贝母类药材或制剂中异甾体生物碱含量的测定方法

1.本发明属于中药材技术领域，更具体地说，本发明涉及一种基于紫外-可见分光光度法对贝母类药材或制剂中异甾体生物碱含量进行测定的方法，以及该测定方法在贝母类药材或制剂质量监控中的应用。


背景技术：

2.贝母为百合科(liliaceae)贝母属(fritillaria)多年生草本植物，其鳞茎供药用，是我国重要的中药材之一，具有清热润肺、化痰止咳的功效。该属植物种类繁多，全世界约130种，主要分布于北半球温带地区，特别是亚洲东部和中部、地中海区域、北美洲等地。《中国贝母属植物研究》认为中国贝母属植物主要种类约34种。除南方几个省以外，我国大多数地区都有分布。贝母的主要有效成分为生物碱类和皂苷类，生物碱是该属植物专属性较强的有效成分。
3.《中国药典》2010版一部中收载了川贝母、浙贝母、湖北贝母、伊贝母和平贝母五种贝母。其来源及含量测定成分归纳如下：
4.1、浙贝母：浙贝母fritillaria thunbergii miq.干燥鳞茎。(含量测定：贝母素甲和贝母素乙)
5.2、伊贝母：新疆贝母fritillaria walujewii regel或伊犁贝母fritillaria pallidiflora schrenk的干燥鳞茎，主产于新疆地区。(含量测定：西贝母碱苷和西贝母碱)
6.3、平贝母：平贝母fritillaria ussuriensis maxim.的干燥鳞茎。(含量测定：贝母素乙)
7.4、湖北贝母：湖北贝母fritillaria hupehensis的干燥鳞茎。(含量测定：贝母素乙)
8.5、川贝母：川贝母fritillaria cirrhosa d.don、暗紫贝母fritillaria unibracteata hsiaoetk.c.hsia、甘肃贝母fritillaria przewalskii maxim.、梭砂贝母fritillaria delavayi franch.、太白贝母fritillaria taipaiensis p.y.li或瓦布贝母fritillaria unibracteata的干燥鳞茎，分布于四川西部高山(原)及相邻地区。(含量测定：西贝母碱)
9.综上可知，西贝母碱为川贝母及伊贝母的含量测定成分，说明在二者中的含量较高，为主要药效成分。
10.西贝母碱属于贝母总生物碱中异甾体类生物碱中的其中一种，异甾体类生物碱在结构上无共轭双键，紫外吸收弱，因此传统的紫外-可见分光光度法不能用于测定异甾体类生物碱的含量。目前关于贝母总生物碱的异甾体类生物碱含量的主要测定方法有毛细管电泳法、薄层色谱扫描法、柱前衍生气相色谱法、液相蒸发光散射器法、两相滴定法、高效液相色谱法等，但是这些方法都存在不少缺点，如毛细管电泳法存在重现性差、线性范围窄和灵敏度较低等缺陷；薄层色谱扫描法对伊贝母中贝母素甲的含量测定，操作繁琐，外界因素对测定结果影响较大，特别是显色时间方面难把握，重现性不好；柱前衍生气相色谱法对贝母
素甲、贝母素乙进行定量，存在前处理步骤多，排除干扰困难等不足之处；液相蒸发光散射检测器法的灵敏度偏低，导致有效成分含量低的样品无法检测；两相滴定法、高效液相色谱，样品处理过程及操作复杂，难以实现快速检测。
11.也有一些对紫外法测定贝母总生物碱含量的研究，如“无紫外吸收的贝母总生物碱定量分析方法研究(李萍、曾令杰、李松林，中国药学志，2002，37(8))”、“中药贝母类的研究xv-21中贝母总生物碱含量测定(李萍、徐国钧、金蓉鸯、徐路珊，中国药科大学学报，1990，21(5))”、“不同产地浙贝母总生物碱的含量测定(马卫成，盛振华，戎建辉，中华中医药学刊，2009，27(7))”，上述文献均采用酸性染料比色法测定贝母药材中贝母碱的含量，即酸性染料解离为阴离子(in-)，而贝母生物碱与氢离子生成盐(bh
+
