细菌转录抑制剂抑制大肠杆菌体外转录活性的检测方法

1.本发明涉及抑制细菌转录技术领域，特别是一种细菌转录抑制剂抑制大肠杆菌体外转录活性的检测方法。


背景技术：

2.随着全球细菌耐药性的日益严峻，很多细菌都已经产生了严重的耐药性，大量的上市抗生素失去抑菌效果。开发新的抗菌物质已迫在眉睫，抗菌肽、共生菌的次生代谢产物等天然产物是未来抗菌物质筛选的新方向。在大量的抗菌物质筛选过程中需要开发出经济、快速、高通量的活性检测方法来确定其抑菌作用机制，只有熟知其抗菌机制，才能安全合理有效的抑制及杀灭细菌。在众多抑菌物质中，抑制细菌rna的转录是一种有效的抑菌机制。rna转录抑制剂可作用于rna聚合酶活性中心及其附近，阻止转录起始或者。rna链的延伸从而阻止转录过程，严重的影响rrna和mrna的合成，从而造成细菌停止生长。如利福霉素类药物通过抑制转录的起始从而达到抑菌目的，该类药物是治疗结核病和布氏病的一线药物，随着利福霉素类药物耐药菌的出现，开发能杀灭利福霉素类药物耐药菌且生物利用度高的新型rna聚合酶抑制剂已迫在眉睫。在细菌对数生长期，有一半以上的rna聚合酶是在合成rrna。因此以rrna作为研究对象可以更加准确的反应细菌的转录水平。目前对转录水平的检测方法仍然局限于放射性同位素标记法，通过标记同位素到核酸上再进行定量研究。该方法因为涉及到放射性物质的使用，对于环境和实验人员有很大潜在危险。
3.因此，开发一种能够替代放射性同位素的检测方法是很要必要的。


技术实现要素：

4.本发明的目的是要解决现有技术中存在的不足，提供一种细菌转录抑制剂抑制大肠杆菌体外转录活性的检测方法。
5.为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：
6.一种细菌转录抑制剂抑制大肠杆菌体外转录活性的检测方法，包括以下步骤：
7.步骤一、制备大肠杆菌体外转录pkk450-dna模板；
8.步骤二、以pkk3535质粒为模板，制备荧光分子信标m.b.；
9.步骤三、制备大肠杆菌体外转录体系，体外转录反应组分如下表：
[0010][0011]
将体外转录组分按照每个反应200μl分别移入ep管中，置于37℃温度下进行孵育反应1小时，通过加入20μl的3m醋酸钠，3倍反应体积的100％乙醇和3μl糖原终止体外转录反应；-20℃静置1小时；4℃，12000rcf离心10min，弃上清，使用1ml的80％的冰冷乙醇冲洗沉淀；4℃，12000rcf离心10min，弃上清，待ep管干燥，rna沉降于底部；每管各加18μl的荧光分子信标m.b.buffer和2μl浓度为0.01μm的m.b.漩涡震荡后短暂离心，置于95℃变性2min后，45℃退火10min；
[0012]
步骤四、检测大肠杆菌转录抑制剂对体外转录抑制活性：
[0013]
在步骤三的体外转录反应ep管中加入大肠杆菌转录抑制剂2μl；然后将反应液移入黑色96孔酶标板内，使用荧光酶标仪读取荧光强度，激发波长为485nm，发射波长520nm。
[0014]
进一步地，所述步骤一具体包括：
[0015]
以含有大肠杆菌rrnb核糖体操纵子的全长以及启动序列的pkk3535质粒为模板，pkk-f与pkk-450r为引物，pkk-f引物的5
’‑3’
端引物序列为：ggcaatgacgccaggagctg，pkk-450r引物的5
’‑3’
端引物序列为：ccccgctgaaagtactttacaacc；对目的片段进行pcr扩增，预混液反应体系：pfu dna聚合酶1μl，10x buffer 10μl，dntps 8μl，上下游引物各4μl，pkk3535质粒10μl，ddh2o 71μl，反应条件：95℃3min，95℃30s，55℃30s，72℃60s，循环30次，72℃10min；使用pcr产物纯化试剂盒对扩增得到的dna片段进行产物回收，获得大肠杆菌体外转录pkk450-dna模板。
