一种GILZ基因的siRNA及其应用的制作方法

一种gilz基因的sirna及其应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，更具体地说，涉及一种gilz基因的sirna及其应用。


背景技术：

2.肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，每年新发病例接近200万，死亡人数超过100万，在男性的肿瘤相关性死亡中占首位，在女性的肿瘤相关性死亡中占第二位。转移是癌症的致命标志，肿瘤转移是癌症临床管理的一大挑战。转移性疾病占所有癌症相关死亡的90％以上，而且往往与高患者死亡率有关，因为很难通过手术或常规化疗和放射治疗进行治疗。
3.在肺癌进展过程中，某些基因的表达发生变化，是肺癌发生发展的关键基因，成为肺癌治疗的潜在靶点。gilz又称tsc22d3，是tgf-β刺激的克隆22结构域(tcs-22)家族的成员，现有研究表明gilz在多种癌症中具有重要作用，但其在肺癌中发生发展过程中的影响仍未完全清楚。


技术实现要素：

4.针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种gilz基因的sirna分子。本发明所要解决的另一技术问题是提供上述gilz基因的sirna分子在建立肺癌生长相关模型中的应用。
5.为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
6.一种以gilz基因为靶点的sirna，是核酸序列如下的双链sirna分子：
[0007]5′‑
ccauagacaacaagaucgadtdt-3
′
[0008]5′‑
ucgaucuuguugucuauggdtdt-3
′
。
[0009]
所述的以gilz基因为靶点的sirna在如下(a)-(c)至少一种中的应用：
[0010]
(a)促进肺癌细胞增殖，或者制备用于促进肺癌细胞增殖的产品；
[0011]
(b)促进肺癌细胞侵袭，或者制备用于促进肺癌细胞侵袭的产品；
[0012]
(c)促进肺癌细胞克隆，或者制备用于促进肺癌细胞克隆的产品。
[0013]
进一步地，所述用于促进肺癌细胞增殖的产品为增殖能力增强的肺癌细胞模型，或者是用于制备增殖能力增强的肺癌细胞模型的物质。
[0014]
进一步地，所述用于促进肺癌细胞侵袭的产品为侵袭能力增强的肺癌细胞模型，或者是用于制备侵袭能力增强的肺癌细胞模型的物质。
[0015]
进一步地，所述用于促进肺癌细胞克隆的产品为克隆能力增强的肺癌细胞模型，或者是用于制备克隆能力增强的肺癌细胞模型的物质。
[0016]
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
[0017]
本发明针对肺癌细胞中低表达的gilz基因提供了小干扰rna。相关细胞学实验表明本发明所提供小干扰rna具有抑制肺癌细胞gilz的蛋白表达和促进肺癌细胞存活、增殖
和侵袭的重要功能。因此，本发明提供的靶向gilz基因的sirna分子可以用于建立肺癌细胞生长相关模型，有助于阐明gilz基因及其靶基因作用，有助于阐明gilz转录因子在恶性肿瘤中的发展规律，为从分子水平研究肺癌的发病机制提供帮助。
附图说明
[0018]
图1为gilz在肺癌细胞和肺癌组织中表达检测图；
[0019]
图2为cck8实验证明小干扰片段细胞水平的促肿瘤效应图；
[0020]
图3为qpcr实验证明小感染片段细胞水平的促肿瘤效应图；
[0021]
图4为细胞克隆形成实验图；
[0022]
图5为细胞侵袭实验图；
[0023]
图6为细胞凋亡实验图。
具体实施方式
[0024]
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
[0025]
实施例1：
[0026]
第一步：gilz在肺癌细胞和肺癌组织中表达检测
[0027]
分别提取收集各组细胞总蛋白，bca蛋白定量试剂盒(购自thermo scientific公司)测定蛋白含量。各组取50μg的总蛋白经12％的sds-page胶电泳分离后，用半干式电转的方法将蛋白质转移至硝酸纤维膜上，接着用含5％脱脂奶粉的封闭液室温封闭2小时。以抗gilz抗体(购自invitrogen公司)为一抗，室温孵育2小时，再以hrp标记的羊抗兔igg(购自santa cruz公司)为二抗，室温孵育2小时。最后化学增强发光法(ecl)显带，以gapdh为内参对照，结果见图1，gilz在h1299肺癌细胞和组织中较正常组织和细胞表达较低。
[0028]
第二步：sigilz小干扰片段的构建及其鉴定
[0029]
sigilz是通过和元生物公司合成，具体序列如下：
[0030]5′‑
ccauagacaacaagaucgadtdt-3
′
[0031]5′‑
ucgaucuuguugucuauggdtdt-3
′
[0032]
第三步：sigilz小干扰片段促进肺癌增殖功能的检测
[0033]
细胞学实验
[0034]
1：cck8实验证明小干扰片段细胞水平的促肿瘤效应
[0035]
将肺癌细胞h1299以2000个/孔的密度接种于96孔培养板，利用转染试剂将gilz小干扰片段，把上游和下游sirna一起使用。sigilz和对照组瞬时转染h1299细胞，分别在0h、24h、72h、96h后每孔加入10μl cck-8溶液，2小时后，选择波长，在酶联免疫检测仪上测定不同时间点每个孔的光吸收值，记录结果。吸收值大小反映了细胞活性，光值越大，细胞活力越高。根据实验数据，以时间为横坐标，吸收值为纵坐标作图。cck-8结果显示与对照组相比，小干扰实验组显著增加h1299细胞的增殖，如图2所示。
[0036]
2：qpcr实验证明小感染片段细胞水平的促肿瘤效应
[0037]
将肺癌细胞h1299，以20000个/孔的密度接种于6孔培养板，利用转染试剂将gilz小干扰片段和其它对照组瞬时转染h1299细胞，48h收集细胞。培养板中细胞的样品用1*pbs洗两次后，用1ml枪将pbs吸取干净，加入1ml trizol试剂提取细胞总rna。按试剂使用说明
操作：离心收集细胞，倾去细胞液，混匀至室温5分钟，用1ml加样器反复吹打，直至细胞完全裂解成均一溶液，不粘稠时为止。随后加入200μl氯仿，剧烈振荡15秒钟，室温放置5分钟，然后，40c，12000rpm离心5分钟，将上层水相转移至一eppendorf管中，加入500μl异丙醇后混匀。4℃，15000rpm离心15分钟，倾出异丙醇。用70％乙醇洗涤沉淀一次，置冰上，让残余乙醇挥发殆尽。溶于适量的depc水中，紫外分光仪测定rna的纯度及含量，分装冻存于保存。在20μl体系中，加入1μg总rna，1μl oligo dt(500μg/ml).rnase-free水，70℃温育10分钟后立即冰浴冷却，继续加入4μl 5
×
buffer，2μl dtt，1μl的dntps，混匀后于42℃保温2分钟，加入1μl(200u)的反转录酶，42℃继续温育50分钟。进行qpcr反应上机。结果如图3所示，小干扰片段转染组有效降低肺癌细胞中gilz的mrna量。
[0038]
3：细胞克隆形成实验
[0039]
取对数生长期的肺癌h1299细胞，放在6孔板里培养。分别是nc组和实验组sigilz，用胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞悬液在10％胎牛血清的dmem中备用，每组用50-100个细胞的密度分别接种2ml至6孔板中，并轻轻转动，使细胞分散均匀，放置37度5％co2的培养箱中培养2～3周。隔2-3天观察，当培养皿出现肉眼可见的克隆时，终止培养，弃去上清夜。pbs小心洗2次，如图4所示，结果与对照组相比，sigilz实验组的克隆增殖明显比对照组多。
[0040]
4：细胞侵袭实验
[0041]
取300μl无血清培养基，加入60μl matrigel，混匀。在冰上操作，上室加100μl，放入37度培养箱中，孵育4-5h，成固态。无血清培养基和基质胶按1∶5稀释，每孔加50μl，在37度培养箱中，分别做nc对照组和sigilz实验组。消化肺癌h1299细胞，计数，配成细胞悬液，每孔加入100μl的细胞悬液，下室加入500μl含有20％的fbs培养基，培养24h，取出transwell用pbs洗2遍，甲醇固定，加入0.1％结晶紫5-10min，室温半小时，pbs洗2遍，用棉球擦去表面的细胞，显微镜下观察。结果如图5所示，与对照组相比，sigilz实验组的侵袭能力升高。
[0042]
5：细胞凋亡实验
[0043]
提取h1299细胞，对照组nc和实验组sigilz蛋白，制备蛋白胶，bca测量蛋白浓度，进行nc和sigilz蛋白电泳，之后进行转膜2h左右，然后封闭1-2h，孵育一抗：bcl2抗凋亡蛋白；bax和beclin促凋亡蛋白，结果如图6所示，与对照组相对，sigilz实验组抑制凋亡。

