胶红酵母CM-1菌株及其产生的胞外多糖以及胞外多糖在抗氧化和肝毒性保护中的应用的制作方法

胶红酵母cm-1菌株及其产生的胞外多糖以及胞外多糖在抗氧化和肝毒性保护中的应用
技术领域
1.本发明属于微生物胞外多糖技术领域，具体涉及胶红酵母cm-1菌株及其产生的胞外多糖 以及胞外多糖在抗氧化和肝毒性保护中的应用。


背景技术：

2.酵母胞外多糖(yeps)是一种微生物多糖，具有很多生理活性。研究发现，酵母多糖具 有潜在的抗氧化，抗凝血，抗血栓和抗病毒活性，可用于生产有机体免疫调节剂，具有广阔 的市场前景。因此，它引起了学术界越来越多的关注。到目前为止，已经报道了几种酵母菌 种可以产生胞外多糖，其中包括：隐球菌属(cryptococcus)，汉逊酵母属(hansenula)， 油脂酵母属(lipomyces)，布勒掷孢酵母属(bullera)，短梗霉属(aureobasidium)，和 胶红酵母属(rhodotorula)。因此，鉴于酵母胞外多糖的抗氧化活性和生理功能，筛选生产 yeps的优良酵母菌株并研究其物理化学性质和活性功能，对于未来医药、食品等多个领域都 可能具有极大地影响。目前，我们对菌种的开发还不够，全新的菌种及其产生的胞外多糖， 可能具有现有菌种产生的胞外多糖所不具备的特性，为现代医药、食品等领域提供全新的方 式。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种胶红酵母cm-1菌株及其产生的胞外多糖以及胞外多糖在抗 氧化和肝毒性保护中的应用，开发一种新的菌种及其胞外多糖，以解决现代医药、食品等领 域存在的多个问题。
4.为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
5.胶红酵母cm-1菌株，保藏号为cctcc no：m2018704。本菌株于2018年10月23号保藏于位于武汉大学的中国典型培养物保藏中心，分类命名 为：rhodotorula mucilaginosa cm-1。
6.胶红酵母cm-1菌株培养过程中产生的胞外多糖rm eps-11。
7.作为优选地，胞外多糖rm eps-11的制备过程包括如下步骤：
8.(1)将胶红酵母cm-1细胞在固体培养基进行培养，挑取活化好的胶红酵母cm-1菌落；
9.(2)采用液体培养基培养活化好的胶红酵母cm-1菌落；
10.(3)离心分离液体培养液，分离出酵母菌与上清培养液，取上清培养液，浓缩处理；
11.(4)采用醇沉、离心的手段从浓缩的上清培养液中初步纯化出胞外粗多糖；
12.(5)利用纤维素交换柱以及凝胶渗透法从胞外粗多糖中精制胞外多糖rm eps-11。
13.胞外多糖rm eps-11在食品与药品中作为抗氧化剂的应用。
14.胞外多糖rm eps-11在对异烟肼和利福平肝毒性保护中的应用。
15.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
16.1、本发明提供的胶红酵母cm-1菌株是一种新的胶红酵母属菌株，在培养过程中能够产 生并分离提纯得到一种新的胞外多糖rm eps-11，为现代药品和食品提供了新的功能性物质；
17.2、本发明得到的胞外多糖rm eps-11，其多糖抗氧化实验中抗氧化性能优异，由此表明， rmeps-11可以作为天然抗氧化剂应用在食品与药品中；
18.3、本发明得到的胞外多糖rm eps-11，其肝毒性的保护作用明显，为将酵母胞外多糖rmeps-11作为治疗制剂或作为天然功能食品成分应用于临床治疗提供数据和理论支撑。
附图说明
19.图1为多糖rmeps-11分子量分布图；
20.图2为多糖rmeps-11红外光谱图；
21.图3为单糖标准图谱，其中：ara，rib，xyl，glc，fru，man和gal分别代表阿拉伯糖， 核糖，木糖，葡萄糖，果糖，甘露糖和半乳糖；
22.图4为胞外多糖rmeps-11的单糖组成谱图；
