茶枝柑胎多甲氧基黄酮类化合物在制备抗氧化剂中的应用

1.本发明属于植物有效成分的提取及应用技术领域，具体涉及茶枝柑胎多甲氧基黄酮类化合物在制备抗氧化剂中的应用。


背景技术：

2.在生物体内，存在一种氧化还原平衡，当机体发生衰老、疾病时，这种氧化还原平衡会遭到破坏，偏移向氧化方向，积累过量的各种自由基、氧化物，如活性氧自由基(ros)和活性氮自由基(rns)等。这些氧化物质极易与dna、蛋白质、磷脂等结合，造成细胞内各细胞器的氧化损伤，进而加速疾病的进程。已有研究表明，血管损伤性疾病、炎症或肿瘤等疾病的进展均与细胞的氧化损伤有关。因此，在防治这些疾病的过程中，抗氧化剂的使用十分重要。而人工合成的抗氧化剂，如叔丁基对羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯等，均有报道表明其具有潜在的急性毒性和发育毒性，所以对天然来源的抗氧化剂的研究得以重视。近二十年来，不断有天然抗氧化剂从动植物中发现，天然产物具有低毒高效、容易被吸收的特点，发展前景十分广阔。
3.茶枝柑(citrus reticulata
‘
chachi')是芸香科柑橘属柑橘的栽培品种，是广陈皮(新会陈皮)的基源植物，在中药上，茶枝柑成熟组织完全分化果实的果皮入药，名“广陈皮或新会陈皮”，但实际上，茶枝柑果实组织未分化的干燥幼果也可入药，名“茶枝柑胎或茶枝柑个青皮”。茶枝柑胎归入肝、胆、胃经，具有疏肝破气，消积化滞的功效，常用于食积气滞，脘腹胀痛，主要化学成分有黄酮类、挥发油类和氨基酸类等。现代药理学研究表明，茶枝柑胎对消化系统、心血管系统和呼吸系统等有广泛的生物学效应，其应用前景值得重视。茶枝柑胎与橘子皮和广陈皮不同，前者(茶枝柑胎)组织没有分化，包括未分化的果肉与果皮；后者(茶枝柑柑皮和广陈皮)为干燥成熟果皮，仅指果实组织完全分化的果皮(茶枝柑果皮存放三年叫广陈皮或新会陈皮)，不包括果肉，两者在化学成分、药理活性和临床应用等方面具有显著不同。广陈皮归肺、脾经，具有理气健脾，开胃化痰之功效，多用于食少吐泻，咳嗽痰多等预防或治疗，主要成分包括黄酮类、生物碱类、多糖类及挥发油等。广陈皮是陈皮的一种，来源于柑橘(citrus reticulata blanco)的一个栽培变种，与陈皮比较，作用更加温和，化学成分如多甲氧基黄酮成分更多，其品质也更高。长期以来针对陈皮或广陈皮的研究报道众多，开发的相关产品也非常丰富多样，但鲜少见茶枝柑胎的研究报道。目前市场上还没有将茶枝柑胎开发成抗氧化药物、保健食品或化妆品，其药用价值尚未得到充分的发挥。而且我国具有丰富的茶枝柑胎资源，这为进一步加强茶枝柑胎的开发应用奠定了有利的基础。


技术实现要素：

4.本发明第一方面的目的，在于提供茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物在制备抗氧化剂中的应用。
5.本发明第二方面的目的，在于提供茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物在制备抗氧化添
加剂中的应用。
6.本发明第三方面的目的，在于提供茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物在制备膳食补充剂中的应用。
7.为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
8.本发明的第一个方面，提供茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物在制备抗氧化剂中的应用。
9.优选地，所述抗氧化剂用于保护细胞免受氧化损伤。
10.优选地，所述抗氧化剂用于保护细胞免受一氧化氮合成供体(snp)引起的氧化损伤。
11.本发明的第二个方面，提供茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物在制备抗氧化添加剂中的应用。
12.优选地，所述抗氧化添加剂用于制备药品、食品或护肤品。
13.优选地，所述药品用于治疗和/或预防与氧化损伤有关的疾病。
14.优选地，所述与氧化损伤有关的疾病包括神经退行性疾病、炎症性疾病和肿瘤。
15.本发明的第三个方面，提供茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物在制备膳食补充剂中的应用。
16.优选地，所述膳食补充剂用于清除体内自由基，预防或延缓衰老。
17.根据本发明的第一个方面、第二个方面和第三个方面，所述茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物的制备方法包括如下步骤：
18.(1)提取：将茶枝柑胎与有机溶剂混合，提取，固液分离，取液体，浓缩得到浸膏a1；
19.(2)萃取：将浸膏a1与水混合，得到混悬液，将混悬液与有机溶剂混合，萃取，取有机溶剂相，即茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物。
