一种基于ZmEMF2b2-2基因创制玉米矮化材料的方法

一种基于zmemf2b/2-2基因创制玉米矮化材料的方法
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及一种利用基因编辑技术基于zmemf2b/2-2基因创制玉米矮化材料的方法。


背景技术：

2.二十世纪玉米产量的提高主要依赖提高单位面积内玉米的种植密度，但是密度过高随之而来的就是倒伏的风险，可能会降低产量，因此在一定程度上降低玉米株高有助于提高玉米产量。上世纪60年代末，闻名于世的“绿色革命”掀起了半矮化植株可以提高产量的狂潮。在“绿色革命”期间成功创制了半矮化水稻和小麦的高产品种。在过去的几十年中许多玉米矮化突变体被鉴定，但没有完全应用到玉米育种中。
3.传统矮杆玉米的创制主要是通过回交转育的方法，往往需要经过6个回交世代，不仅耗时长，同时经常伴随基因冗余，导致一些非目标性状的导入，限制了改良材料的应用效果。
4.进化上保守的多梳组(pcg)蛋白形成多亚基多梳抑制复合物(prcs)，通过染色质凝聚抑制基因表达。在拟南芥中，已经鉴定出三个不同的prc2s，每个prc2s都决定了一个具有部分功能冗余的特定发育程序。zmemf2b/2-2(grmzm2g058158)是玉米prc2s家族的一个典型基因。
5.因此，提供一种基于zmemf2b/2-2基因创制玉米矮化材料的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明提供了一种基于zmemf2b/2-2基因创制玉米矮化材料的方法。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.一种基于zmemf2b/2-2基因创制玉米矮化材料的方法，具体步骤如下：
9.(1)针对基因zmemf2b/2-2设计基于crispr/cas9的sgrna作用位点；
10.所述sgrna作用位点的核苷酸序列为：
[0011]5’‑
gccctactgaatcgatatatcgg-3’；seq id no.3；和
[0012]5’‑
ggctaataaatataatgttaagg-3’；seq id no.4；
[0013]
(2)以pcbc-mt1t2质粒为模板，mt1t2-f，mt1t2-f0，mt2t2-r0，mt2t2-r为引物，pcr扩增目的片段；
[0014]
所述引物序列如下：
[0015]
mt1t2-f：5
’‑
aataatggtctcaggcgccctactgaatcgatatat-3’；seq id no.5；
[0016]
mt1t2-f0：5
’‑
gccctactgaatcgatatatgttttagagctagaaatagc-3’；seq id no.6；
[0017]
mt1t2-r0：5
’‑
taacattatatttattagccgcttcttggtgcc-3’；seq id no.7；
[0018]
mt1t2-r：5
’‑
attattggtctctaaactaacattatatttattagc-3’；seq id no.8；
[0019]
所述pcr反应体系为：pcbc-mt1t2质粒1μl，mt1t2-f 0.5μl，mt1t2-f00.5μl，
mt1t2-r00.5μl，mt1t2-r 0.5μl，2
×
mix 10μl，ddh2o 7μl；pcr扩增反应程序为：98℃3min；98℃30s，57℃30s，72℃1min，35个循环；72℃5min，4℃∞。
[0020]
(3)将步骤(2)获得的目的片段与载体pbue411进行酶切连接，构建得到zmemf2b/2-2基因编辑载体pbue411-2gr-zmemf2b/2-2；
[0021]
所述酶切连接反应体系如下：目的片段2μl，pbue4112μl，10xneb t4buffer 1.5μl，10xbsa 1.5μl，bsai 1μl，t4 ligase 1μl，ddh2o 6μl，total 15μl；
[0022]
(4)将步骤(3)获得的基因编辑载体pbue411-2gr-zmemf2b/2-2转入农杆菌lba4404，进行玉米遗传转化，经筛选鉴定获得玉米矮化材料。
[0023]
将两个sgrna作用位点通过不同表达盒串联到同一基因编辑载体上。
[0024]
携带cas9的载体为pbue411。
[0025]