23.图5为胞外多糖rmeps-11甲基化tic色谱图，其中，1表示2,3,4,6-me3-man；2表示 3,4,6-me3-glc；3表示2,4,6-me3-glc；4表示3,4-me3-gal；5表示阿拉伯糖醇；
24.图6为胞外多糖rmeps-11的1hnmr谱图；
25.图7为胞外多糖rmeps-11的
13
cnmr谱图；
26.图8为胞外多糖rmeps-11和vc的dpph自由基活性对比图；
27.图9为胞外多糖rmeps-11和vc的abts自由基清除活性对比图；
28.图10为胞外多糖rmeps-11和vc的还原力活性对比图；
29.图11为胞外多糖rmeps-11和vc的清除氧自由基能力对比图，其中(orac值)数值是平 均值
±
s.d.(n＝3)；
30.图12为空白对照组小鼠肝组织的病理切片(he
×
40)；
31.图13为模型组小鼠肝组织的病理切片(he
×
40)；
32.图14为阳性对照组小鼠肝组织的病理切片(he
×
40)；
33.图15为rmeps-11治疗组小鼠肝组织的病理切片(he
×
40)。
34.图16为cyp2e1 mrna的表达图，其中，数据表示为均值
±
sem,统计分析采用单因素方差 分析。
具体实施方式
35.下面结合各实施例对本发明作进一步说明，本发明的方式包括但不仅限于以下实施例。
36.实施例1
37.利用保藏号为cctcc no：m2018704的胶红酵母cm-1菌株培养分离出胞外多糖rm eps-11， 具体步骤如下：
38.a、胶红酵母r.mucilaginosa cm-1细胞固体培养基培养
39.1)称取ypd固体培养基(酵母膏1％、葡萄糖2％、蛋白胨2％、琼脂粉2％)，培养皿10
个， 100ml蒸馏水锥形瓶1个。将上述物品高压蒸汽灭菌(121℃，20min)。
40.2)高压蒸汽灭菌完成后，待培养液冷却至40℃，倒平板备用。
41.3)将胶红酵母r.mucilaginosa cm-1从-80℃冰箱中取出，室温下接种于平板上，于 28℃培养2～3d活化。
42.4)用稀释涂布法(移液器吸取40μl菌液)将活化好的胶红酵母菌进一步分离纯化。
43.5)挑选单个菌落，按照4)所述的方法再次培养菌种，得到胶红酵母菌种的纯培养菌落。
44.6)挑取单菌落于在载玻片上，滴加无菌水，放显微镜下观察；使菌悬液在载玻片上形成 均匀薄膜。待玻片自然干燥后，滴加少量美蓝染液，静置3min，然后镜检。
45.b、胶红酵母r.mucilaginosa cm-1细胞液体培养基培养
46.挑取活化好的胶红酵母r.mucilaginosa cm-1菌落接种于种子液体培养基扩大培养，配 制4000ml的无机培养液，种子液按5％的接种量接入。于28℃、80-100r/min条件下培养6d。
47.c、胶红酵母r.mucilaginosa cm-1胞外粗多糖的分离
48.将液体培养液于9000r/min、4℃、6min条件下离心分离酵母菌与培养液，取上清液，浓 缩处理。
49.d、胞外粗多糖分步醇沉
50.为得到单一、纯度高的酵母胞外多糖(eps)，先采用醇沉的方法进行第一步纯化，将浓 缩好的上清液依次在不同浓度乙醇溶液中醇沉24h，乙醇浓度分别为50％、60％、70％、80％、 90％，将胞外多糖进行初步纯化。
51.e、胞外粗多糖(eps)的获得
52.将醇沉后的酵母胞外多糖移入50ml的离心管中，在4℃、5000r/min、10min的条件下离 心，得白色沉淀，即为酵母胞外多糖粗品。收集粗品置于通风、干燥处，挥发乙醇。
53.量取30ml蒸馏水加入离心管内，使粗胞外多糖样品充分溶解。将上述溶液倒入培养皿 (90mm)，冷冻干燥后保存备用。
54.f、deae-cellulose 52树脂的活化处理
55.称取100g deae-cellulose 52，置于含200ml蒸馏水的容器中溶胀24h。以0.5mol/l naoh 处理30min，抽滤，蒸馏水洗至中性。后以0.5mol/l hci处理30min，抽滤。再用0.5mol/lnaoh漂洗30min，使之转为oh-型，后用0.5mol/l nacl溶液清洗，使之转为cl-型。处理好 的树脂置于缓冲液内进行填料，保证填料柱子完整致密，无小泡。剩余树脂浸泡在75％的乙 醇溶液中保留备用。
