诱导间充质干细胞成为多能干细胞的方法与流程

诱导间充质干细胞成为多能干细胞的方法
发明领域
1.本技术属于生物与新医药技术领域，具体地，涉及诱导间充质干细胞成为多能干细胞的方法。
2.发明背景
3.间充质干细胞是干细胞家族的重要成员之一，目前在脐带、胎盘、脂肪、牙髓等多种组织中成功分离获得。间充质干细胞主要来源于发育早期的中胚层。在体内外经过特定的诱导后，可以分化为骨、软骨、脂肪等细胞。目前被广泛认为是修复组织损伤和衰老的最理想的种子细胞之一。
4.多能干细胞是一类具有自我更新、自我复制能力的多潜能细胞，其具有分化出多种细胞组织的潜能。多能干细胞的研究不仅具有重要的理论意义，而且在器官再生、修复和疾病治疗方面极具应用价值。
5.因此，需要开发出新的能够诱导间充质干细胞成为多能干细胞的方法。
6.发明概述
7.第一方面，本技术提供了将间充质干细胞诱导为多能干细胞的方法，其包括将以下基因中的一种或多种导入所述间充质干细胞中进行表达：oct4、sox2、klf4和c-myc。
8.在第一方面的一些实施方案中，使用载体将所述基因导入所述间充质干细胞中进行表达，所述载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、痘病毒载体、杆状病毒载体、乳头瘤病毒载体或乳多空病毒载体。
9.在第一方面的一些实施方案中，所述载体为逆转录病毒载体。
10.在第一方面的一些实施方案中，所述逆转录病毒载体选自以下中的一种或多种：pmxs-hoct4、pmxs-hsox2、pmxs-hklf4和pmxs-hc-myc。
11.在第一方面的一些实施方案中，所述间充质干细胞来源于脐带、胎盘、脂肪和/或牙髓。
12.在第一方面的一些实施方案中，所述方法还包括在用所述逆转录病毒载体转染所述间充质干细胞之前分离并培养所述间充质干细胞。
13.在第一方面的一些实施方案中，所述方法还包括鉴定转染后获得的多能干细胞，和/或培养、传代所述多能干细胞。
14.在第一方面的一些实施方案中，大于95％的所述间充质干细胞表达cd90、cd105和cd7。
15.在第一方面的一些实施方案中，小于2％的所述间充质干细胞表达cd14、cd19、cd34、cd45和hla-dr。
16.在第一方面的一些实施方案中，所述多能干细胞表达tra-1-60。
17.在第一方面的一些实施方案中，所述多能干细胞不表达ssea1。
18.在第一方面的一些实施方案中，所述多能干细胞能够向三胚层分化。
19.第二方面，本技术提供了通过第一方面所述的方法制备的多能干细胞。
20.第三方面，本技术提供了第二方面所述的多能干细胞在制备用于治疗的细胞产品
中的用途。
21.附图简述
22.图1显示了脐带间充质干细胞的形态。
23.图2显示了通过本技术的方法诱导的多能干细胞的形态。
24.图3显示了通过本技术的方法诱导的多能干细胞特异性抗体表达的结果，其中，图a为荧光图像，图b为荧光图像和明场图像的复合图像。
25.图4显示了通过本技术的方法诱导的多能干细胞的碱性磷酸酶检测的结果。
26.图5显示了通过本技术的方法诱导的多能干细胞的三胚层分化能力的结果。
27.发明详述
28.本技术的发明人通过将oct4、sox2、klf4和c-myc四种基因中的一种或多种导入间充质干细胞，例如脐带间充质干细胞，获得了诱导性多能干细胞。通过本技术的方法获得的多能干细胞具有与胚胎干细胞相近的分化能力，形态与胚胎干细胞几乎相同，并且具有三胚层分化能力，为使用多能干细胞进行疾病治疗、医药研究等提供了有效的工具。
29.定义
30.提供以下定义用以更好地界定本技术以及在本技术实践中指导本领域普通技术人员。除非另外说明，本技术中的术语的含义与本领域技术人员通常理解的含义相同，例如，涉及原料和产物、操作步骤、工艺参数、使用设备和工具以及数值单位中的术语。本文所引用的所有专利文献、学术论文及其他公开出版物，其中的全部内容整体并入本文作为参考。
31.如本文所用的术语“间充质干细胞”是指一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。
32.如本文所用的术语“多能干细胞”是指具有自我更新、自我复制能力的多潜能细胞，其具有分化出多种细胞组织的潜能，但失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制。
