靶核酸的检测方法及其应用

1.本技术涉及核酸检测技术领域，尤其是涉及靶核酸的检测方法及其应用。


背景技术：

2.通过快速、高效的检测及时发现轻症和无症状感染者体内的新型冠状病毒sars-cov-2及其变异株，能够给予早期诊断、治疗以及追踪密切接触者以便利，扩大准确且有效的诊断检测范围。因此，快速、准确、低成本且可扩展的新型冠状病毒sars-cov-2及其变异株(即rna病毒)检测技术的开发和改良对日益增长的公共卫生需求而言尤为重要。早期新型冠状病毒sars-cov-2的rna检测大多数依赖逆转录-聚合酶链式反应(rt-pcr)，但这种方法速度较慢，需要复杂、繁琐的仪器支撑。相比之下，环介导等温扩增技术(lamp)已通过改进成为一种即时、灵敏的病毒检测方法，但基于lamp技术的病毒检测方法容易出现假阳性。
3.为此，研究者将
ⅴ
型和ⅳ型crispr/cas系统(分别以cas12、cas13蛋白为基础)与lamp技术结合，经等温扩增后，以rna为导向的cas12或cas13蛋白结合于目标序列，触发非特异性核酸酶的活性，使得用于标记rna的荧光团或淬灭剂被剪切，导致荧光信号增强，得以检测。这种病毒检测技术中需要针对目的序列上游的核酸信号放大，虽然这种信号放大过程提高了检测的灵敏度，但通常需要前期的核酸扩增技术来保证反应的结果足够明显，而这就延长了检测时间，因此，有必要开发出一种能够同时具有较高的准确性和灵敏度的检测技术。


技术实现要素：

4.本技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本技术提出一种较高的准确性和灵敏度的靶核酸的检测方法及其应用。
5.本技术的第一方面，提供非疾病诊断目的的靶核酸的检测方法，包括以下步骤：
6.提供基底，基底上固定有标记了荧光报告基团的rna链；
7.将csm复合体、csm6蛋白、核酸样本与基底接触反应，反应结束后冲洗基底；csm复合体为丧失rna剪切活性的突变体；
8.利用全内反射荧光显微镜对反应前后的基底分别采集荧光信号，根据荧光强度变化得到核酸样本中的靶核酸浓度。
9.根据本技术实施例的检测方法，至少具有如下有益效果：
10.当csm复合体识别靶核酸与其结合后，会激活合成环状寡聚腺苷酸ca4的活性，生成的ca4进一步激活csm6蛋白的非特异性剪切单链rna的活性，从而将锚定在基底上的rna链剪切，而rna链上标记的荧光报告基因随剪切游离出去，降低了基底上的荧光报告基团的量。在此过程中，利用全内反射荧光显微镜(tirfm)进行检测，tirfm利用光线全反射后在介质另一面产生衰逝波的特性，激发荧光报告基团，同时由于激发光呈指数衰减的特性，大大降低了背景光噪声，有效提高了检测的准确性。因此，利用tirfm对反应前后的基底分别成像，即可根据前后荧光强度的衰减反映靶核酸的浓度，通过其高信噪比获得明显的信号，提
高检测的准确性和灵敏度。
11.需要说明的是，ⅲ型crispr-cas系统是目前发现的所有crispr-cas系统中最复杂的一类，而ⅲ型crispr-cas系统中的a亚型具有一个csm效应复合体，该复合体由5种不同的csm蛋白(csm1～5)与crrna共同组成，其中的csm1也即cas10蛋白。csm复合体具有结合并切割与crrna互补的靶核酸的活性，会导致靶核酸解离并使得cas10蛋白失活，而本方案中通过不含rna剪切活性的csm突变复合体，使得cas10蛋白的聚合酶活性得以保留，催化核苷酸聚合，产生环状核苷酸ca4等产物，利用ca4激活csm6蛋白的非特异性剪切单链rna的活性，实现信号扩大的目的，提高检测灵敏度。
12.在本技术的一些实施方式中，csm复合体和csm6蛋白来源于嗜热栖热菌(thermus thermophilus)，以下将其分别记为ttcsm复合体和ttcsm6蛋白。