)，二者结合成配位化合物，即离子对，然后采用紫外法进行测定。该方法前处理复杂，需要经过氯仿萃取，且测定结果准确度偏低。
12.因此，有必要提供一种更方便，更快速，更灵敏，更准确的紫外-可见分光光度法，用于对贝母类药材或制剂中异甾体生物碱含量进行测定。


技术实现要素：

13.基于此，本发明的目的之一是提供一种测定贝母类药材或制剂中异甾体生物碱含量的方法，该方法采用紫外-可见分光光度法测定贝母类药材或制剂中异甾体生物碱的含量，更为方便、快速、灵敏、准确。
14.实现上述发明目的的具体技术方案如下：
15.一种测定贝母类药材或制剂中异甾体生物碱含量的方法，包括以下步骤：
16.(1)、在贝母类药材或制剂中，加入90％～95％的乙醇，70℃～90℃恒温回流5h～6h，重复2次～3次，抽滤，合并滤液，减压回收，得到稠浸膏；加入蒸馏水使稠浸膏悬浮，调节ph9～ph10；再用乙酸乙酯萃取2次～3次，合并萃取液，真空浓缩得到浸膏，用甲醇溶解浸膏，即得待测样品溶液；
17.(2)、将步骤(1)的待测样品溶液，与柚皮苷对照品溶液混合，得到待测混合液；所述待测混合液中柚皮苷对照品的浓度为28mg/ml～32mg/ml；
18.(3)、将异甾体生物碱对照品溶液和柚皮苷对照品溶液混合，以甲醇进行稀释，配制系列对照品混合液，测定系列对照品混合液在656.5nm
±
2nm波长的吸光度，绘制标准曲线；所述系列对照品混合液中柚皮苷对照品的浓度均为28mg/ml～32mg/ml；
19.(4)、精密吸取步骤(2)中待测混合液，测定其在656.5nm
±
2nm波长的吸光度；根据步骤(3)的标准曲线，计算贝母类药材或制剂中异甾体生物碱的含量。
20.在其中一些实施例中，所述异甾体生物碱为西贝母碱。
21.在其中一些实施例中，步骤(3)和步骤(4)中所述测定波长为656.5nm
±
0.5nm。
22.在其中一些实施例中，步骤(2)所述待测混合液中柚皮苷对照品的浓度为30mg/ml
±
0.05mg/ml。
23.在其中一些实施例中，步骤(3)所述系列对照品混合液中柚皮苷对照品的浓度均为30mg/ml
±
0.05mg/ml。
24.在其中一些实施例中，步骤(2)中所述待测混合液是以甲醇进行稀释配制而得的。
25.在其中一些实施例中，步骤(3)中所述标准曲线为y＝0.0494x+0.0283。
26.在其中一些实施例中，步骤(3)中所述标准曲线的绘制方法，包括以下步骤：
27.(1)、精密吸取柚皮苷对照品溶液储备液和西贝母碱对照品溶液储备液，进行混合，并用甲醇进行稀释，得到系列混合对照品溶液，所述系列混合对照品溶液中，柚皮苷对照品的浓度均为30mg/ml，西贝母碱对照品的浓度分别为4mg/ml、8mg/ml、12mg/ml、16mg/ml、20mg/ml、24mg/ml；
28.(2)、精密吸取2ml系列混合对照品溶液，采用紫外-可见分光光度法，分别测定系列混合对照品溶液在656.5nm的吸光度；
29.(3)、以西贝母碱对照品溶液的浓度为x，以吸光度为y进行线性拟合，拟合得到标准曲线。
30.在其中一些实施例中，所述步骤(1)中贝母类药材为川贝母或伊贝母。
31.本发明还提供了上述测定方法在贝母类药材或制剂质量监控中的应用。
32.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
33.(1)、本发明的发明人在实际研究中发现：西贝母碱对照品溶液与柚皮苷对照品溶液混合后，颜色会加深，将混合溶液放置于紫外-可见分光光度计上进行全扫描，在656.5nm有最大吸收峰，由于柚皮苷本身的最大吸收波长是284nm，而西贝母碱无紫外吸收，说明656.5nm的吸收峰是由两者混合产生的。在此研究的基础上，发明人对柚皮苷对照品的浓度进行了筛选和优化，当待测样品溶液与一定浓度的柚皮苷对照品溶液进行混合后，可以使用紫外-可见分光光度法测定待测样品溶液中西贝母碱的含量。
34.(2)、本发明的方法除了可以用于贝母类药材和制剂中西贝母碱的含量测定外，还可以用于贝母类药材和制剂中的其他异甾体生物碱的含量测定，能够更加简便、快捷、迅速、准确地测定出原材料或制剂中异甾体生物碱的含量，有利于对贝母类药材和制剂进行质量监控。
附图说明
35.图1为西贝母碱对照品溶液与柚皮苷对照品溶液混合后，紫外-可见分光光度计进行全扫描的图谱。
36.图2为本发明实施例1中西贝母碱含量测定的标准曲线，其中横轴为西贝母碱的浓度，单位为mg/ml，纵轴为吸光度。
具体实施方式
37.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
38.除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
39.将西贝母碱对照品溶液与柚皮苷对照品溶液混合(混合液中西贝母碱对照品的浓度分别为4mg/ml、8mg/ml、12mg/ml、16mg/ml、20mg/ml、24mg/ml，柚皮苷对照品的浓度为
30mg/ml)后，颜色会加深，将混合液放置于紫外-可见分光光度计上进行全扫描，得到的图谱如图1所示。从图1可以看出，含有不同浓度的西贝母碱对照品和30mg/ml的柚皮苷对照品的混合液，最大吸收峰都在656.5nm处。由于柚皮苷本身的最大吸收波长是284nm，而西贝母碱无紫外吸收，说明656.5nm的吸收峰是由两者混合产生的。因此，可以使用紫外-可见分光光度法测定贝母类药材和制剂中西贝母碱的含量；理论上还可以用于贝母类药材和制剂中的其他异甾体生物碱的含量测定。
40.以下结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的说明。
41.实施例1测定伊贝母中西贝母碱含量的方法
42.该实施例采用紫外-可见分光光度法测定伊贝母中西贝母碱的含量，包括以下步骤：
43.(1)、待测样品溶液的制备
44.取10g伊贝母药材(市售)置于圆底烧瓶中，加入95％乙醇500ml，于80℃恒温水浴锅中回流提取6h，提取3次，抽滤，合并滤液，减压回收乙醇，得稠浸膏，加入2ml蒸馏水悬浮所述稠浸膏，加入1mol/l的naoh调至ph10，然后用乙酸乙酯萃取3次，将萃取液合并，真空浓缩得到浸膏，用10ml甲醇溶解浸膏，即得待测样品溶液；
45.(2)、精密吸取1ml步骤(1)的待测样品溶液，与0.6ml柚皮苷对照品溶液混合，用甲醇定容至2ml，得到待测混合液；所述待测混合液中柚皮苷对照品的浓度为30mg/ml；
46.(3)、标准曲线的绘制
47.以甲醇为溶剂，配制浓度为100mg/ml的柚皮苷对照品溶液和浓度为1000mg/ml的西贝母碱对照品溶液，作为对照品溶液储备液(柚皮苷对照品和西贝母碱对照品均购买中国食品药品检定研究院)。
48.精密吸取0.6ml柚皮苷对照品溶液和0.008ml西贝母碱对照品溶液，混合，用甲醇定容至2ml；精密吸取0.6ml柚皮苷对照品溶液和0.016ml西贝母碱对照品溶液，混合，用甲醇定容至2ml
……
，如此配制成表1所示的系列混合对照品溶液。
49.精密吸取系列混合对照品溶液，采用紫外-可见分光光度计，分别测定系列混合对照品溶液在656.5nm的吸光度，系列对照品溶液浓度和吸光度见表1。
50.表1系列对照品溶液的浓度和吸光度
[0051][0052]
以西贝母碱对照品溶液的浓度为x，以吸光度为y进行线性拟合，拟合得到的标准
曲线如图2所示。标准曲线为y＝0.0494x+0.0283，r2＝0.9957，线性良好。
[0053]
(4)、精密吸取2ml步骤(2)所述待测混合液，测定待测混合液在656.5nm的吸光度为0.4127、0.4128，根据步骤(3)的标准曲线，计算10g伊贝母药材中西贝母碱的含量为156mg(测定两次取平均值)。
