一种微生物抑制组合物及其制备方法和应用

1.本发明属于分子药物材料技术领域，具体涉及一种微生物抑制组合物及其制备方法和在制备抗感染药物中的应用。


背景技术：

2.据世界卫生组织统计，2019年在全球十大死亡原因中有三个是传染性疾病，这三个原因占所有死亡的56％，由此可见基于细菌真菌等感染导致的传染性疾病一直是人类致命的一大杀手。其中仅链球菌肺炎就导致全球每年超过100万人死亡，因此如何治疗这些病菌引起的感染是一个重要的公共卫生问题(who 2019,world health report；nature 1999,399,525-527)。随着科学研究对细菌或真菌所产生及衍生的抗菌物质作用了解的不断增加，用于抗革兰氏阳性、革兰氏阴性以及真菌的新抗菌物质逐步被发现(nature 1946,157,455；science 1945,102,376；lancet 1945,641)。其中，b.a.johnson等人在1945年描述了一种名为“杆菌肽”的新抗菌物质，它由革兰氏阳性需氧孢子棒产生稀释后可抑制溶血性链球菌。抗生素的发现使得临床治疗感染的能力得到了很大的提升，但与此同时多重抗生素耐药菌株的广泛存在使得细菌出现抗生素耐受性，即细菌在抗生素存在下存活但不生长的能力，是耐药性的前体表型(nature 1999,399,590-593)。经典的抗生素如万古霉素，其是作为抵御肺炎链球菌和肠球菌等微生物(其中一些菌株对大多数其它抗生素具有抗药性)的最后一道防线。在短短十年间，万古霉素耐药性已经从最初的一次观察到现在的肠球菌中的万古霉素耐药性蔓延，其中52％的临床屎肠球菌分离株具有耐药性。novak等人报告了对抗生素治疗的新威胁，即出现了耐青霉素的肺炎链球菌分离株，这些分离株也对许多其它抗生素(包括万古霉素)具有耐受性。因此临床应用中单独抗生素治疗存在作用效果差、抗菌时效短等不足，为此本专利提出采用灭活细菌作为抗生素载体，用于抗生素的快速短效抗菌协同灭活疫苗激起免疫反应长效抗菌，实现高效且持久抗菌。