所述玉米为自交系c01。
[0026]
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种利用基因编辑技术基于zmemf2b/2-2基因创制玉米矮化材料的方法，基因编辑技术能精准对目的基因进行编辑，并且没有外缘基因的导入，本发明通过基因编辑技术精准敲除zmemf2b/2-2基因，可以精准降低玉米株高，并且不改变其它农艺性状。
[0027]
本发明首次揭示了玉米zmemf2b/2-2基因的生物学功能，通过crispr/cas9技术对玉米zmemf2b/2-2基因进行基因编辑，并进一步筛选获得含目的基因片段缺失的突变体材料，这些玉米矮化材料具有重要的育种价值。本发明创制的玉米矮化材料属于高度矮化材料，节间发育变短但正常结实，通过合理的栽培管理措施可以应用于杂交玉米生产。
附图说明
[0028]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0029]
图1附图为本发明测序比对结果；
[0030]
图2附图为本发明突变体株系；
[0031]
其中，a为野生型玉米植株；b为突变体玉米植株。
具体实施方式
[0032]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0033]
本发明利用基因编辑技术创制玉米矮化材料，针对玉米中的目标基因zmemf2b/2-2设计基于crispr/cas9的sgrna序列，将含有编码所述sgrna序列的dna片段连接到携带cas9的载体中，用构建的载体转化玉米(如农杆菌介导法)，实现对基因zmemf2b/2-2的定点突变，进而获得zmemf2b/2-2基因功能缺失的玉米植株。
[0034]
实施例1
[0035]
(1)控制玉米株高的基因为zmemf2b/2-2基因，其核苷酸序列如下：
[0036]
atgtgccttcaacactctagggctcgattgtctccagatgagcaacttgctgcagaaaaaagttttgccttgtattgcaagccagttgaattgtacaatattatccagaggcgagctattaaaaatccaccttttgttcaaagatcccttctttataagatacaggcaaggagaaaaaagaggattcagataactgtatcactttctgcaagtacaaatacacaagcacagaatatctttcccctttatgtacttttagctagacctaccagtaatatttcgcttgaggggcattctccgatatatcgattcagtagggcttgtttgcttacaaattttagtgaatttggaaataaagacaaaactgaagccacattcatcatccctgatgtgaagaatttatcaacctcccgtgcttgcaaccttaacattatatttattagccgtggtaagatgtgcattttatggcaagtaggacaaattattggtgaagatagctgttccgggaatgatgtggaaggatcttccctccaaaagcttgaagggaaatgttcctggggtaaaatgccgactaatttacttgcgccctctttggagaaatgtgtgactttaagtacaggaaatgctgtggatttgacttctacagttacaatgaacccaagcttcttagagccaaaatttctggaacaagacagttgcttgacattttgctctcataaggttgatgctacgggttcataccaattacaagtatgcatatccgcagaagaggctggcgcaagagaattacttttatctccttattattgcaattactcatataataatgtcccaccttctctattaccagaaatcataaggttgagagctggaaatgtactttttaattacaagtactacaacaatacaatgcaaaagactgaagttactgaagatttttcctgcccattttgcttggtaccatgtggaagcttcaagggcctaggatgccacttaaattcatcacatgacctgttccactatgagttgtggatatctgaagagtgccaggctgtgaatgttagtctgaaggctgatgcctggaaaactgagtttgtggcagagggagttgatccaaggcatcaaacattttcctactgctcgaggtttaagaagcgtagaaggttggaaaccacagctgagaaattcaggcatgttcacccacatattatggaatcaggatcacatgaagatgcccaggcagggtctgaagatgactatgtgcaaagggaaaatgggctttctgtagcaaatacttcagttgaccctagtcagcctgtacatgggagcaatctttcaccaccaacagtgctacagtttggaaagtcaagaaaactatctgccgagcgatctgaccccagaaaccgacaactgttgcaaaagcgtcagttcttccattcacacagggcacagccaatgccattggaacaagtcctctcagatcatgatagcgaagacgaggttgatgatgacattgccgactttgaggatagacggatgctcgacgattttgttgatgttacaaaagatgagaagcttattatgcatatgtggaattcatttgttcgaaagcaaagggtgctagccgatggtcatataccgtgggcatgcgaggcgttctccagatgccatggacaacagcttgtacaaaaccctgccctgctgtggggctggcgtttcttcatgattaaactctggaaccacagccttcttgacgcccgcgccatgaatgcttgcaacacaatccttcaaggctaccaagacggaagtgcggaccccaagtaa；seq id no.1。
[0037]
zmemf2b/2-2蛋白的氨基酸序列如下：
[0038]
mclqhsrarlspdeqlaaeksfalyckpvelyniiqrraiknppfvqrsllykiqarrkkriqitvslsastntqaqnifplyvllarptsnisleghspiyrfsraclltnfsefgnkdkteatfiipdvknlstsracnlniifisrgkmcilwqvgqiigedscsgndvegsslqklegkcswgkmptnllapslekcvtlstgnavdltstvtmnpsflepkfleqdscltfcshkvdatgsyqlqvcisaeeagarelllspyycnysynnvppsllpeiirlragnvlfnykyynntmqktevtedfscpfclvpcgsfkglgchlnsshdlfhyelwiseecqavnvslkadawktefvaegvdprhqtfsycsrfkkrrrlettaekfrhvhphimesgshedaqagseddyvqrenglsvantsvdpsqpvhgsnlspptvlqfgksrklsaersdprnrqllqkrqffhshraqpmpleqvlsdhdsedevdddiadfedrrmlddfvdvtkdeklimhmwnsfvrkqrvladghipwaceafsrchgqqlvqnpallwgwrffmiklwnhslldaramnacntilqgyqdgsadpk；seq id no.2。
[0039]
(2)针对基因zmemf2b/2-2，sgrna作用位点的核苷酸序列为:
[0040]5’‑
gccctactgaatcgatatatcgg-3’；seq id no.3；(靶点1)和
[0041]5’‑
ggctaataaatataatgttaagg-3’；seq id no.4；(靶点2)。
[0042]
根据所选的编辑位点以及载体pcbc-mt1t2和pbue411多克隆位点处的酶切位点设计引物，引物序列如下：
[0043]
mt1t2-f：5
’‑
aataatggtctcaggcgccctactgaatcgatatat-3’；seq id no.5；
[0044]
mt1t2-f0：5
’‑
gccctactgaatcgatatatgttttagagctagaaat agc-3’；seq id no.6；
[0045]
mt1t2-r0：5
’‑
taacattatatttattagccgcttcttggtgcc-3’；seq id no.7；