[0054]
实施例2测定川贝雪梨膏中西贝母碱含量的方法
[0055]
该实施例采用紫外-可见分光光度法测定川贝雪梨膏中西贝母碱的含量，包括以下步骤：
[0056]
(1)、待测样品溶液的制备
[0057]
取50g川贝雪梨膏(市售)置于圆底烧瓶中，加入90％乙醇500ml，于90℃恒温水浴锅中回流提取6h，提取2次，抽滤，合并滤液，减压回收乙醇，得稠浸膏，加入2ml蒸馏水悬浮所述稠浸膏，加入1mol/l的naoh调至ph9，然后用乙酸乙酯萃取3次，将萃取液合并，真空浓缩得到浸膏，用10ml甲醇溶解浸膏，即得待测样品溶液；
[0058]
(2)、精密吸取1ml步骤(1)的待测样品溶液，与0.6ml柚皮苷对照品溶液混合，用甲醇定容至2ml，得到待测混合液；所述待测混合液中柚皮苷对照品的浓度为30mg/ml；
[0059]
(3)、标准曲线的绘制
[0060]
同实施例1。
[0061]
(4)、精密吸取2ml步骤(2)所述待测混合液，测定待测混合液在656.5nm的吸光度为0.2116、0.2117；根据步骤(3)的标准曲线，计算50g贝母雪梨膏中西贝母碱的含量为74.4mg(测定两次取平均值)。
[0062]
实施例3本发明方法的精密度试验
[0063]
吸取2ml表1中序号4的混合对照品溶液(即：柚皮苷30mg/ml，西贝母碱16mg/ml)，连续6次在656.5nm波长处测定其吸光度值，吸光度分别为：0.801、0.801、0.800、0.802、0.802、0.801，rsd＝0.09％(n＝6)。表明本发明方法的精密度良好。
[0064]
实施例4本发明方法中对照品的稳定性试验
[0065]
吸取2ml表1中序号4的混合对照品溶液(即：柚皮苷30mg/ml，西贝母碱16mg/ml)，分别在0，1，2，4，8，12小时，在656.5nm波长处测定其吸光度值，吸光度分别为：0.802、0.801、0.801、0.800、0.798、0.788，rsd＝0.65％。表明本发明方法中使用的对照品溶液在12小时内是稳定的。
[0066]
实施例5本发明方法的重复性试验
[0067]
准备5份同一厂家来源的伊贝母药材，每份10g，按实施例1的方法配制待测混合液，分别在656.5nm波长处测定其吸光度值，吸光度分别为：0.432、0.435、0.416、0.427、0.439、0.428，rsd＝1.86％，表明本发明方法的样品重复性较好。
[0068]
实施例6本发明方法的加样回收率试验
[0069]
加样回收率测试方法，包括如下步骤：
[0070]
(1)、取已测知西贝母碱含量(按实施例1方法测定)的伊贝母药材10g置于圆底烧瓶中，加入95％乙醇500ml，于80℃恒温水浴锅中回流提取6h，提取3次，抽滤，合并滤液，减压回收乙醇，稠浸膏，加入2ml蒸馏水悬浮所述稠浸膏，加入1mol/l的naoh调至ph10，然后用乙酸乙酯萃取3次，将萃取液合并，真空浓缩得到异甾体生物碱浸膏，用10ml甲醇溶解异甾体生物碱浸膏，再加入100mg/ml的西贝母碱对照品溶液0.3ml，即得待测样品溶液，平行制
备六份。
[0071]
(2)、精密吸取1ml步骤(1)的待测样品溶液，与0.6ml柚皮苷对照品溶液混合，用甲醇定容至2ml，得到待测混合液；所述待测混合液中柚皮苷对照品的浓度为30mg/ml；
[0072]
(3)、精密吸取2ml待测混合液，测定待测混合液在656.5nm的吸光度；根据标准曲线，计算6份待测混合液中西贝母碱的含量，以测定加样回收率。
[0073]
表2回收率测定结果
[0074][0075]
结果见表2。表2结果表明，西贝母碱的平均回收率为99.71％，rsd值为0.81％，表明本发明方法的准确度较好。