20.优选地，步骤(1)中所述茶枝柑胎混合前粉碎至过筛12～16目。
21.优选地，步骤(1)中所述有机溶剂为乙醇。
22.优选地，所述乙醇的浓度为20～100％(v/v)；进一步为70～95％(v/v)。
23.优选地，步骤(1)中所述茶枝柑胎与有机溶剂的质量体积比为1：(2～8)；进一步为1：(3～5)。
24.优选地，步骤(1)中所述提取的方式为煎煮提取、超声辅助提取、回流提取和渗漉提取中的至少一种；进一步为超声辅助提取。
25.优选地，所述超声辅助提取的条件为30～50℃、200～400w、30～50khz下提取20～40min。
26.优选地，步骤(1)中所述提取的次数为1～6次；进一步为1～5次。
27.优选地，步骤(1)中所述固液分离的方式为过滤。
28.优选地，步骤(1)中所述浓缩为减压浓缩。
29.优选地，步骤(2)中所述浸膏a1与水的质量体积比为1:(0.5～1)。
30.优选地，步骤(2)中所述混悬液与所述有机溶剂的体积比为1：(2～5)；进一步为1：(3～4)。
31.优选地，步骤(2)中所述有机溶剂为石油醚、正丁烷、二氯甲烷、正丁醇和乙酸乙酯中的至少一种；进一步为乙酸乙酯。
32.优选地，步骤(2)中所述萃取的次数为1～6次；进一步为2～5次；更进一步为3～4次。
33.优选地，所述制备方法还包括如下步骤：将有机溶剂相进行浓缩，干燥。
34.优选地，所述浓缩为减压浓缩。
35.优选地，所述干燥的方法为冷冻干燥至恒重。
36.优选地，所述茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物中多甲氧基黄酮类化合物的含量大于50％；进一步为50～55％。
37.优选地，所述多甲氧基黄酮类化合物包括异橙黄酮、5-羟基-6,7,8,4'-四甲氧基黄酮、川陈皮素、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮、橘皮素和5-羟基-6,7,8,3'-4'-五甲氧基黄酮。
38.优选地，所述异橙黄酮、5-羟基-6,7,8,4'-四甲氧基黄酮、川陈皮素、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮、橘皮素和5-羟基-6,7,8,3'-4'-五甲氧基黄酮的质量比为(0.5～1.5)：(2.5～4)：(24～30)：(0.5～1)：(16～20)：(2.5～4)；进一步为(1.29～1.5)：(3.12～4)：(27.45～30)：(0.78～1)：(18.15～20)：(3.08～4)。
39.本发明的有益效果是：
40.本发明首次公开了茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物在制备抗氧化剂中的应用，茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物对细胞氧化损伤具有保护作用，而且能显著降低细胞内ros水平、恢复线粒体的膜电位以恢复线粒体的功能，进而减轻氧化应激损伤，表现出较好的临床抗氧化效果，可应用于各种对安全性有更高要求的药品、食品、护肤品中，提高相应产品的抗氧化能力；或单独作为抗氧化剂；也可作为膳食补充剂用于清除体内多余的自由基、预防或延缓衰老；或作为药品或辅助用药用于治疗与氧化损伤有关的神经退行性疾病、肿瘤或炎症等疾病。
附图说明
41.图1是实施例1得到的茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物的高效液相色谱图。
42.图2是不同浓度的一氧化氮合成供体(snp)对huvecs细胞存活率的影响图。
43.图3是不同浓度的茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物对snp诱导huvecs细胞氧化损伤的影响图：其中，****表示与空白对照组相比，p＜0.0001；***表示与空白对照组相比，p＜0.001；*表示与空白对照组相比，p＜0.05。
44.图4是不同浓度的茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物对snp诱导huvecs细胞形态的影响图。
45.图5是不同浓度的茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物对snp诱导huvecs细胞内活性氧(ros)的影响图。
46.图6是不同浓度的茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物对snp诱导huvecs细胞内线粒体膜电位的影响图。
具体实施方式
47.以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