13.在本技术的一些实施方式中，csm复合体的csm3具有d34a突变。ttcsm复合体的csm3引入d34a突变后，使得复合体在保留结合靶核酸活性的同时，丧失了csm3介导的靶核酸切割活性。
14.在本技术的一些实施方式中，还包括将所述atp、所述csm复合体与所述核酸样本接触反应，检测产物浓度，换算得到所述靶核酸浓度的步骤，所述产物选自氢离子、焦磷酸盐中的至少一种。
15.在本技术的一些实施方式中，检测氢离子的方法为：在反应体系中加入ph敏感性染料，根据染料变色情况，得出氢离子浓度。ph敏感性染料可以是任选随ph变化改变发光波段的指示剂，包括但不限于酚红、溶剂绿等。
16.在本技术的一些实施方式中，检测焦磷酸盐的方法为：在反应体系中加入mn
2+
和钙黄绿素，检测钙黄绿素的荧光强度，得出焦磷酸盐浓度。通常条件下，钙黄绿素的荧光被mn
2+
淬灭，而在反应体系中生成的焦磷酸盐与钙黄绿素竞争结合mn
2+
，与焦磷酸盐对钙黄绿素的竞争结合，使得钙黄绿素因为缺少mn
2+
而发出荧光，根据钙黄绿素的荧光强度可以换算得到焦磷酸盐的浓度。
17.在本技术的一些实施方式中，在检测焦磷酸盐过程中，反应体系中还加入碱土金属离子，碱土金属离子会与钙黄绿素生成高荧光复合物，从而降低检测限。
18.在本技术的一些实施方式中，靶核酸的样本来源于动物、植物、人体、微生物、土壤、水源。
19.在本技术的一些实施方式中，靶核酸为病毒核酸，进一步为冠状病毒核酸，更进一步为sars-cov-2病毒的核酸。可以理解的是，为了方便检测，靶核酸选择病毒的特异性保守序列，例如，对于sars-cov-2病毒的核酸可选n蛋白(核衣壳蛋白)基因、orf1ab基因的相关序列。
20.在本技术的一些实施方式中，rna链通过链霉亲和素-生物素作用固定在所述基底上。
21.在本技术的一些实施方式中，基底为玻片。
22.在本技术的一些实施方式中，接触反应的时间为3～8min。
23.在本技术的一些实施方式中，在接触反应前还包括对靶核酸进行扩增的步骤。由于实际操作过程中可能存在一些检测方法反应不够明显的问题，因此可采取预先扩增的方法进一步放大检测信号。优选的，可以采用重组酶聚合酶扩增(rpa)技术，该方法所需时间
短，反应条件要求低。
24.本技术的第二方面，提供试剂盒，该试剂盒包括：
25.基底，基底用于固定标记荧光报告基团的rna链；
26.csm复合体，csm复合体为丧失rna剪切活性的突变体；
27.csm6蛋白，csm6蛋白在被激活后能够非特异性剪切rna链。
28.在本技术的一些实施方式中，试剂盒还包括atp。利用atp为cas10提供反应生成ca4等产物的原料。
29.在本技术的一些实施方式中，基底上固定有荧光报告基团标记的rna链。
30.在本技术的一些实施方式中，试剂盒还包括提供反应条件的缓冲液。
31.本技术的第三方面，提供检测系统，该检测系统包括：
32.基底，基底用于固定标记荧光报告基团的rna链；
33.csm复合体，csm复合体为丧失rna剪切活性的突变体；
34.csm6蛋白，csm6蛋白在被激活后能够非特异性剪切rna链；
35.全内反射荧光显微镜，全内反射荧光显微镜用于检测反应前后基底上荧光报告基团的荧光强度变化。
36.本技术的第四方面，提供前述的试剂盒或检测系统在制备靶核酸的检测产品中的应用。
37.本技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本技术的实践了解到。
附图说明
38.图1是本技术的检测原理的示意图。
具体实施方式
39.以下将结合实施例对本技术的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本技术的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本技术的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本技术的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本技术保护的范围。