56.g、deae-cellulose 52树脂装柱
57.直立固定层析柱，加些许缓冲溶液，将deae-cellulose 52处理后的浑浊液缓慢的注入 到玻璃柱内，自然沉降到柱高的三分之一时，打开层析柱下方的排液口，使液体均匀的流出， 确保树脂上表面平整且不能暴露在缓冲液外，观察填料柱无小气泡产生。将粗多糖rmeps溶 于蒸馏水中，离心去除未溶解的沉淀与杂质，将上清液添加到deae-cellulose 52柱(2.5cm
ꢀ×
20.0cm)上，用蒸馏水(2000.0ml)洗脱填料柱以除去未结合的胞外多糖。将粗多糖依次 用蒸馏水，0.3，0.6，0.9和1.2m nacl以0.5ml/min的流速洗涤，产生六个组分，分别命 名为rmeps-1，rmeps-2，rmeps-3，rmeps-4，rmeps-5和reps-6。用蒸馏水洗脱的粗
rmeps-1 的主要组分进一步分馏得到rmeps-11。将rmeps-11进一步浓缩，透析并冻干后备用。通过 苯酚-硫酸法测定rmeps-11的产量。
58.h、三氯乙酸沉淀蛋白
59.称取2.00g的eps样品，用50ml的蒸馏水进行溶解。在eps的水溶液里缓慢滴加10％的 三氯乙酸。置于4℃的冰箱内放置24h，于5000r/min、4℃、10min条件下去除白色沉淀。将 多糖溶液醇沉后进行冻干处理，保存后备用。
60.本实施例通过浓缩、醇沉、脱蛋白、脱色和透析等方法得到胶红酵母r.mucilaginosa cm-1 胞外多糖rmeps，经苯酚-硫酸法测定多糖量为7.35g/l。通过deae-52纤维素阴离子交换层 析分离获得rmeps-1，rmeps-2，rmeps-3，rmeps-4，rmeps-5和rmeps-6六个多糖组分(图 2-3)，占主要部分的中性多糖rmeps-1用蒸馏水洗脱，通过凝胶渗透在sepharose cl-6b柱 中进一步浓缩和分级，获得了单一rmeps-11多糖组分，证明rmeps-11是单一组分。收集 rmeps-11组分，透析、干燥后备用。
61.对本实施例制备的酵母胞外多糖rmeps-11结构进行解析，解析过程如下：
62.1、分子量分布：通过高效凝胶渗透色谱(hpgpc)分析rmeps-11的平均分子量。测试条 件：取10mg多糖样品，加1ml 0.1m nano3，60℃孵育过夜，稀释4倍，过0.22um滤膜， 取100ul上样。仪器：gpc-ri-mals(凝胶色谱-示差-多角度激光光散射)，检测器：ri，mals， 流动相：0.1m nano3，流速：0.8ml/min，柱温：45℃，分析柱型号：ohpak sb-804hq,ohpaksb-805hq，上样量：100ul。hpgpc色谱图显示多糖rmeps-11的色谱图为单一对称洗脱峰， 表明多糖为相对均一的多糖组分，没有其他多糖组分存在。如图1所示，多糖rmeps-11的平 均分子量为2.3
×
105da。
63.2、ft-ir光谱分析：rmeps-11的ft-ir光谱分析通过kbr法实施。将样品rmeps-11与 kbr粉末充分混合，研磨并压制成1-mm颗粒。使用vector 33ft-ir分光光度计(bruker， ettlingen，德国)以4cm-400cm-1的分辨率记录2cm-1的ft-ir光谱。图2显示了rmeps-11 的ft-ir谱图，在3422，2925，1630，1420和1076cm-1处吸收峰显示了多糖的典型特征吸 收峰。在3422cm-1处的典型宽峰是由于糖环中o-h的伸缩振动造成的。2933cm-1附近的谱 带归因于c-h伸缩振动。在1621cm-1和1431cm-1附近的强吸收表明羧基。在1088cm-1处的 峰表明在reps2-a中存在c＝o键。在1730cm-1处没有观察到吸收峰，表明reps2-a不含糖醛 酸，具体光谱数据分析如表1：