48.本实施例中所采用的原料，除特殊说明外，均通过常规手段制备或者通过商业渠
道购买。
49.实施例1一种茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物的制备方法
50.(1)将干燥的茶枝柑胎(茶枝柑胎采自广东省江门市新会区茶坑村)粉碎过筛14目，按固液比(质量体积比)1：4加入95％(v/v)的乙醇水溶液超声辅助提取3次(功率300w，频率40khz，时间30min，温度40℃)，过滤，合并滤液，减压浓缩得浸膏a1；
51.(2)将浸膏a1用水溶解(浸膏a1与水的质量体积比(kg/l)1：0.8)，得到混悬液；加入乙酸乙酯(乙酸乙酯与混悬液的体积比为3：1)萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩得浸膏a2；
52.(3)将浸膏a2冷冻干燥至恒重，得到茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物。
53.实施例2一种茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物的制备方法
54.(1)将干燥的茶枝柑胎(茶枝柑胎采自广东省江门市新会区茶坑村)粉碎过筛14目，按固液比(质量体积比)1：4加入80％(v/v)的乙醇水溶液超声辅助提取4次(功率300w，频率40khz，时间30min，温度40℃)，过滤，合并滤液，减压浓缩得浸膏a1；
55.(2)将浸膏a1用水溶解(浸膏a1与水的质量体积比(kg/l)1：0.8)，得到混悬液；加入乙酸乙酯(乙酸乙酯与混悬液的体积比为5：1)萃取2次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩得浸膏a2；
56.(3)将浸膏a2冷冻干燥至恒重，得到茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物。
57.实施例3一种茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物的制备方法
58.(1)将干燥的茶枝柑胎(茶枝柑胎采自广东省江门市新会区茶坑村)粉碎过筛14目，按固液比(质量体积比)1：4加入70％(v/v)的乙醇水溶液超声辅助提取5次(功率300w，频率40khz，时间30min，温度40℃)，过滤，合并滤液，减压浓缩得浸膏a1；
59.(2)将浸膏a1用水溶解(浸膏a1与水的质量体积比(kg/l)1：0.8)，得到混悬液；加入乙酸乙酯(乙酸乙酯与混悬液的体积比为4：1)萃取4次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩得浸膏a2；
60.(3)将浸膏a2冷冻干燥至恒重，得到茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物。
61.实施例4一种茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物的制备方法
62.(1)将干燥的茶枝柑胎(茶枝柑胎采自广东省江门市新会区茶坑村)粉碎过筛14目，按固液比(质量体积比)1：4加入100％(v/v)的乙醇溶液超声辅助提取1次(功率300w，频率40khz，时间30min，温度40℃)，过滤，合并滤液，减压浓缩得浸膏a1；
63.(2)将浸膏a1用水溶解(浸膏a1与水的质量体积比(kg/l)1：0.8)，得到混悬液；加入乙酸乙酯(乙酸乙酯与混悬液的体积比为5：1)萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩得浸膏a2；
64.(3)将浸膏a2冷冻干燥至恒重，得到茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物。
65.实施例5一种茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物的制备方法
66.(1)将干燥的茶枝柑胎(茶枝柑胎采自广东省江门市新会区茶坑村)粉碎过筛14目，按固液比(质量体积比)1：4加入20％(v/v)的乙醇水溶液超声辅助提取2次(功率300w，频率40khz，时间30min，温度40℃)，过滤，合并滤液，减压浓缩得浸膏a1；
67.(2)将浸膏a1用水溶解(浸膏a1与水的质量体积比(kg/l)1：0.8)，得到混悬液；加入乙酸乙酯(乙酸乙酯与混悬液的体积比为2：1)萃取5次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩
得浸膏a2；
68.(3)将浸膏a2冷冻干燥至恒重，得到茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物。