40.下面详细描述本技术的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本技术，而不能理解为对本技术的限制。
41.在本技术的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。
42.本技术的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本技术的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
43.参考图1，示出了本技术的靶核酸的检测原理，其中，csm复合体包括csm2～5和cas10以及结合在其上的crrna，当该csm复合体与靶核酸结合时，cas10蛋白的聚合酶活性催化核苷酸聚合，产生环状核苷酸ca4、氢离子、焦磷酸盐等产物，其中，ca4激活csm6蛋白的非特异性剪切单链rna的活性，从而使得锚定在基底上的rna链被剪切，而rna链上标记的荧光报告基因随剪切游离出去，使得反应前后基底上的荧光报告基团的量被降低，从而可以根据tirfm在反应前后的成像结果得到荧光强度的衰减情况得出靶核酸的浓度。
44.实施例1：蛋白的制备
45.本实施例涉及
ⅲ‑
a型crispr系统的3种质粒，如下：
46.第一种：以pcdf质粒载体为模板，融合表达ttcsm复合体中的五种亚基蛋白(包括ttcsm1、ttcsm2、ttcsm3、ttcsm4、ttcsm5)，并进行定点突变，将csm3的第34位氨基酸天冬氨酸d突变为丙氨酸a(d34a)，以灭活由csm3介导的靶rna切割。
47.第二种：以pacyc作为质粒载体，插入ttcsm1(cas10)蛋白和人工设计的crispr阵列，该合成的crispr阵列能够识别sars-cov-2的n基因。
48.第三种：以pc0075作为质粒载体，插入ttcsm6蛋白序列并融合sumo标签方便纯化。
49.将第一种质粒与第二种质粒共转化大肠杆菌bl21(de3)，在37℃的lb肉汤中生长到吸光值od
600
为0.6，然后用0.5mm iptg诱导，在16℃培养过夜。细胞在裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂超声裂解，裂解液在摇床进澄清40min，接着在4℃、10000rpm离心60min进一步澄清。将带有his标记的ttcsm1蛋白和ttcsm复合物与ni-nta合成树脂结合，用洗涤缓冲液洗涤。ttcsm复合体在添加300mm咪唑的裂解缓冲液中洗脱。洗脱蛋白在4℃下浓缩，然后通过进一步纯化，将含有ttcsm络合物的馏分混合、等分并储存在-80℃下。
50.将第三种质粒转化大肠杆菌bl21(de3)，在37℃的lb肉汤中生长到吸光值od
600
为0.6，然后用0.5mm iptg诱导，在16℃培养过夜。细胞在ttcsm6裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂超声裂解，裂解液在摇床澄清40min，在4℃、10000rpm离心60min进一步澄清。将带有his标记的ttcsm6与ni-nta树脂结合，用ttcsm6裂解液洗涤。目的蛋白在添加200mm咪唑的裂解缓冲液中洗脱。用millipore超滤离心管浓缩ttcsm6。然后在4℃下用sumo蛋白酶去除ttcsm6的亲和力标签过夜，最后纯化ttcsm6。将含有ttcsm6的馏分混合、分馏并储存在-80℃下。
51.实施例2：荧光芯片的制备
52.本实施例提供一种锚定有荧光报告基团的玻片，具体步骤如下：
53.(1)将生物素(biotin)通过化学修饰覆盖在盖玻片(24