[0016]
进一步地，所述步骤二具体包括：
[0017]
以pkk3535质粒为模板，设计并合成与rrnb操纵子前端可以互补结合的29个碱基构成的寡聚核苷酸，通过在寡聚核苷酸5’端连接fam荧光基团、3’端连接dabcyl淬灭基团并通过在其两端增加互补的重复gc的序列使之形成颈环状结构，使得fam与dabcyl相互靠近，在分子信标单独存在时荧光被淬灭；当分子信标能与大肠杆菌rrna模板特异性的结合后cg序列会被分开，颈环结构发生改变；fam基团远离dabcyl基团，从而激发出荧光信号。
[0018]
进一步地，所述步骤三中，荧光分子信标m.b.buffer组分为：kcl 1m，mgcl
2 10mm，ph＝8的tris-hcl 100μm。
[0019]
与现有技术相比，本发明设计并合成了可以与大肠杆菌rrna互补的荧光分子信标，利用该分子信标与体外转录产生的rrna进行互补变构，使分子信标3’端的dabcyl淬灭基团远离5’端的fam发荧光基团，激发出可以被荧光酶标仪检测到的荧光信号；可以精确的检测细菌转录抑制剂的活性；另外，由于本发明中采用荧光酶标仪以及96孔板此类高效、快速的检测仪器，因此，可以高通量的检测大量待测样品，对转录抑制类药物的筛选有着重要的应用价值。在此方法基础上可以对抑菌物质的作用机制进行分析，以确定其对细菌转录的影响。
附图说明
[0020]
图1为扩增dna pkk450模板及荧光分子信标互补位置。
[0021]
图2为荧光分子信标m.b.结构图。
[0022]
图3为荧光分子信标与其互补dna片段结合激发荧光检测结果。
[0023]
图4为荧光分子信标对体外转录水平的检测结果。
[0024]
图5为利福布丁对荧光激发影响的检测结果。
[0025]
图6为利福平对荧光激发影响的检测结果。
[0026]
图7为利福喷丁对荧光激发影响的检测结果。
[0027]
图8为利福昔明对荧光激发影响的检测结果。
具体实施方式
[0028]
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。
[0029]
首先对以下实施所用材料和主要试剂以及相关溶液配制进行说明：
[0030]
pkk3535质粒(由美国加州大学brosius惠赠)；
[0031]
e.coli d7 prrn菌株(由美国塔夫茨大学squires惠赠)；
[0032]
主要试剂：pfu dna聚合酶、rnase inihibitor均购自碧云天生物技术有限公司；e.coli rna聚合酶为基于svetlov的方法本实验室自制；琼脂糖凝胶dna回收试剂盒购自北京天根生化公司；质粒提取试剂盒购自诺唯赞生物科技股份有限公司；引物及分子信标由吉林省库美生物科技有限公司合成。其余药品为国产分析纯。
[0033]
相关溶液配制
[0034]
dtt：0.1m dtt，0.22μm滤头过滤除菌，-20℃贮存。
[0035]
ntps：1m的atp、gtp、ctp、utp等比例混合，再稀释成0.1m的贮备液备用，-20℃贮存。
[0036]
3m醋酸钠、10mm tris-hcl(ph＝8.8)：先配制10mm tris，再用hcl调ph至8.8。
[0037]