[0076]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0077]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.一种测定贝母类药材或制剂中异甾体生物碱含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、在贝母类药材或制剂中，加入90％～95％的乙醇，70℃～90℃恒温回流5h～6h，重复2次～3次，抽滤，合并滤液，减压回收，得到稠浸膏；加入蒸馏水使稠浸膏悬浮，调节ph9～ph10；再用乙酸乙酯萃取2次～3次，合并萃取液，真空浓缩得到浸膏，用甲醇溶解浸膏，即得待测样品溶液；(2)、将步骤(1)的待测样品溶液，与柚皮苷对照品溶液混合，得到待测混合液；所述待测混合液中柚皮苷对照品的浓度为28mg/ml～32mg/ml；(3)、将异甾体生物碱对照品溶液和柚皮苷对照品溶液混合，以甲醇进行稀释，配制系列对照品混合液，测定系列对照品混合液在656.5nm
±
2nm波长的吸光度，绘制标准曲线；所述系列对照品混合液中柚皮苷对照品的浓度均为28mg/ml～32mg/ml；(4)、精密吸取步骤(2)中所述待测混合液，测定其在656.5nm
±
2nm波长的吸光度；根据步骤(3)的标准曲线，计算贝母类药材或制剂中异甾体生物碱的含量。2.根据权利要求1所述的测定贝母类药材或制剂中异甾体生物碱含量的方法，其特征在于，所述异甾体生物碱为西贝母碱。3.根据权利要求2所述的测定贝母类药材或制剂中异甾体生物碱含量的方法，其特征在于，步骤(3)和步骤(4)中所述测定波长为656.5nm
±
0.5nm。4.根据权利要求2所述的测定贝母类药材或制剂中异甾体生物碱含量的方法，其特征在于，步骤(2)所述待测混合液中柚皮苷对照品的浓度为30mg/ml
±
0.05mg/ml。5.根据权利要求2所述的测定贝母类药材或制剂中异甾体生物碱含量的方法，其特征在于，步骤(3)所述系列对照品混合液中柚皮苷对照品的浓度均为30mg/ml
±
0.05mg/ml。6.根据权利要求2所述的测定贝母类药材或制剂中异甾体生物碱含量的方法，其特征在于，步骤(2)中所述待测混合液是以甲醇进行稀释配制得到的。7.根据权利要求2所述的测定贝母类药材或制剂中异甾体生物碱含量的方法，其特征在于，步骤(3)中所述标准曲线为y＝0.0494x+0.0283。8.根据权利要求7所述的测定贝母类药材或制剂中异甾体生物碱含量的方法，其特征在于，所述标准曲线的绘制方法，包括以下步骤：(1)、精密吸取柚皮苷对照品溶液储备液和西贝母碱对照品溶液储备液，进行混合，并用甲醇进行稀释，得到系列混合对照品溶液，所述系列混合对照品溶液中，柚皮苷对照品的浓度为30mg/ml，西贝母碱对照品的浓度分别为4mg/ml、8mg/ml、12mg/ml、16mg/ml、20mg/ml、24mg/ml；(2)、精密吸取2ml系列混合对照品溶液，分别测定系列混合对照品溶液在656.5nm的吸光度；(3)、以西贝母碱对照品溶液的浓度为x，以吸光度为y进行线性拟合，得到标准曲线。9.根据权利要求1～8任一项所述的测定贝母类药材或制剂中异甾体生物碱含量的方法，其特征在于，所述步骤(1)中贝母类药材为川贝母或伊贝母。10.权利要求1～9任一项所述的测定方法在贝母类药材或制剂质量监控中的应用。

技术总结
本发明公开了一种测定贝母类药材或制剂中异甾体生物碱含量的方法，其是在贝母类药材或制剂中，加入乙醇恒温回流，抽滤，减压回收，得到稠浸膏；加入蒸馏水使稠浸膏悬浮，用乙酸乙酯萃取，真空浓缩得到浸膏，用甲醇溶解浸膏，即得待测样品溶液；将待测样品溶液，与28mg/ml～32mg/ml柚皮苷对照品溶液混合，得到待测混合液；测定待测混合液在656.5nm


技术研发人员：焦豪妍 汤庆发 刘浩 薛雪
受保护的技术使用者：广东食品药品职业学院
技术研发日：2021.11.24
技术公布日：2022/3/7