0-1.2ml),400-500μl，50％含有0.1％tfa的乙腈(acn)洗脱多肽，最后一步重复2次；
76.将洗出的多肽合并，真空冷冻干燥得到纯化的多肽，主要包括无聚糖多肽、n-聚糖多肽、粘蛋白型o-糖肽和o-glcnac糖肽；
77.将多肽重新溶于0.1％tfa和50％acn溶液，加入10-20mm氧化剂高碘酸钠，37℃反应1-2小时，将糖肽上n-聚糖、粘蛋白型o-聚糖和o-glcnac氧化形成具有醛基的糖肽；
78.聚糖氧化后糖肽真空冷冻干燥，重新溶于1ml 0.1％tfa，c18纯化后，用0.1％tfa和50％acn将糖肽从c18上洗脱；
79.取100-150μl表面具有酰肼或氨基的球状树脂，加入到1.5-2.0ml离心管。将树脂预处理，即用400-500μl去离子水清洗两次，去掉液体后，把氧化糖肽与树脂结合，室温下反
应2-4小时；
80.将1-2μl pngasef与1倍tris缓冲液混合后加到树脂中，37℃反应2-4小时酶解n-聚糖，而固相上则仍保留o-糖肽；
81.结合在固相上的o-糖肽经过液相冲洗纯化，得到固相结合的糖肽。
82.实施例二亲和结合制备固相结合的o-糖肽
83.请参见图3，具体的：
84.将c18纯化的800-1000μg多肽真空冷冻干燥后，重新溶于400-600μl pbs缓冲液，ph 7.2-7.6；
85.样本中加入1-2单位n-糖苷酶(pngasef)，37℃反应4-6小时，使得n-聚糖酶切去除，溶液中获得无聚糖多肽、粘蛋白型o-糖肽、o-glcnac糖肽和n-聚糖；
86.在样本中加入20-30μl浓tfa(》99％，w/v)，将ph降低至3.0以下，用c18纯化去除n-聚糖，纯化后的样本真空冷冻干燥；
87.纯化的样本重新溶于400-500μl凝集素wga缓冲液，即10mm hepes(n-2-羟基乙基哌嗪-n'-2'-乙烷磺酸),0.15m nacl,ph7.5；；
88.将200-300μl wga凝集素球状树脂，400-500μl wga缓冲液冲洗2-3遍，保留wga树脂，去除冲洗液；
89.把400-500μl多肽样本加入到预处理wga树脂中，振荡混合均匀，在室温条件下过夜反应；
90.具有o-glcnac结构的o-糖肽与wga树脂亲和结合，而其他糖肽或非聚糖多肽则保留在上清液中，从而将o-糖肽与非糖肽分开；
91.用400-500μl wga缓冲液冲洗4-5次，凝集素树脂得到固相结合的o-glcnac糖肽。
92.实施例三oga酶解确定o-glcnac位点
93.请参见图4，具体的：
94.共价结合在固相上的o-糖肽包括o-glcnac糖肽和粘蛋白型o-糖肽，n-糖肽已通过pngasef切除，或
95.亲和结合在固相上的o-糖肽主要是o-glcnac糖肽；
96.加入2-4单位o-glcnac糖苷酶即oga，200-300μl 50mm mes和100mm氯化钠，与树脂样本混合，37℃反应6-8小时，该步骤将o-glcnac糖肽从丝氨酸或苏氨酸酶解；
97.反应溶液中水分子上的氢(h)与丝氨酸(serine)或苏氨酸(threonine)的氧(o)结合，形成完整氨基酸；
98.离心(1500rpm，1-2分钟)收集上清液，并用400-500μl 0.1％tfa去离子水清洗2-3遍，所有上清液合并，经过c18纯化后得到具有o-glcnac位点、但不带o-glcnac单糖的多肽，可直接用质谱hcd测序分析。
99.实施例四酸性条件水解确定o-glcnac位点
100.请参见图5，具体的：
101.结合在固相上的o-糖肽包括o-glcnac糖肽和粘蛋白型o-糖肽；
102.该方法适用于腙未还原，在酸性条件下可水解；