本实施例以大肠杆菌核糖体rrnb启动区和16s rrna前450bp的rdna为模板(如图1所示)进行体外转录。扩增该dna片段需要以pkk3535质粒(含有大肠杆菌rrnb核糖体操纵子的全长以及启动序列)为模板，pkk-f与pkk-450r为引物(参照表1的引物序列)，使用pcr技术对目的片段进行扩增，预混液反应体系：pfu dna聚合酶1μl，10x buffer 10μl，dntps 8μl，上下游引物各4μl，pkk3535质粒10μl，ddh2o 71μl。反应条件：95℃3min，95℃30s，55℃30s，72℃60s，循环30次，72℃10min。使用pcr产物纯化试剂盒对扩增得到的dna片段进行产
物回收。
[0038]
以pkk3535质粒为模板，设计并合成与rrnb操纵子前端可以互补结合的29个碱基构成的寡聚核苷酸，通过在寡聚核苷酸5’端连接fam荧光基团、3’端连接dabcyl淬灭基团并通过在其两端增加互补的重复gc的序列使之形成颈环状结构(如图2所示)，使得fam与dabcyl相互靠近，在分子信标单独存在时荧光被淬灭。当分子信标能与大肠杆菌rrna模板特异性的结合后cg序列会被分开，颈环结构发生改变。fam基团远离dabcyl基团，从而激发出荧光信号。通过荧光酶标仪可以检测被激发荧光的信号强度从而检测核糖体rna的表达水平。
[0039]
表1
[0040][0041]
采用0-10μm梯度浓度的m.b.互补dna片段与1.5μm的m.b.进行结合反应，95℃变性2min，45℃退火10min，将反应液移入黑色96孔酶标版，并通过荧光酶标仪检测荧光强度，激发波长为485nm，发射波长520nm。随着互补dna模板浓度的递增，荧光分子信标所发出的荧光信号也呈现递增的趋势，m.b.互补dna模板浓度低于0.01μm，荧光值处于比较低的水平(图3)。为了排除pkk450 dna模板对荧光分子信标有结合作用从而影响荧光信号，以pkk450-dna模板浓度与荧光分子信标结合反应的实验，随着m.b.互补dna浓度的升高，荧光值也逐渐升高，但是当m.b.互补dna浓度小于0.01μm时，荧光值几乎不变，所以在加入模板时根据pkk450-dna的摩尔质量为564093.2g/mol计算并控制其物质的量为0.01μm。后续体外转录实验中dna模板浓度低于0.01μm即可避免dna模板与m.b.相结合产生背景荧光信号。另一方面也说明当转录产物高于0.01μm其与分子信标结合产生荧光信号可以被明显得检出。因此，本实施例中的最低转录产物检测浓度应被认为是0.01μm。
[0042]
进而，制备大肠杆菌体外转录体系，体外转录反应组分如下表：
[0043]
[0044][0045]
将体外转录组分按照每个反应200μl分别移入ep管中，置于37℃温度下进行孵育反应1小时，通过加入20μl的3m醋酸钠，3倍反应体积的100％乙醇和3μl糖原终止体外转录反应；-20℃静置1小时；4℃，12000rcf离心10min，弃上清，使用1ml的80％的冰冷乙醇冲洗沉淀；4℃，12000rcf离心10min，弃上清，待ep管干燥，rna沉降于底部；每管各加18μl的荧光分子信标m.b.buffer(荧光分子信标m.b.buffer组分如表3所示)和2μl浓度为0.01μm的m.b.漩涡震荡后短暂离心，置于95℃变性2min后，45℃退火10min；将反应液移入黑色96孔酶标板内，使用荧光酶标仪读取荧光强度，激发波长为485nm，发射波长520nm。
[0046]
表3
[0047][0048]
对比反应体系中存在和缺失e.coli rna聚合酶对体外转录水平产生的影响，每组各设三个重复；通过对比体外转录体系中存在和缺失rna聚合酶所产生的产物与荧光分子信标结合后产生的荧光强度，可以发现存在rna聚合酶的反应样品可以检测到高强度的荧光信号(参照图4)，信号强度极其显著的高于缺失rna聚合酶的反应样品。
[0049]