69.实施例6茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物中多甲氧基黄酮类化合物的定量分析
70.采用效液相色谱法(hplc)法对实施例1得到的茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物中6种多甲氧基黄酮进行定量分析，重复3次，分析仪采用：shimadzu lc system equipped with spd-m20a detector；色谱柱：agilent zorbax eclipse xdb-c18(4.6mm
×
250mm，5μm)；流动相：b相为0.1％(v/v)甲酸水溶液，b相为乙腈；梯度洗脱程序：25％～55％b，0～5min；55％～68％b，5～15min；68％～90％b，15-18min；流速：1ml/min；检测波长：283nm，330nm；进样体积：10μl；检测温度：30℃。hplc结果如图1和表1所示：实施例1得到的茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物中多甲氧基黄酮类化合物的总含量占50％以上，主要的6种成分是异橙黄酮、5-羟基-6,7,8,4'-四甲氧基黄酮、川陈皮素、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮、橘皮素、5-羟基-6,7,8,3'-4'-五甲氧基黄酮。
71.表1实施例1得到的茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物中多甲氧基黄酮类化合物的测定结果
[0072][0073]
实施例7茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物的抗氧化活性
[0074]
1.实验仪器与材料
[0075]
实验仪器如表2所示，实验材料如表3所示。
[0076]
表2实验仪器
[0077][0078]
表3实验材料
[0079][0080][0081]
2.实验方法
[0082]
(1)huvecs细胞氧化应激模型的建立
[0083]
将huvecs细胞重悬液用完全培养基(内皮细胞培养基+5％胎牛血清+1％生长因子+1％双抗)稀释至细胞浓度为6
×
104cells/ml，用排枪取100μl细胞液接种于96孔板中，培养24h后，丢弃旧的细胞培养液，模型组分别加入100μl含有系列浓度(终浓度分别为2000μm、1500μm、1000μm、800μm、600μm、400μm、200μm、100μm)一氧化氮合成供体(snp)溶液的培养基，空白对照组则加入100μl的培养基，继续培养24h后，避光加入10μl/孔mtt溶液(5mg/ml)，于培养箱中继续培养4h后，取出，用注射器沿壁吸掉上清液，再加入100μl/孔dmso，于摇床上振摇15min使生成的紫色结晶完全溶解，用多功能酶标仪检测490nm处的吸光度值a，并根据以下公式(i)计算细胞的成活率，确定诱导剂snp浓度。
[0084]
细胞存活率(％)＝a
模型组
/a
空白对照组
ꢀꢀꢀꢀꢀ
公式(i)；
[0085]
其中，a
模型组
为模型组(snp给药组)的吸光度；a
空白对照组
为空白对照组的吸光度。
[0086]
(2)茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物对snp诱导huvecs细胞氧化损伤的影响
[0087]
将huvecs细胞重悬液用完全培养基(内皮细胞培养基+5％胎牛血清+1％生长因子+1％双抗)稀释至细胞浓度为4
×
104cells/ml，用排枪取100μl细胞液接种于96孔板中，培养24h后，丢弃旧的细胞培养液，实验组加入100μl含有系列浓度(终浓度分别为25、12.5和6.25μg/ml，溶剂为dmso)实施例1得到的茶枝柑胎多甲氧基黄酮(tb)溶液的培养基，空白对照组则加入100μl含相应浓度样品溶解溶剂(dmso)的培养基，继续培养2h后，丢弃旧的细胞培养液，加入100μl含有浓度为800μm snp溶液的培养基，在培养箱中继续培养24h，避光加入10μl/孔mtt溶液(5mg/ml)，并继续在培养箱中培养4h，取出，用注射器沿壁吸掉上清液，再加入100μl/孔dmso，于摇床上振摇15min使生成的紫色结晶完全溶解，用多功能酶标仪检测490nm处的吸光度值a，并根据公式(i)计算细胞的成活率，初步评价茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物对snp诱导huvecs细胞氧化损伤的影响。
[0088]
(3)茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物对snp诱导huvecs细胞形态的影响
[0089]