[0046]
mt1t2-r：5
’‑
attattggtctctaaactaacattatatttattagc-3’；seq id no.8。
[0047]
(3)用一轮pcr方法扩增目的片段，pcr反应使用两对引物mt1t2-f，mt1t2-f0，mt2t2-r0，mt2t2-r，以pcbc-mt1t2质粒为模板扩增。
[0048]
pcr扩增反应体系为：pcbc-mt1t2质粒1μl，mt1t2-f 0.5μl，mt1t2-f00.5μl，mt1t2-r00.5μl，mt1t2-r 0.5μl，2
×
mix 10μl，ddh2o 7μl。
[0049]
pcr扩增反应程序为：98℃3min；98℃30s，57℃30s，72℃1min，35个循环；72℃5min，4℃∞。
[0050]
将获得的目的片段与载体pbue411进行酶切连接，反应体系如下：
[0051]
目的片段(964bp)2μl，pbue4112μl，10xneb t4 buffer 1.5μl，10xbsa1.5μl，bsai(neb)1μl，t4 ligase(neb)/高浓度1μl，ddh2o 6μl，total 15μl。
[0052]
反应条件：37℃5h，50℃5min，80℃10min。
[0053]
构建得到zmemf2b/2-2基因编辑载体pbue411-2gr-zmemf2b/2-2。
[0054]
实施例2基因编辑载体转入农杆菌lba4404
[0055]
1)cacl2法制备根癌农杆菌感受态细胞
[0056]
(1)从yep平板(rifr，strr)上挑取新鲜的lba4404单菌落接种于含50mg/l str和25mg/l rif的yep液体培养基中，28℃，220rpm振荡培养过夜24～36h；
[0057]
(2)取2ml过夜活化的对数生长期的菌液，接种于50ml yep液体培养基中，20℃培养菌液od
600
至0.4～0.6左右；
[0058]
(3)将菌液转移到冰预冷的50ml无菌离心管中，冰浴30min，4℃，4,000
×
g离心10min，富集菌体；
[0059]
(4)用10ml冰预冷0.05m cacl2悬浮菌体，冰浴30min，4℃，4,000
×
g离心10min，富集菌体；
[0060]
(5)用1ml冰预冷0.05m cacl2重悬菌体，将制备好的感受态细胞于4℃保存，24～48h内使用转化效率最高，也可按每管100μl分装于无菌管中，加入终浓度20％甘油，并用液氮速冻后置于-80℃保存。
[0061]
2)冻融法转化根癌农杆菌感受态细胞
[0062]
(1)取出农杆菌感受态(200μl)，置于冰上，待刚解冻时加入质粒dna(1μg)，放入液氮中1min，而后放入37℃金属浴中5min；
[0063]
(2)取出离心管，加入1ml yeb液体培养基(不含抗生素)，置于摇床上，28℃，180r/min培养35h；
[0064]
(3)3000rpm离心1min，取出多余上清液，保留100μl，重悬，倒入yeb平板培养基(kan，rif)上，涂抹均匀，在恒温培养箱中28℃培养36-48h；
[0065]
(4)挑取单克隆，检测，保留阳性菌落。利用引物osu3-fd3/tau3-rd进行菌液pcr鉴定。
[0066]
其中，osu3-fd3/tau3-rd引物序列如下：
[0067]
osu3-fd3：5
’‑
gacaggcgtcttctactggtgctac-3’；seq id no.9；
[0068]
tau3-rd：5
’‑
ctcacaaattatcagcacgctagtc-3’；seq id no.10。
[0069]
反应体系：
[0070]
菌液1μl，osu3-fd31μl，tau3-rd 1μl，2
×
mix 10μl，ddh2o 7μl，total 20μl。
[0071]
pcr扩增反应程序为：98℃3min；98℃30s，57℃45s，72℃1min，35个循环；72℃5min，4℃∞。
[0072]
菌落pcr产物大小为831bp。
[0073]
实施例3玉米遗传转化
[0074]
(1)取胚材料为玉米自交系c01，在授粉后第九天开始观察玉米幼胚，待其长到1.5mm左右时，将果穗取回实验室进行取胚工作。
[0075]
(2)准备农杆菌侵染液，经过活化的农杆菌在yeb液体培养基中摇菌至特定浓度时(od
550