技术特征：
1.一种以gilz基因为靶点的sirna，其特征在于，是核酸序列如下的双链sirna分子：5
′‑
ccauagacaacaagaucgadtdt-3
′5′‑
ucgaucuuguugucuauggdtdt-3
′
。2.权利要求1所述的以gilz基因为靶点的sirna在如下(a)-(c)至少一种中的应用：(a)促进肺癌细胞增殖，或者制备用于促进肺癌细胞增殖的产品；(b)促进肺癌细胞侵袭，或者制备用于促进肺癌细胞侵袭的产品；(c)促进肺癌细胞克隆，或者制备用于促进肺癌细胞克隆的产品。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述用于促进肺癌细胞增殖的产品为增殖能力增强的肺癌细胞模型，或者是用于制备增殖能力增强的肺癌细胞模型的物质。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述用于促进肺癌细胞侵袭的产品为侵袭能力增强的肺癌细胞模型，或者是用于制备侵袭能力增强的肺癌细胞模型的物质。5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述用于促进肺癌细胞克隆的产品为克隆能力增强的肺癌细胞模型，或者是用于制备克隆能力增强的肺癌细胞模型的物质。

技术总结
本发明公开了一种GILZ基因的siRNA及其应用，属于生物医药技术领域。本发明针对肺癌细胞中低表达的GILZ基因提供了小干扰RNA。相关细胞学实验表明本发明所提供小干扰RNA具有抑制肺癌细胞GILZ的蛋白表达和促进癌细胞存活、增殖和侵袭的重要功能。因此，本发明提供的靶向GILZ基因的siRNA分子可以用于建立肺癌细胞生长相关模型，有助于阐明GILZ基因及其靶基因作用，有助于阐明GILZ转录因子在恶性肿瘤中的发展规律，为从分子水平研究肺癌的发病机制提供帮助。供帮助。供帮助。


技术研发人员：邵晶晶 王高仁 赵天晔 沈爱国
受保护的技术使用者：南通市肿瘤医院
技术研发日：2021.11.05
技术公布日：2022/3/7