64.表1多糖rmeps-11红外光谱数据
[0065][0066]
3、单糖组成分析(离子色谱法)：采用离子色谱法(ics)对rmeps-11的单糖组成进行 测定。试验中以阿拉伯糖、核糖、木糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、d-半乳糖为标准糖，测定 每个标准单糖的保留时间，通过相应的峰面积和响应因子对rmeps-11的单糖组成进行测
算。
[0067]
具体操作步骤：取5mg rmeps-11溶解于2.5m的三氟乙酸，在121℃下保存2h，采用n2 气流对其风干。风干后的样品用甲醇进行近一步萃取、洗涤并用n2气流对其风干，循环3-4 次。得到的干样品用1ml的蒸馏水溶解，溶解后稀释100倍，取25μl样液采用离子色谱(ics) 进行分析，采用pad软件做出相应的峰图。设定条件如下：流动相为氢氧化钠，流速梯度为 0-40min，5mmol；40-45min，100mmol；45-50min，200mmol；50.2-55min，5mmol；其中40-45min 内同时加入100mmol的醋酸钠，流速设定为1ml/min，上样量25μl，柱温30℃，柱型为 carbopac-pa10。
[0068]
通过离子色谱测定多糖rmeps-11的单糖组成，不仅可以分析多糖的构成，而且准确测定 各单糖在多糖中所占的比例，单糖含量之和可以用来衡量对比多糖的质量。与传统方法相比， 消除了非糖类成分的干扰，提高了检测的专属性，结果更加真实，同时为其他多糖的质量控 制提供了借鉴。
[0069]
通过ics分析rmeps-11的单糖组成(图3和图4)。如图4所示，基于标准单糖的ics 分析，rmeps-11主要由ara，gal，glc和man四种单糖构成，摩尔比分别为1.3:4.4:7.8:86.4， 其中甘露糖含量最高。
[0070]
4、甲基化分析：胞外多糖rmeps-11的甲基化分析测定采用ciucanu方法。将甲基化的 样品rmeps-11在100℃下用90.0％甲酸处理3h，用甲醇萃取去除甲酸。产物进一步用2.0m tfa 在121℃水解2h，用nabh4还原，然后乙酰化。通过气相色谱-质谱(gc-ms)分析所得的部 分o-甲基化糖醇乙酸酯。使用配备有毛细管柱rtx-5ms(30.00m
×
0.25mm
×
0.25μm)的 shimadzu仪器进行gc-ms测定。温度设定为140℃、2min；然后以2℃/min的速度升温至250℃ 保持20min。使用氦气作为载气，流速为1.24ml/min。
[0071]
将rmeps-11全甲基化级分进行完全酸水解，后进行还原和乙酰化。然后将样品的部分甲 基化的糖醇乙酸酯进行gc和gc-ms分析。rmeps-11的气相色谱图如图5所示。根据保留时 间和质谱图分析其碎片峰。
[0072]
表2rmeps-11甲基化分析数据表
[0073][0074]
基于表2中对rmeps-11的甲基化分析结果表明rmeps-11的非还原末端含有甘露糖。分 支位于半乳糖基和一些阿拉伯糖残基上。根据表2可以得出以下结论：1)甘露糖残基以末端 和1,3-连接的manp残基存在；2)葡萄糖残基作为1,2-连接的glcp残基存在；3)半乳糖残 基以1,2,6-连接的galp残基存在；4)阿拉伯糖残基以1,2,3,4连接的arap残基存在。除 了末端manp残基之外，上述这些残基的数量占总甲基化糖的64.5％，这表明rmeps-11的骨 架由1,3-连接的manp和1,2-连接的glcp残基组成，分支上是1,2,6连接的galp和1,2,3,
4 连接的arap。
[0075]
5、核磁共振分析：称取30.0mg胞外多糖rmeps-11，加入0.5ml 99.99％d2o水浴加热 充分溶解。充分溶解后将样品转移至核磁管，在23℃下，利用avance
ⅲ‑
600mhz核磁共振波 谱仪分析。
[0076]
多糖rmeps-11的1h和
13
c nmr图谱分析见图6/7。在1h nmr的异头区域(图6)，在4.55ppm 处的共振可归因于1,2,6-联galp。样品的