＝0.5)，低速离心收集菌体沉淀，然后用inf(每升组成：n6盐和维生素(sigma)2克，蔗糖68.5克，葡萄糖36克，l-proline 0.7克，mes 0.5g，1mg/ml 2,4-d 1.5ml)+as(acetosyringone，(100mm)，1ml))液体培养基重悬，25℃75r/min摇菌24h，至浓度为od
550
＝0.3-0.4即可。
[0076]
(3)将(1)中取出的幼胚用inf+as(同上)液体培养基洗涤2次，然后加入农杆菌侵染液，侵染20min-30min。
[0077]
(4)将侵染过后的幼胚转移到共培养培养基(每升组成：n6盐和维生素4克，蔗糖40克，葡萄糖30克，l-proline 0.7克，mes 0.5g，1mg/ml 2,4-d 1.5ml，琼脂糖(低eeo)5g，8.5mg/ml硝酸银0.1ml，100mg/ml l-半胱氨酸0.4g，0.5m/l dtt 0.154g)中，幼胚的盾片朝上，胚轴与培养基表面接触，用封口膜封住培养皿，在20℃培养箱中暗培养3天。
[0078]
(5)把幼胚从共培养培养基转移到静息培养基(每升组成：n6盐和维生素4克，蔗糖40克，葡萄糖30克，l-proline 0.7克，mes 0.5g，1mg/ml 2,4-d 1.5ml，8.5mg/ml硝酸银0.1ml，100mg/ml l-半胱氨酸0.4g，0.5m/l dtt0.154g，timentin(蒂门汀，sigma)100mg)中，用封口膜封住培养皿，放在28℃条件下暗培养7天。
[0079]
(6)再将所有的幼胚转移到选择培养基ⅰ(每升组成：n6盐和维生素4克，蔗糖40克，葡萄糖30克，l-proline 0.7克，mes 0.5g，1mg/ml 2,4-d 1.5ml，8.5mg/ml硝酸银0.1ml，100mg/ml l-半胱氨酸0.4g，0.5m/l dtt 0.154g，timentin 100mg，3mg/ml bialaphos 0.5ml)上，28℃暗培养两周。
[0080]
(7)将所有的幼胚转移到选择培养基ⅱ(每升组成：n6盐和维生素4克，蔗糖40克，葡萄糖30克，l-proline 0.7克，mes 0.5g，1mg/ml 2,4-d 1.5ml，8.5mg/ml硝酸银0.1ml，100mg/ml l-半胱氨酸0.4g，0.5m/l dtt 0.154g，timentin 100mg，3mg/ml bialaphos 1ml)上，此时可以进行挑选，挑选颜色鲜艳的幼胚28℃暗培养两周。
[0081]
(8)经过两次选择之后，开始进行再生，在再生培养基i(每升组成：ms(murashige and skoog)盐(sigma)4.3g，蔗糖60g，凝胶2.5克，2mg/ml甘氨酸1ml，timentin 100mg)中进行发芽生根，待见到明显叶片及根生长出来时转移到再生培养基ⅱ(每升组成：ms salts 2.9g，蔗糖30g，凝胶2.5g，2mg/ml甘氨酸1ml，timentin 100mg)上。从此步骤开始，进行光照培养。
[0082]
(9)待再生苗长出3-4片叶时，将其转移至温室，并进行检查，阳性植株保留，缓苗2-3天后转移到土中，而后进行正常的玉米生长管理，开花一周后进行株高测量。
[0083]
实施例4发生编辑的转基因玉米植株的鉴定
[0084]
转移到土中一周后，进行草铵膦筛选，经过草铵膦筛选后成活的玉米叶片采用ctab法提取dna，用zmemf2b/2-2基因特异性引物进行pcr鉴定，扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。
[0085]
zmemf2b/2-2基因特异性引物序列如下：
[0086]
zmemf2b/2-2-crispr-f1：5
’‑
ttgctctgaatgcccaac-3’；seq id no.11；
[0087]
zmemf2b/2-2-crispr-r1：5
’‑
ggtggaaaggacaaatacacac-3’；seq id no.12；
[0088]
反应体系为：
[0089]
dna 1μl，zmemf2b/2-2-crispr-f11μl，zmemf2b/2-2-crispr-r11μl，2
×
mix 10μl，ddh2o 7μl，total 20μl。
[0090]