×
30mm)表面上：首先对玻片进行清洗，使用丙酮侵蚀玻片30min，再使用氢氧化钾侵蚀1h，经过蒸馏水漂洗后在氮气下进行干燥；黑暗环境下浸泡在氨基硅烷溶液中10min，超声1-2min后再次回到黑暗环境下10min；在碳酸氢盐缓冲液中将生物素加入到玻片表面上，孵育过夜；储存于-80℃。
54.(2)加入链霉亲和素(streptavidin)使其与生物素结合：在玻片表面上使用切成细条的胶带形成载样区域，将链霉亲和素加入到玻片表面上孵育10min，用蒸馏水冲洗没有结合生物素的残余链霉亲和素。
55.(3)锚定荧光报告基团：在玻片上加入单链rna报告分子(单链rna的一端连接荧光基团fam，另一端连接生物素)孵育并用蒸馏水冲洗没有结合链霉亲和素的单链rna报告分子，得到锚定有单链rna报告分子的玻片。
56.实施例3：靶核酸的检测
57.本实施例提供一种非疾病诊断目的的靶核酸的检测方法，包括以下步骤：
58.(1)在实施例1中的ttcsm复合体、ttcsm6蛋白等反应体系加入到实施例2制备得到的荧光芯片玻片前，先使用tirfm对玻片进行荧光激发和成像，记录起始的荧光强度成像。
59.(2)在玻片表面加入250μm atp、500nm ttcsm复合体、2500nm ttcsm6蛋白、靶核酸样本以及反应缓冲液(20mm tris-hcl，ph 7.9、200mm谷氨酸单钾、10mm硫酸铵、5mm硫酸镁、1mm tcep)孵育5min，用蒸馏水冲洗被剪切掉落的荧光报告基因并再次用tirfm进行成像，获得反应后的荧光强度，根据反应前和反应后的荧光强度的衰减得到靶核酸样本中的靶核酸的浓度。
60.实施例4
61.本实施例提供一种非疾病诊断目的的靶核酸的检测方法，与实施例3的区别在于，还包括预先对靶核酸样本的扩增步骤，扩增的方式具体可以是重组酶聚合酶等温扩增技术(rpa)对样本中的靶核酸进行扩增以进一步放大信号。
62.在本实施例中，使用rpa重组酶聚合酶扩增方法，可以在37-42℃的条件下对目标序列进行扩增，这个过程主要依赖的蛋白在常温下也有活性，具有运输、保存以及检测过程中的巨大优势，无需更高的反应温度和条件，能够大大提高检测的可行性，满足不同检测环境的需求。同时，rpa技术还有其它优良的技术特点，如速度快、灵敏度高、特异性好、抗干扰能力强、低设备成本、灵活的试剂形态易于运输且储存时间长等优势。
63.实施例5
64.本实施例提供一种非疾病诊断目的的靶核酸的检测方法，与实施例3的区别在于，还包括以下步骤：
65.将实施例1制备得到的ttcsm复合体交换到低缓冲容量的缓冲液(0.5mm tris-hcl，ph＝8.8、50mm氯化钾、10mm硫酸铵、8mm硫酸镁)中。te缓冲液(10mm tris-hcl ph 7.5、1mm edta)或新型冠状病毒的rna与200nm ttcsmcsm3-d34a在1
×
warmstart colorimetric lamp master mix(neb)中孵育，再加1mm atp，反应体系为25μl。使用的缓冲液交换体积ttcsm为最终反应贡献了大约40μm tris-hcl ph＝8.8缓冲液。整个反应物添加的过程全程在冰上进行，反应体系中加入ph敏感性染料，如酚红试剂，并在led跟踪板上成像。然后在60℃孵育30min进行反应，然后快速冷却，并再次成像。反应过程中产生的氢离子会改变溶液中的酸碱度(ph值)，从而通过成像的颜色变化对氢离子的变化进行检测，从而可以从另一角度推算出样本中靶核酸的量。
66.实施例6
67.本实施例提供一种非疾病诊断目的的靶核酸的检测方法，与实施例3的区别在于，还包括以下步骤：