13
c nmr谱(图7)揭示了多糖的信号特征。特征 峰值96.08，74.40，76.03，71.63，75.86和60.93处的六个信号是β-(1
→
3)-man的特征 峰，归因于c-1，c-2，c-3，c-4，c-5和c-6。
[0077]
实施例2
[0078]
关于胞外多糖rmeps抗氧化的试验，具体如下：
[0079]
a、dpph自由基的清除能力
[0080]
dpph(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)上多余的电子易离 开，从而形成一类不活跃的使氮为核心的质子型自由基，在甲醇溶液中为紫色，在517nm处 有强烈吸收。当有消除自由基试剂出现时，溶液颜色褪去，颜色的变化和结合的电子数目有 一定的比例性，当波长为517nm时所测的od值减小，结果变化同自由基减少的量存在线形关 系。od值的减小可用紫外-可见光分光光度计检测。所得od值的强弱和自由基减少量存在线 性比例，od值下降越多，所测物质抗氧化活性就越强。
[0081]
dpph自由基具体操作方法：准确吸取dpph试剂3.9ml，与0.1ml甲醇试剂混合，以甲醇 作参照，记录混合液于517nm处所得的od值(a对照)。吸取5份相同体积的酵母胞外多糖 rmeps-11溶液，分别稀释到1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml、6mg/ml和8mg/ml；吸取5份相同体 积的vc溶液，分别稀释到1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml、6mg/ml和8mg/ml。量取上述试样各1ml， 加入3ml dpph(25mg/l)试剂，涡漩均匀，30℃保温，避光静置40min。甲醇为参照，记录 各混合液在517nm处所得的od值(a样品)，所有的试样做三个重复后求平均值。取上述样液 各0.1ml，分别与3.9ml甲醇试剂混合均匀，用甲醇做参照，记录各混合液在517nm处所得 的od值(a参比)；记录各组数据，计算其清除率(sr)，得到清除率在一定浓度范围内的 线性回归方程，通过线性回归方程计算半数清除率ic50(半数抑制率，指dpph的减少率达 50％时试样的浓度)。ic50的数字越低，对dpph的削弱效果越好，测试样品其抗氧化能力越 高。整理数据并作图对比分析酵母胞外多糖rmeps-11和vc溶液对dpph清除能力的差异。
[0082]
dpph清除率计算公式如下：
[0083][0084]
如图8给出了rmeps-11的dpph清除活性的效果，使用vc作为阳性对照。如图所示，dpph 自由基清除活性随着浓度的增加而增加(从1mg/ml逐级递增到8mg/ml)。当浓度达到8mg/ml 时，rmeps-11和vc的清除率分别达到为66.15％和97.62％。在测试范围内，rmeps-11的ic50 值为2.96mg/ml。结果表明，rmeps-11具有很强的dpph自由基清除能力。这意味着它们可以 将电子或氢供给dpph自由基。在相同浓度下，vc的清除能力高于多糖rmeps-11。
[0085]
b、abts自由基清除实验
[0086]
abts与氧化剂发生反应后被氧化为abts+，当有抗氧化性的物质出现时abts+的量就会 受到削弱，abts+自由基离子的最大吸收波长为734nm，用a734nm可以检测abts+自由
11的orac 值为560.38
±
6.45μmte/g。如图11所示，结果显示rmeps-11具有强的自由基清除能力，主要 因为多糖的氢原子贡献给了环上的c-h键或醛糖、糖醛酸上的o-h和其他位点来清除自由基的。 据文献报道，多糖的抗氧化活性与其单糖组成，分子量和糖苷类型有关。
[0098]
抗氧化实验表明，rmeps-11在8mg/ml时表现出高dpph自由基清除活性(66.15％)和abts 自由基清除活性(8mg/ml时为82.8％)，还原力(8mg/ml时为0.753)与氧自由基吸收能力(560.38