33.如本文所用的术语“逆转录病毒载体”是指根据逆转录病毒的一些特性设计出的一种复制缺陷性病毒，使其成为能够携带某种特异目的基因的表达载体，其保留了逆转录病毒颗粒的包装信号，而缺失逆转录病毒颗粒包装蛋白基因；它可以克隆并表达外源基因，但不能自我包装成有增殖能力的逆转录病毒颗粒。
具体实施方案
34.第一方面，本技术提供了将间充质干细胞诱导为多能干细胞的方法，其包括将以下基因中的一种或多种导入所述间充质干细胞中进行表达：oct4、sox2、klf4和c-myc。
35.在第一方面的一些实施方案中，将oct4、sox2、klf4和c-myc四种基因同时导入所述间充质中进行表达。
36.在第一方面的一些实施方案中，可以使用化学方法将oct4、sox2、klf4和c-myc中的一种或多种基因导入所述间充质干细胞中进行表达，例如热激法、磷酸钙法、脂质体和聚合物法、纳米粒子法等。
37.在第一方面的一些实施方案中，可以使用物理方法将oct4、sox2、klf4和c-myc中的一种或多种基因导入所述间充质干细胞中进行表达，例如电穿孔法、基因枪法、显微注射
法、声穿孔法、光穿孔法、磁转法等。
38.在第一方面的一些实施方案中，可以使用生物方法将oct4、sox2、klf4和c-myc中的一种或多种基因导入所述间充质干细胞中进行表达，例如利用载体进行转染的方法。
39.在第一方面的一些实施方案中，所述载体可以为逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、痘病毒载体、杆状病毒载体、乳头瘤病毒载体或乳多空病毒载体等。
40.在第一方面的一些实施方案中，所述载体为逆转录病毒载体，例如莫洛尼鼠白血病病毒(m-mulv)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(momsv)、哈维鼠肉瘤病毒(hamusv)、鼠乳腺肿瘤病毒(mumtv)、长臂猿白血病病毒(galv)、猫白血病病毒(flv)、泡沫病毒、弗云德鼠白血病病毒、鼠干细胞病毒(mscv)或劳氏肉瘤病毒(rsv)。
41.在第一方面的一些实施方案中，所述逆转录病毒载体选自以下中的一种或多种：pmxs-hoct4、pmxs-hsox2、pmxs-hklf4和pmxs-hc-myc。
42.在第一方面的一些具体实施方案中，所述逆转录病毒载体为pmxs-hoct4、pmxs-hsox2、pmxs-hklf4和pmxs-hc-myc。
43.在第一方面的一些实施方案中，所述载体可以为慢病毒载体，例如hiv(人免疫缺陷病毒；包括1型hiv和2型hiv)；维斯纳-梅迪病毒(vmv)；山羊关节炎-脑炎病毒(caev)；马传染性贫血病毒(eiav)；猫免疫缺陷病毒(fiv)；牛免疫缺陷病毒(biv)或猴免疫缺陷病毒(siv)。
44.在第一方面的一些实施方案中，所述间充质干细胞来源于脐带、胎盘、脂肪和/或牙髓。
45.在第一方面的一些具体实施方案中，所述间充质干细胞来源于脐带。
46.在第一方面的一些实施方案中，所述脐带间充质干细胞取自足月生产的胎儿脐带的华通氏胶，用培养法获取的间充质干细胞。
47.在第一方面的一些具体实施方案中，所述脐带间充质干细胞可通过以下步骤获得：取足月生产胎儿的脐带，用pbs反复清洗后，去掉静脉、动脉血管，眼科剪剪碎剩余部分，均匀铺在培养皿中，加入脐带源间充质干细胞原代培养基，培养1周左右，待间充质干细胞爬出后去掉组织，即获得脐带间充质干细胞。待脐带间充质干细胞生长至80％融合度时进行传代培养。
48.在第一方面的一些实施方案中，pmxs-hoct4、pmxs-hsox2、pmxs-hklf4和pmxs-hc-myc四种逆转录病毒载体可通过商购获得。
49.在第一方面的一些实施方案中使用293t细胞作为病毒包装工具对逆转录病毒载体进行包装。
50.在第一方面的一些实施方案中，所述方法还包括在用所述逆转录病毒载体转染所述间充质干细胞之前分离并培养所述间充质干细胞，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
51.在第一方面的一些实施方案中，所述方法还包括鉴定转染后获得的多能干细胞，和/或培养、传代所述多能干细胞。
52.在第一方面的一些实施方案中，可以通过检测多能干细胞的tra-1-60的表达来鉴定所述多能干细胞。
53.在第一方面的一些实施方案中，可以通过检测碱性磷酸酶表达来鉴定所述多能干细胞。