68.将te缓冲液(10mm tris-hcl ph 7.5、1mm edta)或新型冠状病毒的rna与500nm ttcsm复合体在反应缓冲液(20mm tris-hcl ph 8.8、100mm氯化钾、10mm硫酸铵、6mm硫酸镁、0.5mm氯化锰、1mm tcep、1mm atp和25μm钙黄绿素)中孵育，反应体系为30μl。将反应置于60℃下孵育50min，使用abi 7500快速实时pcr系统，根据fam染料对应的参数设置荧光检测系统，测量反应中荧光随时间的变化。反应孵育50min后，分别在可见光和紫外光(波长365nm)下对相同的反应进行成像。其中，钙黄绿素会被结合的二价锰离子淬灭，而在反应中产生的焦磷酸盐会与二价锰离子形成不溶解的沉淀物，从而释放钙黄绿素。游离的钙黄绿
素随后与过量的二价镁离子结合，发出强荧光，根据其荧光强度，可以检测出焦磷酸盐的量，从而可以从另一角度推算出样本中靶核酸的量。
69.综合上述实施例可以看出，本技术实施例所提供的检测方法对嗜热栖热菌(thermus thermophilus)的csm复合体的csm3亚基中负责目标rna剪切的残基进行突变(d34a)，导致其rna酶活失效，丧失对目标rna剪切的活性。这一突变体(ttcsm
csm3-d34a
突变体)在诊断方面由两个明显的优势：第一，rna酶失活的csm复合体倾向于与目标rna结合得更久，能够保持cas10聚合酶的活性；第二，在野生型的csm复合体中，由于csm3介导的目标rna剪切(如针对新型冠状病毒sars-cov-2的rna的剪切)会降低目的rna随着时间增加的浓度，导致检测的灵敏度被限制，而突变体由于不会发生目标rna的剪切，使得检测灵敏度有很大提升空间。
70.另一方面，本技术实施例针对rna病毒新型冠状病毒sars-cov-2，寻找并确定目标序列(s基因)，设计特异性crrna。所需的crrna分为间隔序列(spacer)和重复序列(repeater)，csm复合体通过crrna上的spacer序列互补配对定位于目标rna序列，与之结合并触发cas10亚基palm结构域的活性，催化核苷酸聚合，产生大量的环状核苷酸(ca4)、氢离子和焦磷酸盐(ppi)等产物。利用这种ⅲ型crispr/cas系统中独特且保守的内在信号放大机制，通过此过程中大量产生的三种产物放大对靶rna的结合信号，对它们进行检测，可以尽量减少对目的序列上游的核酸信号放大的需要。
71.其中，ca4激活ttcsm6亚基的活性，被激活的ttcsm6可以将非特异性剪切连接有荧光报告基团的rna链，从而改变检测到的荧光信号。
72.聚合过程中的氢离子，可以基于溶液环境中的酸碱度变化进行目标rna的比色法检测。rna酶失活的ttcsm复合体特异性结合sars-cov-2并激活cas10，随后cas10聚合atp，每聚合一个核苷酸，就会释放一个质子。由此产生的质子会将所在溶液环境酸化，并改变ph指示剂(例如，酚红)的颜色，呈现出从紫红色到橙色或黄色。
73.焦磷酸盐可以通过金属离子吸集进行可视化的目标rna荧光检测，金属指示剂钙黄绿素一开始会被结合的二价锰离子淬灭。rna酶失活的ttcsm复合体特异性结合新型冠状病毒sars-cov-2，激活cas10，每个atp聚合时就会产生一个焦磷酸盐，产生的焦磷酸盐会与二价锰离子形成不溶解的沉淀物，从而释放钙黄绿素。游离的钙黄绿素随后与过量的二价镁离子结合，形成一种发出强荧光的复合体，能够被肉眼或者在紫外灯下识别出。
74.在上述实施方式中，对诸如玻片的基底进行化学修饰，将荧光报告基团锚定在玻片上，方便对其储存和运输，在需要进行检测时可直接取出并加入对应的反应体系进行使用，能够为后续的产业化提供理论基础和技术指导，具有较大的商品化潜能。
75.而本技术实施例基于
ⅲ‑
a型crispr系统中ttcsm复合体识别靶rna的二级产物ca4和独立蛋白ttcsm6的信号扩大体系，结合tirfm显微镜系统，借助其高信噪比能够获得明显的信号，仅需前后成像即可获得检测结果，提高检测效率。同时，基于这个信号扩大体系，经过后续进一步优化和改善，有望达到无需前期样品扩增的手段，大大加快检测速度。