ꢀ±
6.45μmte/g)。本实施例表明，rmeps-11可以作为潜在的天然抗氧化剂应用在食品与药品 中。
[0099]
实施例3
[0100]
胞外多糖rmeps-11对异烟肼和利福平肝毒性的保护试验，具体如下：
[0101]
1、分组及造模
[0102]
将雌雄小鼠分别随机分为4组：
①
空白对照组、
②
异烟肼(inh)模型对照组、
ꢀ③
rmeps-11-treated(100mg/kg)+inh(150mg/kg)-rif(300mg/kg)，以及
④
阳性对照组: silymarin-treated(100mg/kg)+inh(150mg/kg)-rif(300mg/kg)，每组8只，雌雄各半。
[0103]
小鼠适应性饲养一周后，进行实验。每天对各组的小鼠采用相同的给药方式，连续7天灌 药(ig)，操作如下：
①
空白对照组ig 20ml/kg的0.9％nacl注射液；
②
inh模型对照组以 0.74mmol/kg按0.2ml/10g体重ig药物inh；第
③
组是在inh模型组造模给药的基础上，按 100mg/kg rmeps-11进行肝保护；
④
100mg/kg silymarin体重灌胃，每日1次，期间正常给水、 给食饲养，待最后一天灌胃给药后禁食、禁水12h，采样处理。
[0104]
2、脏器指数的测定及样品处理
[0105]
对每只小鼠称重后，采用常见方法摘取眼球取血(取血量约为0.8ml)，将血样保存，用 于后期生物理化指标，包括alt/gpt、ast/got、t-sod、t-protein、mda和gsh-px等指标测 定，将所用剪刀、镊子及锡箔纸干烤处理。随即脱臼处死小鼠，用手术刀剖腹取出肝和肾， 观察其颜色及大小变化程度，再分别用蒸馏水和生理盐水冲洗、滤纸擦干后，称重。并取肝 脏右叶部分组织分2部分备用，一部分在-20℃冻存用于测定生物指标，用锡箔纸包好放入无 rnaase的ep管中，液氮速冻后转入-80℃冰箱用于后期分子学实验；另一部分用10％福尔马林 固定后，用于在光镜下检验其病理学变化。
[0106]
如图12-图15所示，空白对照组为小鼠肝脏病理切片显示正常组织形态(图12)；用异烟 肼和利福平处理的实验鼠呈现肝硬化、经典的组织凝固性坏死、大量纤维化、单核细胞浸润、 出血、脂肪变性和再生结节的形成(图13)。然而，在rmeps-11治疗组和阳性对照组(图14/15) 中并没有发现组织病理学变化。通过生化实验和组织病理学结果，我们可以得出：rmeps-11 能够治疗和改善异烟肼和利福平引起的肝损伤。
[0107]
如表3所示，为用异烟肼和利福平处理大鼠、通过rmeps-11治疗后血清中alt、ast、sod、 mda、gsh的含量。血清中天门冬氨酸氨基转移酶和丙氨酸氨基转移酶的含量作为肝功能的重 要指标。如表3所示，通过异烟肼和利福平处理后这两种肝毒性生物标志物的含量显著提高， 这表明增大了肝脏的氧化应激。与对照组相比，模型组ast和alt含量显著升高(p＜0.01)。 阳性对照组和rmeps-11治疗组ast、alt含量显著降低(p＜0.01)，因此ast、alt可以作为异 烟肼和利福平肝毒性的评估指标。mda、sod和gsh的浓度也可观察到类似的变化。
[0108]
超氧化物歧化酶(sod)和谷胱甘肽过氧化物酶(gsh)等抗氧化酶在抗氧化应激的
保护 机制中起重要作用，其活性可能是保护机体抗氧化能力的关键。结果表明，异烟肼和利福平 处理后实验鼠体内mda浓度升高，sod和gsh的浓度降低(p＜0.01)，与对照组相比，表明脂 质过氧化，导致异烟肼和利福平中毒。阳性对照组和rmeps-11治疗组能降低mda浓度、调高sod 和gsh浓度，最终接近模型组(p＜0.01)。表明rmeps-11在逆转肝损伤过程中起到一定作用。
[0109]
表3用异烟肼和利福平处理大鼠、通过rmeps-11治疗后血清中 alt、ast、sod、mda、gsh的含量