在体外转录反应ep管中分别加0ng/μl、0.1ng/μl、1ng/μl、10ng/μl浓度的四种利福平家族类药物各2μl，每组浓度各设三个重复；以此来检测荧光分子信标对体外转录水平。通过对比体外转录体系中存在和缺失rna聚合酶所产生的产物与荧光分子信标结合后产生的荧光强度，可以发现存在rna聚合酶的反应样品可以检测到高强度的荧光信号(参照图4)，信号强度极其显著的高于缺失rna聚合酶的反应样品。
[0050]
进一步地，检测转录抑制剂对体外转录抑制活性，具体操作方式为：在体外转录反应ep管中分别加0ng/μl、0.1ng/μl、1ng/μl、10ng/μl浓度的四种利福平家族类药物(利福昔明、利福布丁、利福平、利福喷丁)各2μl，每组浓度各设三个重复。利福昔明、利福布丁、利福平、利福喷丁对荧光激发影响的检测结果分别如图5-图8所示，在四种转录抑制剂的检测中，随着药物浓度的增加其荧光值均有所下降并且逐级递减，尤其是在10ng/μl浓度下四种药物的荧光值均最低，由此可以证明利福昔明、利福布丁、利福平、利福喷丁都对转录有着
不同程度的抑制作用。其中利福昔明和利福布丁的抑制作用最强并且抑制作用比较规律。
[0051]
另外，本实施还检测了利福平类药物对大肠杆菌d7菌株的最低抑菌浓度：采用微量肉汤稀释法，对e.coli d7 prrn菌株进行四种利福平家族类药物的mic检测，其结果如表4所示。
[0052]
表4
[0053][0054]
将d7菌株浓度调至106cfu/ml,并将药物配置浓度为128μg/ml。在无菌96孔板中，100μl培养基加至1～12孔，吸取浓度为128μg/ml的药物加在第1孔和10孔。从第1孔至第9孔进行二倍倍比稀释，第9孔弃去100μl混合液，最后加入100μl 106cfu/ml的菌液在1～9孔，和12孔中。1～9孔的药物浓度为64～0.25μg/ml。第10孔为药物组照，11孔为培养基组照，12孔为阳性对照。
[0055]
利用微量肉汤稀释法检测了e.coli d7 prrn菌株的最低抑菌浓度，该结果与2.3中的结果可以被认为高度一致。在各种药物的最低抑菌浓度下，体外转录也都恰好为最低抑制转录浓度。其中利福布丁和利福昔明的mic为2μg/ml，相对应的体外转录抑制效果也最显著，而利福喷丁的mic与体外转录结果在四种药物中效果最不显著。
[0056]
综述，本发明设计并合成了可以与大肠杆菌rrna互补的荧光分子信标，利用该分子信标与体外转录产生的rrna进行互补变构，使分子信标3’端的dabcyl淬灭基团远离5’端的fam发荧光基团，激发出可以被荧光酶标仪检测到的荧光信号。这种荧光分子信标最低体外转录产物检测浓度为0.01μm。同时，当体外转录dna模板浓度低于0.01μm，其自身与荧光分子信标相结合产生的背景噪音荧光值不会影响转录产物的检测结果。在建立了体外转录荧光分子信标检测方法的基础上，本发明利用利福平家族四种抗生素作为转录抑制剂，对体外转录进行抑制并检测其抑制活性。与活体e.coli d7 prrn菌株的mic测试结果相比较，其药物抑制转录浓度与最低抑菌浓度相吻合，可以真实的反应细菌受到转录抑制药物作用，抑制生长的最低抑菌浓度。以上结论证明，这种方法可以精确的检测细菌转录抑制剂的活性。另外，由于本发明中采用荧光酶标仪以及96孔板此类高效、快速的检测仪器。因此，可以高通量的检测大量待测样品，对转录抑制类药物的筛选有着重要的应用价值。在此方法基础上可以对抑菌物质的作用机制进行分析，以确定其对细菌转录的影响。
[0057]