103.在树脂样本中加入400-500μl 0.1％tfa酸性溶液，或其它酸性溶液，确保ph低于3即可，在室温反应8-12小时。o-glcnac糖肽与酰肼固相材料形成的腙键可逆水解，重新进入
上清液；
104.将树脂离心(1500rpm，1-2分钟)收集上清液，重复此步骤2-3次，将所有上清液合并，并用c18纯化，真空冷冻干燥得到o-glcnac糖肽；
105.该样本具有o-glcnac位点和单糖，且所带的o-glcnac为氧化结构，分子量降低2da(失去两个氢)。
106.实施例五oga酶解后用重水确定o-glcnac糖基化位点
107.请参见图6，具体的：
108.氧化或凝集素结合的o-糖肽，o-glcnac一端与固相结合。其中氧化端与树脂形成腙(hydrazone)，而凝集素wga则为亲和结合；
109.o-glcnac与丝氨酸或苏氨酸通过-o-ser/thr相连，具体结构为ser/thr-o-glcnac；
110.将2-4单位o-glcnac糖苷酶即oga，200-300微升50mm mes和100mm氯化钠，所有试剂溶于重水中，与树脂样本混合，37℃反应6-8小时；
111.重水d与o-glcnac糖肽-o-ser/thr结合，即形成do-ser/thr，无o-糖位点的ser或thr则为ho-ser/thr；
112.do-ser/thr比ho-ser/thr分子量相差1da，质谱分析将ser/thr设为动态修饰，分子量增加1da。
113.实施例六制备方法在人体中的应用
114.请参见图7，具体的：
115.分别取5-10毫克组织(良性/正常和癌症)，将样本放置-80℃冷冻2-4小时，或放入液氮中2-3小时，取出后用组织均质仪，将组织打碎；
116.在打碎的组织中加入400-600微升裂解液，4-6微升蛋白质酶解抑制剂，参照本技术的方式提取蛋白质；
117.在良性/正常和癌症蛋白中差异性o-glcnacylation表达的o-糖蛋白；
118.用spglce方法，固定富集和酶解获得o-glcnac多肽；
119.通过生物信息学分析o-glcnac在癌症中的生物功能和o-glcnacylation的蛋白质底物。
120.综上所述：本技术的固相富集o-糖肽的制备方法首先提取蛋白质，然后用蛋白酶水解得到多肽，接着将纯化多肽共价或亲和富集到固相上，在固相上用n-糖苷酶将n-糖肽上的多肽去除，固相保留的即为o-糖肽，且所制得的o-糖肽的富集o-glcnac底物和位点特异性均处于较高水平。
121.同时，再通过o-glcnacase糖苷酶将o-糖肽酶解，可以确定o-glcnac糖肽位点及其序列。本方法对研究癌症、糖尿病、退行神经中o-glcnacylation蛋白质底物的发现和功能的研究等方面有着重要意义。
122.上述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
123.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来
说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.一种固相富集o-glcnac糖肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、提供多肽混合物和固相材料，所述多肽混合物包括无聚糖多肽、n-聚糖多肽、粘蛋白型o-糖肽和o-glcnac糖肽；s21、氧化所述多肽混合物并通过共价结合到所述固相材料上，去除n-聚糖后得到固相结合的o-糖肽和o-glcnac糖肽；或者，s22、去除所述多肽混合物的n-聚糖后，将所述多肽混合物通过亲和结合在所述固相材料上，得到固相结合的o-糖肽和o-glcnac糖肽；以及，s3、进一步酶切或水解得到o-glcnac糖肽。