[0110][0111]
3、相关基因cyp2e1和表达
[0112]
为了从分子水平进行小鼠肝脏损伤减轻的相关机理研究，我们用荧光实时定量pcr对其 相关基因cyp2e做定量表达实验。我们以gapdh为内参基因，将-80℃冻存在无rnaase的ep 管中的小鼠肝脏进行cyp2e1和cyp1a2在mrna转录水平上的差异进行研究。
[0113]
cyp2e1参与氧化应激的主要途径，研究已经表明，cyp2e1参与异烟肼和利福平肝毒性的 形成过程。rt-pcr来检测rmeps-11对小鼠肝脏中cyp2e1基因相对表达情况，从结果可以看 出(图16)，cyp2e1在inh模型组的表达量1.90
±
0.42明显较高，与空白组0.98
±
0.26有 显著差异(p《0.01)，但sc阳性对照组0.75
±
0.19和rmeps-11治疗组0.82
±
0.22分别与 inh模型组比较具有显著差异(p《0.05)，cyp2e1表达量明显降低。
[0114]
本实施例考察从cm-1菌株培养液中提取的rmeps-11对小鼠inh和rif引起的肝毒性的 保护作用。结果显示，与inh和rif处理的小鼠相比，rmeps-11给药后血清alt，ast水平 和肝脏mda含量显着降低，肝脏sod活性和gsh含量显著恢复。此外，肝脏的组织病理学损 伤和凋亡肝细胞的数量也通过处理显着改善。机制研究表明，保护作用主要是由于cyp2e1 mrna表达水平的调节，导致有害自由基和ros的形成减少，同时伴随着其抗氧化能力的显著 诱导，多糖rmeps-11通过抑制肝cyp2e1抑制脂质过氧化，增加自由基的清除。因此，实验 证明，由胶红酵母r.mucilaginosa cm-1菌株提取的多糖rmeps-11能够对inh和rif引起 的小鼠急性肝损伤有一定的保护作用。这也是将酵母胞外多糖作为治疗制剂或作为天然功能 食品成分应用于临床治疗提供数据和理论支撑。
[0115]
上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，但凡 在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题 仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.胶红酵母cm-1菌株，保藏号为cctcc no：m2018704。2.胶红酵母cm-1菌株培养过程中产生的胞外多糖rm eps-11。3.如权利要求2所述的胞外多糖rm eps-11，其制备过程包括如下步骤：(1)将胶红酵母cm-1细胞在固体培养基进行培养，挑取活化好的胶红酵母cm-1菌落；(2)采用液体培养基培养活化好的胶红酵母cm-1菌落；(3)离心分离液体培养液，分离出酵母菌与上清培养液，取上清培养液，浓缩处理；(4)采用醇沉、离心的手段从浓缩的上清培养液中初步纯化出胞外粗多糖；(5)利用纤维素交换柱以及凝胶渗透法从胞外粗多糖中精制胞外多糖rm eps-11。4.胞外多糖rm eps-11在食品与药品中作为抗氧化剂的应用。5.胞外多糖rm eps-11在对异烟肼和利福平肝毒性保护中的应用。

技术总结
本发明公开了胶红酵母CM-1菌株及其产生的胞外多糖以及胞外多糖在抗氧化和肝毒性保护中的应用，本发明属于微生物胞外多糖技术领域。本发明提供一种胶红酵母CM-1菌株，其保藏号为CCTCC NO：M2018704，胶红酵母CM-1菌株培养过程中产生的胞外多糖Rm EPS-11，为现代药品和食品提供了新的功能性物质，另外胞外多糖Rm EPS-11在抗氧化性能试验以及对异烟肼和利福平肝毒性保护试验中表现出的优异性能，提供了胞外多糖Rm EPS-11在抗氧化以及对异烟肼和利福平肝毒性保护的新应用思路。利福平肝毒性保护的新应用思路。利福平肝毒性保护的新应用思路。


技术研发人员：马文锦 王博 李梅林 周彦兵
受保护的技术使用者：甘肃省轻工研究院有限责任公司
技术研发日：2021.05.13
技术公布日：2022/3/8