76.上面结合实施例对本技术作了详细说明，但是本技术不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本技术宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本技术的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

技术特征：
1.非疾病诊断目的的靶核酸的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：提供基底，所述基底上固定有标记了荧光报告基团的rna链；将atp、csm复合体、csm6蛋白、核酸样本与所述基底接触反应，反应结束后冲洗所述基底；所述csm复合体为丧失rna剪切活性的突变体；利用全内反射荧光显微镜对反应前后的所述基底分别采集荧光信号，根据荧光强度变化得到所述核酸样本中的靶核酸浓度。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述csm复合体和所述csm6蛋白来源于嗜热栖热菌(thermus thermophilus)。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述csm复合体的csm3具有d34a突变。4.根据权利要求1至3任一项所述的检测方法，其特征在于，还包括将所述atp、所述csm复合体与所述核酸样本接触反应，检测产物浓度，换算得到所述靶核酸浓度的步骤，所述产物选自氢离子、焦磷酸盐中的至少一种。5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，检测氢离子的方法为：在反应体系中加入ph敏感性染料，根据染料变色情况，得出氢离子浓度。6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，检测焦磷酸盐的方法为：在反应体系中加入mn
2+
和钙黄绿素，检测钙黄绿素的荧光强度，得出焦磷酸盐浓度。7.根据权利要求1至3任一项所述的检测方法，其特征在于，在所述接触反应前还包括对所述靶核酸进行扩增的步骤。8.试剂盒，其特征在于，包括：基底，所述基底用于固定标记有荧光报告基团的rna链；csm复合体，所述csm复合体为丧失rna剪切活性的突变体；csm6蛋白，所述csm6蛋白在被激活后能够非特异性剪切所述rna链。9.检测系统，其特征在于，包括：基底，所述基底用于固定标记荧光报告基团的rna链；csm复合体，所述csm复合体为丧失rna剪切活性的突变体；csm6蛋白，所述csm6蛋白在被激活后能够非特异性剪切所述rna链；全内反射荧光显微镜，所述全内反射荧光显微镜用于检测反应前后所述基底上所述荧光报告基团的荧光强度变化。10.权利要求8所述的试剂盒或权利要求9所述的检测系统在制备靶核酸的检测产品中的应用。

技术总结
本发明公开了靶核酸的检测方法及其应用。本申请的第一方面，提供非疾病诊断目的的靶核酸的检测方法，包括以下步骤：提供基底，基底上固定有标记了荧光报告基团的RNA链；将Csm复合体、Csm6蛋白、核酸样本与基底接触反应，反应结束后冲洗基底；利用全内反射荧光显微镜对反应前后的基底分别采集荧光信号，根据荧光强度变化得到核酸样本中的靶核酸浓度。Csm复合体识别靶核酸生成cA4，进一步激活Csm6蛋白的非特异性剪切单链RNA的活性，从而将锚定在基底上的RNA链剪切使得荧光报告基因随剪切游离出去，降低了基底上的荧光报告基团的量。利用TIRFM的高信噪比获得明显的信号，提高检测的准确性和灵敏度。准确性和灵敏度。准确性和灵敏度。


技术研发人员：刘畅悦 秦培武 何倩 袁曦 陈群
受保护的技术使用者：清华大学深圳国际研究生院
技术研发日：2021.11.05
技术公布日：2022/3/7