与西瓜果皮蜡粉紧密连锁的InDel分子标记、其引物及应用

与西瓜果皮蜡粉紧密连锁的indel分子标记、其引物及应用
技术领域
1.本发明涉及分子辅助育种技术领域，具体涉及一种西瓜果皮蜡粉性状紧密连锁的indel分子标记、其引物及应用。


背景技术：

2.西瓜（citrullus lanatus (thunb.) matsum. et nakai）为一年生蔓生藤本植物。中国是世界上最大的西瓜产地，品种甚多，外果皮、果肉及种子形式多样，是深受人们喜爱的水果。
3.蜡粉又称蜡质、蜡被，是植物抵御外界胁迫的第一层保护性屏障。市场上生产销售的大部分西瓜主栽品种的果皮表皮上所附着的一层白色粉末状物质即为蜡粉。研究西瓜果皮蜡粉的遗传规律，进行果皮蜡粉qtl定位分析，对于明确西瓜果皮蜡粉形成机制及分子辅助选育有无果皮蜡粉的新品种具有重要意义。利用不同的西瓜材料进行果皮蜡粉性状基因定位研究（龚成胜等，2019；栾非时等，2019），皆认为西瓜果皮蜡粉性状受一对显性基因控制，并分别定位至1号染色体和8号染色体的不同区域；且用于定位的标记或是检测到的连锁的标记都是snp或是基于snp的caps/dcaps分子标记。此类基于测序产生的snp标记不能直接用于分子标记辅助选择，即使可以转化为可用的标记（比如caps/dcaps），检测过程需要酶切，成本较高，步骤繁琐，造成这些标记在西瓜果皮蜡粉分子标记辅助育种方面的应用具有一定的局限性。
4.indel分子标记作为近年新兴的一种分子生物技术，其是以pcr扩增技术为基础，具有开发成本低、分型简单、检测简单便捷、扩增产物带型简单清晰、结果准确以及仪器设备要求低等优点。
5.然而，目前关于西瓜果皮蜡粉基因的遗传研究及相关的分子标记选育工作相对较少，亟需开发多样化的分子标记，以期可以快速准确的对西瓜果皮蜡粉性状种群进行种质鉴定，对西瓜果皮蜡粉性状的改良及选育具有重大意义。
6.公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本发明总体背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成本领域技术人员所公知的现有技术。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种与西瓜果皮蜡粉紧密连锁的indel分子标记及其引物，应用于西瓜育种当中，能够快速准确的对西瓜果皮蜡粉性状种群进行种质鉴定与筛选。
8.为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：筛选得到一种与西瓜果皮蜡粉紧密连锁的indel分子标记，其在西瓜参考基因组（http://cucurbitgenomics.org/organism/21）1号染色体32843023 bp后存在着如seq id no.1所示核苷酸序列的插入/缺失。
9.设计了一种基于所述indel分子标记的引物，其引物对核苷酸序列如seq id no.2和seq id no.3所示。
10.上述indel分子标记或其引物可应用于西瓜果皮蜡粉性状的分子标记辅助育种中。
11.利用上述indel分子标记或其引物进行西瓜果皮蜡粉性状的鉴定方法，包括以下步骤：（1）利用ctab法提取西瓜叶片总dna；（2）利用所述的引物对，以所述总dna为模板进行pcr扩增；（3）对所述pcr扩增产物进行电泳、显影、染色和带型判读，根据扩增产物的条带大小及位置关系确定所属基因型。
12.优选的，在所述步骤（2）中，pcr扩增的体系为：西瓜叶片总dna 1μl、所述引物各 1μl、2
ꢀ×ꢀ
power taq pcr mastermix 12.5μl、ddh2o 9.5μl。
13.pcr扩增的反应程序为：94℃ 5 min，35个循环的94℃ 20 s、55℃ 1 min、72℃ 30 s，72℃ 5 min。
14.在所述步骤（3）中，判读时，267bp的条带代表纯合有果皮蜡粉基因型；250bp的条带代表纯合无果皮蜡粉基因型；同时存在267bp和250bp的条带代表杂合基因型。