2.如权利要求1所述的固相富集o-glcnac糖肽的制备方法，其特征在于，所述氧化多肽混合物并通过共价结合到所述固相材料上，去除n-聚糖后得到固相结合的o-糖肽和o-glcnac糖肽，包括：通过氧化剂将所述多肽混合物中糖肽上的聚糖氧化成具有醛基的氧化糖肽，提取所述氧化糖肽，将其与表面具有酰肼或胺基的固相材料共价结合；向混合物中加入n-糖苷酶将固相上的n-聚糖酶解，得到固相结合的o-糖肽和o-glcnac糖肽。3.如权利要求1所述的固相富集o-glcnac糖肽的制备方法，其特征在于，去除所述多肽混合物的n-聚糖后，将所述多肽混合物通过亲和结合在所述固相材料上，得到固相结合的o-糖肽和o-glcnac糖肽，包括：向所述多肽混合物中加入n-糖苷酶，酶切去除n-聚糖，得到含有无聚糖多肽、粘蛋白型o-糖肽、o-glcnac糖肽和n-聚糖的混合溶液，再通过纯化去除n-聚糖得到样本溶液；将所述样本溶液溶于凝集素缓冲液中并加入到凝集素树脂中，具有o-glcnac结构的o-糖肽与所述凝集素树脂亲和结合得到固相结合的o-glcnac糖肽。4.如权利要求2或3所述的固相富集o-glcnac糖肽的制备方法，其特征在于，所述s3包括：向所述固相结合的o-糖肽和o-glcnac糖肽中加入o-glcnac糖苷酶，将所述o-glcnac糖肽从丝氨酸或苏氨酸酶解，收集上清液并纯化得到具有o-glcnac位点的去o-glcnac多肽。5.如权利要求2所述的固相富集o-glcnac糖肽的制备方法，其特征在于，所述s3包括：向所述固相结合的o-糖肽和o-glcnac糖肽中加入酸性溶液，使所述o-glcnac糖肽与丝氨酸或苏氨酸形成的腙键水解，收集上清液得到具有o-glcnac位点和氧化o-glcnac的o-糖肽。6.如权利要求5所述的固相富集o-glcnac糖肽的制备方法，其特征在于，所述向所述固相结合的o-glcnac糖肽中加入酸性溶液，还包括使加入酸性溶液后的混合液的ph小于3。7.如权利要求1所述的固相富集o-glcnac糖肽的制备方法，其特征在于，所述固相材料为树脂。8.如权利要求1所述的固相富集o-glcnac糖肽的制备方法，其特征在于，所述s3包括：向所述固相结合的o-糖肽和o-glcnac糖肽加入溶于重水配制的mes(2-吗啉乙磺酸)的o-glcnac糖苷酶，酶解o-glcnac糖肽，并通过生物信息学方法对成分进行分析。
9.如权利要求1所述的固相富集o-glcnac糖肽的制备方法，其特征在于，所述多肽混合物来源于组织细胞，所述组织细胞为良性和/或癌症组织细胞。10.如权利要求9所述的固相富集o-glcnac糖肽的制备方法，其特征在于，还包括：s0、分别取5-10毫克良性和癌症组织，将组织冷冻后用组织均质仪打碎，在打碎的组织中加入裂解液和蛋白质酶解抑制剂。

技术总结
本申请涉及一种固相富集O-GlcNAc糖肽的制备方法，其包括以下步骤：S1、提供多肽混合物和固相材料，多肽混合物包括无聚糖多肽、N-聚糖多肽、粘蛋白型O-糖肽和O-GlcNAc糖肽；S21、氧化多肽混合物并通过共价结合到固相材料上，去除N-聚糖后得到固相结合的O-糖肽和O-GlcNAc糖肽；或者，S22、去除多肽混合物的N-聚糖后，将多肽混合物通过亲和结合在固相材料上，得到固相结合的O-糖肽和O-GlcNAc糖肽；以及，S3、进一步酶切或水解得到O-GlcNAc糖肽。该方法所制得的O-糖肽的富集O-GlcNAc糖肽和位点特异性均处于较高水平，以解决现有技术中制备的O-糖肽中富集O-GlcNAc糖肽和位点特异性低的难题。低的难题。低的难题。


技术研发人员：杨霜 胡文华
受保护的技术使用者：苏州大学
技术研发日：2021.11.22
技术公布日：2022/3/7