取对数期的huvecs细胞，弃旧培养基，以pbs轻轻清洗两遍，加入胰蛋白酶，消化30～60s，离心，计数，细胞数按8
×
103个接种于confocal皿中，待细胞生长至融合度约80％，(24h)，实验组加入100μl含有系列浓度(终浓度分别为25、12.5、6.25μg/ml，溶剂为dmso)实
施例1得到的茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物(tb)和终浓度为800μm snp的完全培养基；模型组加入100μl终浓度为800μm snp的完全培养基诱导氧化应激反应；空白对照组则加入100μl含相应浓度样品溶解溶剂(dmso)的完全培养基，培养24h，干预结束后，弃旧培养基，加入含10μg/ml hoechst配置液和5μm rhodamin配置液，于培养箱避光孵育30min，孵育结束后，以内皮细胞专用培养基清洗3次，加入新的完全培养基，于激光共聚焦下观察细胞状态。
[0090]
(4)茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物对snp诱导huvecs细胞内活性氧(ros)的影响
[0091]
在激光共聚焦扫描显微镜专用皿中接种大约8
×
103个细胞，培养24h后，弃培养基，实验组加入100μl含有系列浓度(终浓度分别为25、12.5、6.25μg/ml，溶剂为dmso)实施例1得到的茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物(tb)和终浓度为800μm snp的完全培养基；模型组加入100μl终浓度为800μm snp的完全培养基诱导氧化应激反应；空白对照组则加入100μl含相应浓度样品溶解溶剂(dmso)的完全培养基，培养24h后，弃旧培养基，用不含fbs的培养基将活性氧荧光探针(dcfh-da)稀释1000倍，加入到每个孔中，同时，也加入hoechst 33258染料，使终浓度为1μg/ml，避光环境下，在细胞培养箱中孵育20min，随后加入无血清培养基，轻轻摇晃清洗细胞三遍，弃培养基，再加入无血清培养基，用激光共聚焦扫描显微镜拍摄细胞内的ros情况。
[0092]
(5)茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物对snp诱导huvecs细胞内线粒体膜电位的影响
[0093]
用jc-1荧光探针检测线粒体膜电位的变化情况。在激光共聚焦扫描显微镜专用皿中种大约8
×
103个细胞，待细胞生长至融合度约80％(即培养24h)，实验组加入100μl含有系列浓度(终浓度分别为25、12.5、6.25μg/ml，溶剂为dmso)实施例1得到的茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物(tb)和终浓度为800μm snp的完全培养基；模型组加入100μl终浓度为800μm snp的完全培养基诱导氧化应激反应；空白对照组则加入100μl含相应浓度样品溶解溶剂(dmso)的完全培养基，培养24h后，弃旧培养基，使用jc-1染料进行染色，即取50μl jc-1(200
×
)，加入8ml超纯水，剧烈摇匀后加入2ml jc-1染色缓冲液(5
×
)，混匀后即得jc-1染色工作液；具体操作如下：吸除培养基，加入pbs轻轻摇晃洗涤细胞，弃pbs，加入jc-1染色工作液，37℃孵育20min；在孵育期间，取4倍量的超纯水加入jc-1染色缓冲液(5
×
)，混匀后置于冰上；结束孵育后，弃上清液，用jc-1染色缓冲液(1
×
)洗涤细胞两次；加入培养基，在激光共聚焦扫描显微镜下观察。
[0094]
3.实验结果
[0095]
(1)huvecs细胞氧化应激模型的建立
[0096]
snp浓度对huvecs细胞的存活率的影响的结果如图2所示：当snp的浓度从2000μm降低至100μm时，huvecs细胞的存活率呈现直线上升趋势，当snp浓度为800μm时，huvecs的细胞存活率为64.19％，该浓度下的细胞损伤程度较为适合，因此，选取800μm snp作为造模剂，建立huvecs的氧化应激模型。
[0097]
(2)茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物对snp诱导huvecs细胞氧化损伤的影响
[0098]
茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物对snp诱导huvecs细胞氧化损伤的影响的结果如图3所示：与模型组(snp 800μm)相比，茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物可以降低snp对huvecs细胞的氧化损伤，从而增加snp诱导huvecs细胞的存活率，并且随着茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物的提升效果越明显。