反应程序为：94℃5min；98℃30s，58℃30s，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min，4℃∞。
[0091]
引物对(zmemf2b/2-2-crispr-f1/r1)用于扩增靶点1、靶点2突变，产物大小约为0.75kb；将扩增产物条带大小正确的pcr产物送去测序，测序结果(zmemf2b2-2mt)与野生型(zmemf2b2-2wt)进行比对，结果见图1(仅显示突变位点)。筛选到1个zmemf2b/2-2基因编辑的突变体株系(图2，b)。发生编辑的纯合突变体材料明显比野生型玉米(图2，a)植株矮。这个玉米矮化材料具有重要的育种价值。
[0092]
对野生型(zmemf2b2-2wt)和突变体(zmemf2b2-2mt)株系的株高进行统计，野生型植株平均株高为213.7cm，突变体株系平均株高为189.7cm，二者差异显著。
[0093]
本发明提供一种创制玉米矮化材料的方法，按照上述方法制备目的基因编辑的玉米植株，然后基因编辑玉米植株进行杂交、回交、自交或无性繁殖，从而创制玉米矮化材料。
[0094]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

技术特征：
1.一种基于zmemf2b/2-2基因创制玉米矮化材料的方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)针对基因zmemf2b/2-2设计基于crispr/cas9的sgrna作用位点；所述sgrna作用位点的核苷酸序列为：5
’‑
gccctactgaatcgatatatcgg-3’；seq id no.3；和5
’‑
ggctaataaatataatgttaagg-3’；seq id no.4；(2)以pcbc-mt1t2质粒为模板，mt1t2-f，mt1t2-f0，mt2t2-r0，mt2t2-r为引物，pcr扩增目的片段；所述引物序列如下：mt1t2-f：5
’‑
aataatggtctcaggcgccctactgaatcgatatat-3’；seq id no.5；mt1t2-f0：5
’‑
gccctactgaatcgatatatgttttagagctagaaatagc-3’；seq id no.6；mt1t2-r0：5
’‑
taacattatatttattagccgcttcttggtgcc-3’；seq id no.7；mt1t2-r：5
’‑
attattggtctctaaactaacattatatttattagc-3’；seq id no.8；(3)将步骤(2)获得的目的片段与载体pbue411进行酶切连接，构建得到zmemf2b/2-2基因编辑载体pbue411-2gr-zmemf2b/2-2；所述酶切连接反应体系如下：目的片段2μl，pbue411 2μl，10xneb t4 buffer 1.5μl，10xbsa 1.5μl，bsai 1μl，t4 ligase 1μl，ddh2o 6μl，total 15μl；(4)将步骤(3)获得的基因编辑载体pbue411-2gr-zmemf2b/2-2转入农杆菌lba4404，进行玉米遗传转化，经筛选鉴定获得玉米矮化材料。2.根据权利要求1所述的一种基于zmemf2b/2-2基因创制玉米矮化材料的方法，其特征在于，步骤(2)所述pcr反应体系为：pcbc-mt1t2质粒1μl，mt1t2-f 0.5μl，mt1t2-f0 0.5μl，mt1t2-r0 0.5μl，mt1t2-r 0.5μl，2
×
mix 10μl，ddh2o 7μl；pcr扩增反应程序为：98℃3min；98℃30s，57℃30s，72℃1min，35个循环；72℃5min，4℃∞。

技术总结
本发明公开了一种基于ZmEMF2b/2-2基因创制玉米矮化材料的方法，属于基因工程技术领域。本发明公开的一种基于ZmEMF2b/2-2基因创制玉米矮化材料的方法，通过CRISPR/Cas9技术对玉米ZmEMF2b/2-2基因进行基因编辑，并进一步筛选获得含目的基因缺失片段的突变体材料，这些玉米矮化材料具有重要的育种价值。这些玉米矮化材料具有重要的育种价值。这些玉米矮化材料具有重要的育种价值。


技术研发人员：宋广树 吕庆雪 普莉 周德龙 高嵩
受保护的技术使用者：吉林省农业科学院
技术研发日：2021.11.24
技术公布日：2022/3/7