技术实现要素：

3.为了解决以上问题，本发明旨在提供一种微生物抑制组合物及其制备方法和在制备抗感染药物中的应用。
4.第一个方面，本发明提供了一种微生物抑制组合物，其特征在于，包括：微生物载体、负载在所述微生物载体上对所述微生物载体具有抑制作用的药物和用于促进所述药物负载的钙离子，其中所述钙离子的浓度为1-50mm，所述药物与所述微生物载体的比例为1*10-8
至3*10-8
mg/cfu。
5.较佳地，所述微生物载体包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌。
6.较佳地，所述药物选自万古霉素、左氧氟沙星和两性霉素b中的至少一种。
7.第二个方面，本发明还提供了如上所述的微生物抑制组合物的制备方法，包括：
8.将微生物载体悬浮液和含钙溶液于2-8℃的冰浴下共孵育20～40分钟，然后加入对所述微生物具有抑制作用的药物继续孵育5～20分钟，得到负载有药物的微生物载体；以
及
9.对所述负载有药物的微生物载体进行灭活处理得到所述微生物抑制组合物。
10.较佳地，所述微生物悬浮液的浓度为10
8-10
10
cfu/ml，所述微生物悬浮液和所述含钙溶液的体积比为1：(1-3)。
11.较佳地，得到的微生物抑制组合物中负载有药物的微生物载体占微生物载体的总量的比例超过85％。
12.较佳地，所述灭活处理为采用紫外灯进行辐照处理。
13.较佳地，所述紫外灯的辐照功率为15-30w，辐照处理时间为15-35分钟。
14.第三个方面，本发明还提供了一种如上所述的微生物抑制组合物在制备抗感染药物中的应用。
15.根据本发明，通过将灭活的微生物载体与氯化钙溶液反应，进行钙超载处理，对微生物膜的通透性进行调控，这样大大增加了抗生素药物的负载，随后采用紫外辐照进行灭活处理，得到负载对应抗生素药物的灭活微生物疫苗。该体系采用灭活细菌真菌等微生物负载对应细菌真菌的抗生素，以实现高效药物负载并对生物体内细菌真菌进行有效杀伤。而且申请人还发现，在实现抗生素药物直接抗菌的过程中，灭活微生物载体本身还具有抗原激活免疫性质，能有效引起机体的免疫调节。因此，本发明的抗菌微生物组合物及其制备方法，在高度保留了微生物载体本身的生物学效应的同时，实现了药物负载、靶向递送以及作为抗原激起免疫调控三大效应，也即负载的抗生素用于抗菌、微生物载体作为灭活细菌疫苗引起免疫效应持续抗菌。
16.本发明的钙超载制备微生物灭活疫苗的方法可以满足多种典型微生物及其对应抗生素的负载，并在抗生素的作用下实现快速高效的杀菌，与此同时，灭活的微生物载体作为疫苗可以实现归巢靶向以及作为抗原激活免疫的功能，从而实现对病菌的长效抗菌疗效。本发明提供了一种微生物载体及其灭活疫苗的制备方法，实现“以菌抗菌”的灭活细菌疫苗，即在实现快速高效杀菌的基础上还能作为疫苗引起生物自发的免疫效应调节机制，实现高效且长效的抗菌应用。
17.有益效果：
18.本发明的抗菌微生物组合物及其制备方法，制备工艺简便可行、药物负载率高、负载效率高、无污染、低成本，得到的负载抗生素药物的灭活微生物疫苗形貌规则、环境安全性好，有利于实现灭活微生物疫苗在病菌感染部位的快速高效杀菌和长效免疫抗菌，产生优异的治疗和免疫记忆效果，是极具应用前景的抗菌纳米药物制备方案之一。
附图说明
19.图1为本发明实施例中三种微生物灭活前后的流式细胞术分布(a到c依次为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白念球菌)，其中1代表灭活处理的微生物，2代表未灭活的微生物。
20.图2为本发明实施例中三种微生物灭活前后的生物电镜sem图。
21.图3为本发明实施例中负载抗生素药物并灭活的微生物疫苗的流式细胞术分布(a到c依次为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白念球菌)，其中1代表灭活处理的微生物，2代表未灭活的微生物。
22.图4为本发明实施例中负载抗生素药物灭活前后的微生物疫苗的共聚焦显微镜
图。
23.图5为本发明实施例中负载抗生素药物并灭活的微生物疫苗的抗菌抑菌效果图,其中d为对照组，e为抗生素处理组，f为微生物疫苗处理组。
具体实施方式
24.以下结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。应理解，以下附图和实施例用于说明本发明，而非限制本发明。
25.本发明公开一种微生物抑制组合物，微生物载体、负载在所述微生物载体上对所述微生物载体具有抑制作用的药物和用于促进所述药物负载的钙离子，其中所述钙离子的负载浓度为1-50mm，所述所述药物与所述微生物载体的比例为1*10-8
至3*10-8
mg/cfu。进一步地提供上述微生物抑制组合物的制备方法，包括：将微生物载体悬浮液和含钙溶液于2-8℃的冰浴下共孵育20～40分钟，然后加入对所述微生物具有抑制作用的药物继续孵育5～20分钟，得到负载有药物的微生物载体；以及对所述负载有药物的微生物载体进行灭活处理得到所述微生物抑制组合物。
26.在一个实施例中，所述微生物载体可以是生物学领域公知的典型细菌真菌，例如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌或白念球菌。所述微生物载体的形貌可以为球状、杆状等，其粒径可以为1-3μm，所述药物优选地为抗生素药物，选自万古霉素、左氧氟沙星和两性霉素b中的至少一种。
27.在上述微生物抑制组合物的制备方法中，所述微生物悬浮液的浓度为10
8-10
10
cfu/ml，所述微生物悬浮液和所述含钙溶液的体积比为1：(1-3)。得到的微生物抑制组合物中负载有药物的微生物载体占微生物载体的总量的比例超过85％。
28.微生物载体经过钙离子的钙超载后，负载对应抗生素药物，然后在紫外辐射照射处理后实现完全灭活，确保其体内应用的生物安全性。灭活方法为本领域的常规方法，不作限定，优选为采用紫外灯对负载有药物的微生物载体进行辐照处理，获得微生物抑制组合物，这种微生物组合物可以作为一种抗感染(例如肺炎)的微生物疫苗使用。较佳地，所用紫外辐照功率为15-30w，优选为25w；辐射照射处理时间为15-35min，优选为30min。