[0099]
(3)茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物对snp诱导huvecs细胞形态的影响
[0100]
本实施例采用hoechst 33342和rhodamin法观察细胞核和细胞质的变化情况，hoechst 33342可通过正常细胞的细胞膜，于461nm处发出蓝靛色荧光，而rhodamin通过细胞膜，为选择性染色活细胞线粒体的荧光染料，可检测细胞内的atp，于507nm处呈黄绿色荧光；结果如图4所示：空白对照组细胞形态为梭形，模型组的损伤细胞形态为圆形，实验组(不同浓度的茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物(tb))中细胞形态呈梭形的细胞数量较多，细胞形态呈圆形的较少，并且随着茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物(tb)浓度的增加，细胞形态呈梭形的细胞数量增加；与模型组相比，空白对照组和实验组细胞的染色数量及荧光强度均高于模型组，表明：茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物(tb)可以拮抗snp诱导的huvecs细胞损伤，对snp诱导的huvecs细胞具有一定的保护作用。
[0101]
(4)茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物对snp诱导huvecs细胞内活性氧(ros)的影响
[0102]
茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物对snp诱导huvecs细胞内活性氧(ros)的影响的结果如图5所示：空白对照组几乎无ros信号；snp诱导huvecs后，ros激增；而给予茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物(tb)预处理后(实验组)，ros显著低于模型组，表明茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物可以降低snp诱导huvecs细胞内活性氧(ros)。
[0103]
(5)茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物对snp诱导huvecs细胞内线粒体膜电位的影响
[0104]
本实施例采用jc-1荧光探针检测线粒体膜电位的变化情况，当线粒体膜电位较高时，jc-1形成聚合物(j-aggregates)，存在于线粒体的基质中，发出红色荧光，而当线粒体膜电位坍塌时，jc-1为单体化合物，显示绿色荧光，结果如图6所示：空白对照组仅显示红色荧光而无绿色荧光，说明线粒体膜电位正常；snp诱导huvecs后，绿色荧光显著增强，红色荧光显著降低，说明线粒体膜电位降低，线粒体遭到破坏；而给予茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物(tb)预处理后(实验组)，可以看到线粒体膜电位呈浓度依赖性降低，浓度越高，降低越多，即对线粒体预保护作用越强。
[0105]
实施例8茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物临床实验
[0106]
选择10名受试志愿者对实施例1制备的茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物进行使用效果测试。测试方法：每天早晚两次洗完脸后仅涂抹实施例1制备的茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物，分别在4小时后、7天后、14天后、21天、28天后进行抗氧化效果测试以及表皮角质层里含水量的测定：角质层中的水含量测定3次，取平均值。
[0107]
抗氧化效果测试使用的是orac方法(氧化自由基吸收能力)，根据自由基破坏荧光探针，使荧光强度产生变化原理，以维生素e水溶性类似物trolox为定量标准，使用荧光微孔板分析仪进行分析，荧光强度的变化大小反映自由基破坏的程度，在抗氧化剂存在时，它可以抑制自由基引起的荧光变化，抑制程度反映了它对自由基的抗氧化能力，orac的含量越高，抑制自由基的抗氧化能力就越强。测试结果如表4所示：使用实施例1制备的茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物28天后，皮肤平均表皮角质层的含水量增加了9.44％，平均总抗氧化自由基能力值(相对于等量维生素e水溶性类似物trolox的比值)约为36％(增加了7.97％)，表明茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物具有较好的抗氧化自由基能力。