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种细菌转录抑制剂抑制大肠杆菌体外转录活性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、制备大肠杆菌体外转录pkk450-dna模板；步骤二、以pkk3535质粒为模板，制备荧光分子信标m.b.；步骤三、制备大肠杆菌体外转录体系，体外转录反应组分如下表：将体外转录组分按照每个反应200μl分别移入ep管中，置于37℃温度下进行孵育反应1小时，通过加入20μl的3m醋酸钠，3倍反应体积的100％乙醇和3μl糖原终止体外转录反应；-20℃静置1小时；4℃，12000rcf离心10min，弃上清，使用1ml的80％的冰冷乙醇冲洗沉淀；4℃，12000rcf离心10min，弃上清，待ep管干燥，rna沉降于底部；每管各加18μl的荧光分子信标m.b.buffer和2μl浓度为0.01μm的m.b.漩涡震荡后短暂离心，置于95℃变性2min后，45℃退火10min；步骤四、检测大肠杆菌转录抑制剂对体外转录抑制活性：在步骤三的体外转录反应ep管中加入大肠杆菌转录抑制剂2μl；然后将反应液移入黑色96孔酶标板内，使用荧光酶标仪读取荧光强度，激发波长为485nm，发射波长520nm。2.根据权利要求1所述的细菌转录抑制剂抑制大肠杆菌体外转录活性的检测方法，其特征在于，所述步骤一具体包括：以含有大肠杆菌rrnb核糖体操纵子的全长以及启动序列的pkk3535质粒为模板，pkk-f与pkk-450r为引物，pkk-f引物的5
’‑3’
端引物序列为：ggcaatgacgccaggagctg，pkk-450r引物的5
’‑3’
端引物序列为：ccccgctgaaagtactttacaacc；对目的片段进行pcr扩增，预混液反应体系：pfu dna聚合酶1μl，10x buffer 10μl，dntps 8μl，上下游引物各4μl，pkk3535质粒10μl，ddh2o 71μl，反应条件：95℃3min，95℃30s，55℃30s，72℃60s，循环30次，72℃10min；使用pcr产物纯化试剂盒对扩增得到的dna片段进行产物回收，获得大肠杆菌体外转录pkk450-dna模板。3.根据权利要求1所述的细菌转录抑制剂抑制大肠杆菌体外转录活性的检测方法，其特征在于，所述步骤二具体包括：
以pkk3535质粒为模板，设计并合成与rrnb操纵子前端可以互补结合的29个碱基构成的寡聚核苷酸，通过在寡聚核苷酸5’端连接fam荧光基团、3’端连接dabcyl淬灭基团并通过在其两端增加互补的重复gc的序列使之形成颈环状结构，使得fam与dabcyl相互靠近，在分子信标单独存在时荧光被淬灭；当分子信标能与大肠杆菌rrna模板特异性的结合后cg序列会被分开，颈环结构发生改变；fam基团远离dabcyl基团，从而激发出荧光信号。4.根据权利要求1所述的细菌转录抑制剂抑制大肠杆菌体外转录活性的检测方法，其特征在于，所述步骤三中，荧光分子信标m.b.buffer组分为：kcl 1m，mgcl
2 10mm，ph＝8的tris-hcl 100μm。

技术总结
本发明公开了一种细菌转录抑制剂抑制大肠杆菌体外转录活性的检测方法，包括：制备大肠杆菌体外转录pKK450-DNA模板；以pKK3535质粒为模板，制备荧光分子信标M.B.；制备大肠杆菌体外转录体系，检测大肠杆菌转录抑制剂对体外转录抑制活性。与现有技术相比，本发明可以精确的检测细菌转录抑制剂的活性；另外，由于本发明中采用荧光酶标仪以及96孔板此类高效、快速的检测仪器，因此，可以高通量的检测大量待测样品，对转录抑制类药物的筛选有着重要的应用价值。在此方法基础上可以对抑菌物质的作用机制进行分析，以确定其对细菌转录的影响。以确定其对细菌转录的影响。以确定其对细菌转录的影响。


技术研发人员：贺承光 周海蒙 陈伟东 王鑫 闫雨欣 孔令聪 马红霞 刘悦华 李昊轩 孙喆
受保护的技术使用者：吉林农业大学
技术研发日：2021.11.24
技术公布日：2022/3/8