15.与现有技术相比，本发明的主要有益技术效果在于：1. 本发明筛选定位了西瓜果皮蜡粉紧密连锁的indel分子标记，该位点位于西瓜参考基因组（http://cucurbitgenomics.org/organism/21）1号染色体32843023 bp后，插入/缺失如seq id no.1所示的核苷酸序列。
16.2. 本发明还筛选得到一对精准的indel分子标记引物，其核苷酸序列如seq id no.2和3所示；该引物具有检测方便、快速，扩增稳定，准确率高等特点，在bc1群体中该标记的准确率达到100%。
17.3. 本发明通过简便的步骤即可快速鉴定西瓜是否有果皮蜡粉，为西瓜果皮蜡粉性状的分子育种提供了新的技术支撑，有利于提高育种的准确性和选择效率。
18.4. 本发明对果皮蜡粉性状形成的分子机制研究奠定了技术基础。
附图说明
19.图1为西瓜果皮蜡粉性状全基因组qtl定位图。
20.图2为利用分子标记的引物在亲本和部分bc1群体基因组dna中的扩增结果；亲本方框内为目的条带；其中，a：无果粉亲本基因型，b：有果粉亲本基因型，h：杂合基因型，m：marker；名称皆为品种名称\代号的后两/三位。
21.图3为利用分子标记的引物在亲本和42份西瓜资源基因组dna中的扩增结果；亲本方框内为目的条带；其中，a：无果粉亲本基因型，b：有果粉亲本基因型，m：marker；名称皆为品种名称\代号的后两/三位。
具体实施方式
22.下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。
23.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中
间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
24.在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂及原料如无特别说明，均为市售常规产品；所涉及的试验、检测方法，如无特别说明，均为常规方法。
25.实施例一：西瓜果皮蜡粉性状indel分子标记的开发以有果皮蜡粉母本b7和无果皮蜡粉父本b70（由中国农业科学院郑州果树研究所西甜瓜资源课题筛选单系）为亲本，杂交获得f1，再由f1代与父本回交获得bc1群体，鉴定统计f1和bc1群体的果皮蜡粉分布情况。f1有果皮蜡粉，bc1群体有果皮蜡粉的51个，无果皮蜡粉的45个。
26.结合构建的遗传连锁图谱（见表1）和果皮蜡粉性状鉴定结果，利用rqtl-im-binary方法进行qtl定位，在1号染色体定位到一个西瓜果皮蜡粉主效qtl，其lod峰值为20.7，解释了80.6%的表型变异，置信区间对应的物理位置为1号染色体的30.1～36.6mbp（参考基因组链接：http://cucurbitgenomics.org/organism/21），如图1所示。
27.表1 遗传连锁图谱chromosomenumbermarkertotaldistanceavaragedistancemaxgap1981176.170.181.892453163.010.362.6531352156.260.122.6641643172.250.13.375716161.890.232.296811173.390.213.9671475162.640.112.848538164.860.312.2191324172.180.133.21101002174.630.172.7211592159.410.273.02total108871836.680.173.96
28.利用两个亲本（母本b7和父本b70）进行深度的重测序，在qtl峰值区域的32843023bp位置后发现无果皮蜡粉父本b70存在一个17bp的缺失，其核苷酸序列为：atttaattaatttttttt。利用perl语言自编脚本提取该变异位点上、下游500bp的参考基因组序列，设计相应的indel分子标记。