29.负载后经过灭活处理的微生物疫苗体系中，钙超载所使用的氯化钙的浓度为1-50mm，最佳浓度为10mm，还可以例如为12mm、15mm，在这些浓度下，可以较好地对微生物载体(微生物膜)的通透性进行调控，以有利于药物的功效负载，其中钙超载的反应温度为2-8℃，较佳温度为4℃，反应时间为20-40min，较佳时间为30min。
30.本发明的优选实施方式中，钙超载制备微生物灭活疫苗可以满足多种典型微生物及其对应抗生素的负载。所述微生物载体可以根据需要选择，优选典型的细菌真菌(例如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白念球菌)，所述抗生素药物也可以根据需要选择，优选典型的上市药物(例如万古霉素、左氧氟沙星、两性霉素b)。灭活的微生物载体作为疫苗可以实现归巢靶向以及作为抗原激活免疫的功能，从而实现对病菌的长效抗菌疗效。本发明提供的微生物灭活疫苗为实现“以菌抗菌”的灭活细菌疫苗，即在实现快速高效杀菌的基础上还能作为疫苗引起生物自发的免疫效应调节机制，实现高效且长效的抗菌应用。
31.在制备负载抗生素药物的微生物抑制组合物的过程中，钙超载处理的制备方法不限，例如可以是以氯化钙作为钙超载的调控剂，增大微生物膜的通透性，通过混合共孵育、
离心以及重悬等方法制备负载抗生素药物的抗菌微生物组合物。所采用的通透性调控方式有多种，例如：提高处理温度、降低ph值、电处理和超声处理等，在本发明中采用钙超载这一生物学常用方法。钙超载是利用溶液中的钙离子使微生物膜的细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导微生物成为感受态，从而使得微生物膜的通透性发生变化。
32.本发明提供了一种便捷可行的、普适性好、无毒害的方法制备出具有稳定形貌、负载率高、多种治疗方式协同、生物安全性良好的新型灭活疫苗药物载体。在此公开的制备方法制备工艺便捷易行、制备条件精确可控。在此公开的灭活微生物疫苗药物体系可以实现负载抗生素药物具有抗感染功效的同时，还可作为疫苗激起生物体的自发免疫，从而大大提升治疗效果，并且免疫记忆使得机体抵抗力大幅上升。这种灭活微生物疫苗药物在微生物感染的抗生素药物治疗及协同免疫方面的应用中有优异且广阔的应用前景。
33.下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
34.实施例1
35.本实施例通过以下步骤制备抗菌微生物灭活疫苗：
36.步骤(1)，通过钙超载工艺制备负载抗生素的微生物：2ml的cacl2(10mm)和1ml的微生物悬浮在冰水浴上共孵育30min，控制冰水浴的温度在2-8℃，加入2ml标记了cy5.5的对应抗生素，继续反应10min，然后离心重悬，得到负载药物的微生物。为了充分除去残余的抗生素，培养液洗涤离心步骤重复3次。
37.步骤(2)，负载抗生素微生物灭活疫苗的制备：将1ml负载抗生素后的微生物均匀分散于培养皿上，在功率为30w的紫外辐射照射下处理30min，将微生物进行灭活处理，得到负载抗生素的微生物灭活疫苗。
38.图1为本发明实施例中三种微生物灭活前后的流式细胞术分布(a到c依次为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白念球菌)，其中1代表灭活处理的微生物，2代表未灭活的微生物。在该图中，三种微生物为为未钙超载、未负载抗生素药物的微生物，这三种微生物预先经过灭活处理，然后重悬于pbs中测试其灭活前后的流式细胞术分布。图1中的结果表明，灭活前后三种微生物的结构大小和群落复杂度均发生了一定的变化。
39.图2为本发明实施例中三种微生物灭活前后的生物电镜sem图，直观地展现了灭活前后三种微生物的形貌特征以及尺寸大小和良好的骨架结构，表明灭活后微生物的结构基本保持完整，表面部分发生皱缩，形貌相比灭活前略微有缩小，与图1中的流式细胞术呈现的结果保持一致。
40.图3为本发明实施例中负载抗生素药物并灭活的微生物疫苗的流式细胞术分布(a到c依次为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白念球菌)。其中三种对应的抗生素药物接了cy5.5荧光基团，其中1代表未负载药物的微生物，2代表负载药物后的微生物，统计结果显示，三种微生物载体(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白念球菌)对对应的三种抗生素药物(万古霉素、左氧氟沙星、两性霉素b)的负载率分别为89.54％、87.82％、95.69％。
41.图4为本发明实施例中负载抗生素药物灭活前后的微生物疫苗的共聚焦显微镜图，结果表明灭活处理前的三种微生物活性良好，经紫外辐射照射处理后的微生物疫苗则均处于灭活状态，表面紫外辐射照射处理后的灭活微生物具有良好的生物安全性。
42.图5为本发明实施例中负载抗生素药物并灭活的微生物疫苗的抗菌抑菌效果图，其中d为对照组，e为抗生素处理组，f为微生物疫苗处理组，结果表明负载抗生素药物并灭活的微生物疫苗具有良好的抗菌效果。
43.实施例2
44.与实施例1其它条件相同，不同的是加入的cacl2浓度为15mm。最终结果显示，三种微生物载体(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白念球菌)对对应的三种抗生素药物(万古霉素、左氧氟沙星、两性霉素b)的负载率分别为91.56％、89.72％、96.04％。
45.实施例3
46.与实施例1其它条件相同，不同的是加入的cacl2浓度为20mm。最终结果显示，三种微生物载体(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白念球菌)对对应的三种抗生素药物(万古霉素、左氧氟沙星、两性霉素b)的负载率分别为92.72％、91.55％、97.79％。