54.在第一方面的一些实施方案中，可以通过检测三胚层分化来鉴定所述多能干细胞。
55.在第一方面的一些实施方案中，大于95％的所述间充质干细胞表达cd90、cd105和cd7。
56.在第一方面的一些实施方案中，小于2％的所述间充质干细胞表达cd14、cd19、cd34、cd45和hla-dr。
57.在第一方面的一些实施方案中，所述多能干细胞表达tra-1-60。
58.在第一方面的一些实施方案中，所述多能干细胞不表达ssea1。
59.在第一方面的一些实施方案中，所述多能干细胞能够向三胚层分化。
60.第二方面，本技术提供了通过第一方面所述的方法制备的多能干细胞。
61.在第二方面的一些实施方案中，所述多能干细胞表达tra-1-60。
62.在第二方面的一些实施方案中，所述多能干细胞不表达ssea1。
63.在第二方面的一些实施方案中，所述多能干细胞能够向三胚层分化。
64.第三方面，本技术提供了第二方面所述的多能干细胞在制备用于治疗的细胞产品中的用途。
65.实施例
66.下面结合实施例示例性描述本技术的发明，但实施例部分的内容不以任何方式限制本技术的各项发明。
67.实验例1.从脐带中分离间充质干细胞
68.(1)将脐带剪成5cm左右小段，去除静脉、动脉血管；
69.(2)将剩余部分剪成2mm左右小组织块，均匀平铺在直径为10cm的细胞培养皿中；
70.(3)在每个小组织块上滴加一滴脐带间充质干细胞无血清培养基(购自武汉普诺赛生命科技有限公司)，并将培养皿放在37℃、5％co2的饱和湿度条件下培养；
71.(4)培养4-6h后轻柔地将培养皿取出，添加10ml脐带间充质干细胞无血清培养基(购自武汉普诺赛生命科技有限公司)后放在培养箱中继续培养。
72.(5)待细胞爬出70％～80％左右时，去除培养基及残余组织块，进行传代，期间隔一天补加一次脐带间充质干细胞培养基。
73.(6)传代：去除细胞培养基，用pbs漂洗一次，加入2ml间充质干细胞温和消化酶浸润细胞，待细胞消化至单个时加入4ml间充质干细胞培养基终止，轻柔将细胞吹匀成单个并转移到15ml离心管中，800rpm离心3min，去除上清，用2ml间充质干细胞培养基重悬，台盼蓝计数后，将1
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106个细胞接种到新的培养皿中继续培养。
74.脐带间充质干细胞的形态如图1所示，呈梭形，在培养皿内壁贴壁生长，完全符合国际细胞治疗协会对间充质干细胞的定义。
75.实施例2.诱导脐带间充质干细胞成为多能干细胞
76.(1)用cacl2转染法，以293t细胞为逆转录病毒包装工具细胞进行逆转录病毒包装，所述逆转录病毒为pmxs-hoct4、pmxs-hsox2、pmxs-hklf4和pmxs-hc-myc(均获自addgene平台)；
77.(2)将脐带间充质干细胞按2
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105个细胞/孔接种到6孔板中，待细胞长至70％-80％左右的融合度时，用已经包装好的逆转录病毒质粒转染脐带间充质干细胞；
78.(3)转染后，将亲代hbm间充质干细胞以1:3的比例裂解到基质包被的细胞培养皿中，在培养皿上接种灭活的小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast，mef)作为饲养层；
79.(4)将转染的脐带间充质干细胞在补充了8ng/ml的碱性成纤维生长因子(bfgf)的多能干细胞培养基中继续培养7天；
80.(5)在培养七天后，将转染的脐带间充质干细胞进一步培养在以灭活mef为饲养层和补充有0.5μm mek抑制剂pd325901、2μm tgfβ受体抑制剂sb431542和10μm p53抑制剂pifithrinα的培养基中，每天进行细胞换液；
81.(6)将形态与胚胎干细胞类似的克隆挑出进行后续培养。
82.通过上述步骤获得多能干细胞的形态如图2所示：紧密的细胞菌落，形态均匀，边缘清晰，完全符合多能干细胞的形态特征。
83.实施例3.多能干细胞特异性抗体表达
84.通过免疫荧光法对胚胎干细胞特异性的蛋白tra-1-60的表达进行分析。将细胞用4％多聚甲醛固定，用1