29.设计indel分子标记的引物对，其核苷酸序列为：f：5
’‑
aggtgaaactaatcctataaaa-3’；r：5
’‑
ctaatagtgtagaaaacccata-3’。
30.实施例二：西瓜bc1群体indel分子标记分析验证试验（1）试验材料以无果粉单系cr88与有果粉单系b11及其衍生的bc1群体，包含100个单系为试验材料。
31.（2）利用ctab法提取叶片总dna
①
取1 g西瓜新鲜叶片放入研钵，加入液氮研成粉末状，随即转入加有1 ml ctab 抽取液的离心管中，使二者充分混匀，然后置于65℃恒温水浴60 min，其间颠倒混合2～3次；
②
将样品从水浴锅取出后，8000rpm离心1min；
③
取上清液置于另一离心管中，加等体积的氯仿：异戊醇（24：1，v/ v），轻轻颠倒使其充分混匀；
④
以转速10000rpm离心5min，取上清液，置于另一新的离心管中；
⑤
加入0.7倍体积的提前预冷30min的异丙醇，混匀后置于-20℃冰箱（不超过30min），使dna析出；
⑥
取出后，10000rpm离心5min，小心弃去上清液，取沉淀；
⑦
用无水乙醇清洗沉淀数次，倒掉浸泡液，置于超净工作台上晾干；
⑧
加入200μl的蒸馏水溶解dna；
⑨
用紫外分光光度计测定dna的浓度，并于-20℃冰箱中保存备用。
32.（3）pcr反应：利用实施例1中所设计的引物seq id no：2和seq id no：3进行pcr。
33.pcr反应体系如下：西瓜叶片总dna (100ng/μl) 1μl、上游引物 (10μm) 1μl、下游引物 (10μm) 1μl、2
×ꢀ
power taq pcr mastermix 12.5μl、ddh2o 9.5μl。
34.pcr反应程序如下：94℃、5min；94℃、20s，55℃、1min，72℃、30s，共35个循环；72℃、5min。
35.（4）试剂配制
①ꢀ5×ꢀ
tbe电泳缓冲液：称取tris-base 53.9g，edta 3.72g，硼酸27.5g，蒸馏水定容至1l；
②ꢀ
40％聚丙烯酰胺溶液：聚丙烯酰胺193.34g，甲叉双丙烯酰胺6.66g，蒸馏水定容至500ml；
③ꢀ
8％聚丙烯酰胺凝胶：40％聚丙烯酰胺溶液10ml；5
×
tbe 5ml；10％过硫酸铵(aps)200μl；四甲基乙二胺(temed)80μl；蒸馏水22ml；
④
银染液：硝酸银1g；冰醋酸5ml；无水乙醇50ml；去离子水定容至500ml；
⑤
显影液：氢氧化钠15g；甲醛(37％)2.5ml；去离子水定容至500ml。
36.（5）凝胶板准备：玻璃板用蒸馏水洗净、晾干后，用浸泡过无水乙醇的脱脂棉球擦拭，晾干；将凹板和平板叠合紧密后放入制胶器中压紧并扣好其两边的夹子（一个制胶器可制作两板凝胶）；在洗瓶内配置8%聚丙烯酰胺凝胶溶液（两份），混匀后快速注入两板中间的缝隙内，注满后插入有齿的梳子（避免梳子齿的下方产生气泡）；若此时液面有所下降，可用移液器吸取未凝固的溶液来补充；等待溶液充分凝固。
37.（6）电泳：将制胶器支架从底座上取下，直接放入配套的电泳槽中，在电泳槽底部及支架上两块玻璃板中间倒入适量的1
×
tbe缓冲液；在pcr产物中加入0.2倍体积的6
×
dna loading buffer，混匀后取0.8微升加入点样孔内，260伏电泳35分钟。
38.（7）染色和显影：电泳完成后，从电泳槽中取出玻璃板，撬去凹板，凝胶会贴附于平板上，凝胶面向上将平板放入银染液中，置于脱色摇床上轻摇15min，凝胶会自动脱落下来；银染完毕，将凝胶取出放入去离子水中清洗10s；清洗完毕后将凝胶转入显影液中，轻摇摇床，待条带清晰后取出凝胶，放置在阅片器上肉眼观察条带的位置差异，并拍照保存。
39.（8）带型判读：将显影后自然干燥好的玻璃板置于阅片台上，观察亲本以及bc1群体条带的位置差异，群体中两个单株未收到瓜因此无表型鉴定结果（在表2中以“/”表示）。结果如图2所示，观察分析条带的差异，可以看出bc1群体中，无果皮蜡粉亲本纯合基因型a（250bp）的有49个，杂合基因型h（267bp和250bp）的有51个；基因型与表型完全一致，准确率为100%，统计结果如表2所示（无果皮蜡粉亲本基因型为a，有蜡粉亲本基因型为b，杂合基因型为h）。