技术特征：
1.一种微生物抑制组合物，其特征在于，包括：微生物载体、负载在所述微生物载体上对所述微生物载体具有抑制作用的药物和用于促进所述药物负载的钙离子，其中所述钙离子的浓度为1-50mm，所述药物与所述微生物载体的比例为1*10-8
至3*10-8
mg/cfu，得到的微生物抑制组合物中负载有药物的微生物载体占微生物载体的总量的比例超过85％。2.根据权利要求1所述的微生物抑制组合物，其特征在于，所述微生物载体包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌。3.根据权利要求1或2所述的微生物抑制组合物，其特征在于，所述药物选自万古霉素、左氧氟沙星和两性霉素b中的至少一种。4.一种如权利要求1-3中任一项所述的微生物抑制组合物的制备方法，其特征在于，包括：将微生物载体悬浮液和含钙溶液于2-8℃的冰浴下共孵育20～40分钟，然后加入对所述微生物具有抑制作用的药物继续孵育5～20分钟，得到负载有药物的微生物载体；以及对所述负载有药物的微生物载体进行灭活处理得到所述微生物抑制组合物。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述微生物悬浮液的浓度为10
8-10
10
cfu/ml，所述微生物悬浮液和所述含钙溶液的体积比为1：(1-3)。6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，得到的微生物抑制组合物中负载有药物的微生物载体占微生物载体的总量的比例超过85％。7.根据权利要求4-6中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述灭活处理为采用紫外灯进行辐照处理。8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述紫外灯的辐照功率为15-30w，辐照处理时间为15-35分钟。9.一种如权利要求1-3中任一项所述的微生物抑制组合物在制备抗感染药物中的应用。

技术总结
本发明提供一种微生物抑制组合物，包括：微生物载体、负载在所述微生物载体上对所述微生物载体具有抑制作用的药物和用于促进所述药物负载的钙离子，其中所述钙离子的浓度为1-50mM，所述药物与所述微生物载体的比例为1*10-8


技术研发人员：葛敏 林翰 施剑林
受保护的技术使用者：中国科学院上海硅酸盐研究所
技术研发日：2021.11.05
技术公布日：2022/3/7