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pbs洗涤，并用1％bsa溶液封闭。然后，分别用针对tra-1-60的一抗进行处理，4℃封闭过夜。1
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pbs洗涤，孵育带有荧光素的二抗，37℃孵育40min。再次洗涤后，使用共聚焦显微镜对蛋白表达进行分析，结果见图3所示：细胞克隆显示多能干细胞的特异性标记物tra-1-60阳性。
85.实施例4.多能干细胞的碱性磷酸酶检测
86.使用多能干细胞碱性磷酸酶检测试剂盒(购自赛默飞世尔科技公司)对实施例2获得的多能干细胞进行检测。结果如图4所示：细胞克隆碱性磷酸酶染色阳性，说明克隆细胞群是多能干细胞。
87.实施例5.多能干细胞的分化能力
88.使用多能干细胞三胚层分化试剂盒(购自赛默飞世尔科技公司)对实施例2获得的多能干细胞进行三胚层分化检测。结果如图5所示：细胞表达内胚层特异性的标记物afp，中胚层特异性的标记物sma，和外胚层特异性的标记物tuj1。
89.上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本技术作了详尽的描述，但在本技术基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本技术精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本技术要求保护的范围。

技术特征：
1.将间充质干细胞诱导为多能干细胞的方法，其包括将以下基因中的一种或多种导入所述间充质干细胞中进行表达：oct4、sox2、klf4和c-myc；优选地，将oct4、sox2、klf4和c-myc四种基因导入所述间充质干细胞中进行表达。2.根据权利要求1所述的方法，其中使用载体将所述基因导入所述间充质干细胞中进行表达，所述载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、痘病毒载体、杆状病毒载体、乳头瘤病毒载体或乳多空病毒载体；优选地，所述载体为逆转录病毒载体。3.根据权利要求2所述的方法，所述逆转录病毒载体选自以下中的一种或多种：pmxs-hoct4、pmxs-hsox2、pmxs-hklf4和pmxs-hc-myc；优选地，所述逆转录病毒载体为pmxs-hoct4、pmxs-hsox2、pmxs-hklf4和pmxs-hc-myc。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述间充质干细胞来源于脐带、胎盘、脂肪和/或牙髓，优选地，所述间充质干细胞来源于脐带。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其还包括在用所述逆转录病毒载体转染所述间充质干细胞之前分离并培养所述间充质干细胞，优选脐带间充质干细胞；和/或鉴定转染后获得的多能干细胞，和/或培养、传代所述多能干细胞。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中大于95％的所述间充质干细胞表达cd90、cd105和cd7；和/或小于2％的所述间充质干细胞表达cd14、cd19、cd34、cd45和hla-dr。7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞表达tra-1-60；和/或所述多能干细胞不表达ssea1。8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞能够向三胚层分化。9.通过权利要求1-8中任一项所述的方法制备的多能干细胞。10.权利要求9所述的多能干细胞在制备用于治疗的细胞产品中的用途。

技术总结
本申请提供了将间充质干细胞诱导为多能干细胞的方法，其包括将以下基因中的一种或多种导入所述间充质干细胞中进行表达：Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc。本申请还提供了通过上述方法制备的多能干细胞及其用途。法制备的多能干细胞及其用途。


技术研发人员：宋海峰 何晖 付洁
受保护的技术使用者：是光隽恒（北京）生物科技有限公司
技术研发日：2020.09.08
技术公布日：2022/3/7