40.表2 indel标记在亲本及bc1群体中的鉴定和验证
41.实施例三：indel分子标记在西瓜资源中的分析验证试验
（1）试验材料以42份的栽培西瓜资源 (见表3，全部由中国农业科学院郑州果树研究所国家西甜瓜中期库提供)为试验材料。
42.（2）以实施例2的鉴定方法检测42份栽培西瓜资源的基因型，检测indel分子标记的两种基因型（a代表无果皮蜡粉亲本带型，b代表有果皮蜡粉亲本带型）在42份栽培西瓜资源中的分布情况。
43.结果如图3所示，分子标记的基因型在11份无果皮蜡粉资源中有6份为a（267bp），5份为b（250bp）；而在31份有果皮蜡粉资源中3份为a（267bp），28份为b（250bp）。
44.分子标记的基因型为a的9份资源中6份无果皮蜡粉，3份有果皮蜡粉，，而在基因型为b的33份资源中5份无果皮蜡粉，30份有果皮蜡粉。其基因型鉴定的准确率在42份资源中达81%。
45.表3西瓜群体亲本及种质资源的验证试验。
46.通过indel分子标记来预测西瓜果皮蜡粉，可以提高西瓜果皮蜡粉育种的选择效率，从而极大的加速育种进程。
47.上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明；但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明构思的前提下，所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，从而形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。

技术特征：
1.一种与西瓜果皮蜡粉性状紧密连锁的indel分子标记，其特征在于，基于西瓜参考基因组1号染色体第32843023bp后存在如下序列的插入/缺失：atttaattaatttttttt。2.权利要求1所述indel分子标记的引物，其特征在于， 包括如下引物的核苷酸序列：f：5
’‑
aggtgaaactaatcctataaaa-3’；r：5
’‑
ctaatagtgtagaaaacccata-3’。3.权利要求1所述indel分子标记或权利要求2所述引物在与西瓜果皮蜡粉性状相关的育种中的应用。4.权利要求1所述indel分子标记或权利要求2所述引物在鉴定西瓜果皮蜡粉基因型或表型鉴定中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：（1）提取待鉴定西瓜品种的叶片总dna；（2）利用权利要求2所述引物，以所述总dna为模板进行pcr扩增，对所述pcr扩增产物进行行电泳、显影、染色，并判读带型；（3）扩增产物为267bp的条带为有果皮蜡粉亲本纯合基因型，即表型为有果皮蜡粉；扩增产物为250bp的条带为无果皮蜡粉纯合基因型，即表型为无果皮蜡粉；扩增产物同时存在267bp和250bp的条带为杂合基因型，即表型有果皮蜡粉。

技术总结
本发明涉及一种与西瓜果皮蜡粉性状紧密连锁的InDel分子标记、其引物及应用，旨在解决现有技术无法快速、准确的对西瓜果皮蜡粉性状种群进行种质鉴定的技术问题。本发明筛选得到一种与西瓜果皮蜡粉紧密连锁的InDel分子标记，并基于其设计得到一种精准的引物；该InDel分子标记及其引物可应用于西瓜果皮蜡粉性状的鉴定或分子标记辅助育种中。本发明可快速鉴定西瓜是否有果皮蜡粉，为西瓜果皮蜡粉性状的分子育种提供了新的技术支持，有利于提高西瓜育种的准确性和选择效率。育种的准确性和选择效率。育种的准确性和选择效率。


技术研发人员：李娜 马双武 周丹 李楠楠 尚建立 王吉明 孔胜楠
受保护的技术使用者：中国农业科学院郑州果树研究所
技术研发日：2021.11.10
技术公布日：2022/3/8