[0108]
表4冻干粉的使用效果测试
[0109][0110]
综上所述，本发明所提供的茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物对snp诱导的huvecs细胞损伤具有保护作用，而且能显著降低snp诱导的huvecs细胞内ros水平、恢复线粒体的膜电位以恢复线粒体的功能，进而减轻氧化应激损伤，表现出较好的临床抗氧化效果。茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物可应用于各种对安全性有更高要求的药品、食品、护肤品中，提高相应产品的抗氧化能力；或单独作为抗氧化剂，用于各种生物实验中。茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物也可作为膳食补充剂用于清除体内多余的自由基、预防或延缓衰老；或作为药品或辅助用药用于治疗与氧化损伤有关的神经退行性疾病、肿瘤或炎症等疾病。
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上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物在(1)～(3)任一种中的应用；(1)制备抗氧化剂；(2)制备抗氧化剂添加剂；(3)制备膳食补充剂；优选地，所述抗氧化添加剂用于制备药品、食品或护肤品。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物的制备方法包括如下步骤：(1)提取：将茶枝柑胎与有机溶剂混合，提取，固液分离，取液体，浓缩得到浸膏a1；(2)萃取：将浸膏a1与水混合，得到混悬液，将混悬液与有机溶剂混合，萃取，取有机溶剂相，即茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤(1)中所述有机溶剂为乙醇。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤(1)中所述提取的方式为煎煮提取、超声辅助提取、回流提取和渗漉提取中的至少一种；优选地，步骤(1)中所述提取的次数为1～6次。5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤(2)中所述浸膏a1与水的质量体积比为1:(0.5～1)。6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤(2)中所述混悬液与所述有机溶剂的体积比为1：(2～5)；优选地，步骤(2)中所述有机溶剂为石油醚、正丁烷、二氯甲烷、正丁醇和乙酸乙酯中的至少一种。7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物的制备方法还包括如下步骤：将有机溶剂相进行浓缩，干燥。8.根据权利要求2～7中任一项所述的应用，其特征在于：所述茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物中多甲氧基黄酮类化合物的含量大于50％。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述多甲氧基黄酮类化合物包括异橙黄酮、5-羟基-6,7,8,4'-四甲氧基黄酮、川陈皮素、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮、橘皮素和5-羟基-6,7,8,3'-4'-五甲氧基黄酮。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述异橙黄酮、5-羟基-6,7,8,4'-四甲氧基黄酮、川陈皮素、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮、橘皮素和5-羟基-6,7,8,3'-4'-五甲氧基黄酮的质量比为(0.5～1.5)：(2.5～4)：(24～30)：(0.5～1)：(16～20)：(2.5～4)。

技术总结
本发明属于植物有效成分提取及应用技术领域，公开了茶枝柑胎多甲氧基黄酮类化合物在制备抗氧化剂中的应用。茶枝柑胎多甲氧基黄酮提取物对细胞氧化损伤具有保护作用，而且能显著降低细胞内ROS水平、恢复线粒体的膜电位以恢复线粒体的功能，进而减轻氧化应激损伤，表现出较好的临床抗氧化效果，可应用于各种对安全性有更高要求的药品、食品、护肤品中，提高相应产品的抗氧化能力；或单独作为抗氧化剂；也可作为膳食补充剂用于清除体内多余的自由基、预防或延缓衰老；或作为药品或辅助用药用于治疗与氧化损伤有关的神经退行性疾病、肿瘤或炎症等疾病。症等疾病。


技术研发人员：杨得坡 张荣菲 梅振英 赵志敏 刘鄂湖
受保护的技术使用者：中国药科大学
技术研发日：2021.11.04
技术公布日：2022/3/7