一种产酶溶杆菌及其应用
1.本发明属于生物防治
技术领域：
：，尤其涉及一种产酶溶杆菌及其应用。
背景技术：
：：2.目前，玉米(zeamayslinn.)禾本科一年生草本植物，是我国重要的粮-饲-工业原料作物，也是我国种植面积最广泛、土地利用率最大的作物之一，也是云南省种植面积大的作物。云南省可分为四个玉米种植区：滇西北冷凉玉米区、滇中温暖玉米区、滇南暖热玉米区、滇东北温凉玉米区。近年来，鲜食玉米在我省种植面积逐渐扩大，现成为高原特色的重点发展的支柱产业。云南省籽粒玉米的主要病害类型为玉米锈病、玉米灰斑病、玉米大斑病、玉米茎腐病等，而鲜食玉米上主要以玉米大斑病、玉米茎腐病危害较为严重。玉米大斑病是由半知菌亚门大斑凸脐蠕孢(exserohilumturcicum)引起的一种叶斑类病害，近年来由于玉米大斑病菌生理小种变异快、化学防治对环境污染严重等问题，玉米大斑病的危害呈现出明显加重趋势。玉米茎腐病和穗腐病也是我国玉米产区近年来严重流行的病害，大多数研究报道禾谷镰刀菌(fusariummoniliforme)、串珠镰孢菌(fusariummoniliforme)、是引起我国茎腐/穗腐病的主要病原真菌。该病害不仅使玉米产量因果穗腐烂而导致减产，而且该病病原真菌还会产生大量的真菌毒素，降低玉米的品质。此外这些毒素具有强烈的致病、致畸、致癌性，导致人畜疾病的发生，给人畜的生命健康构成严重威胁。3.辣椒作为我国最重要的蔬菜和调味品之一，主要作用为开胃、调节口味，是我国重要的经济作物。随着近年来辛辣食品风俗的传播和辣椒提取物在医疗、保健、美容等方面功能的挖掘，辣椒的市场需求不断扩大。辣椒炭疽病是辣椒生产过程中的三大病害之一，分布广且危害严重，通常减产20％-50％，严重影响辣椒的产量及品质。尖孢炭疽菌(colletotrichumacutatum)是引起辣椒炭疽病致病菌主要真菌。4.十字花科作物包括油菜、大白菜、甘蓝、花椰菜、茎芥菜、芥菜、萝卜、小白菜、瘤芥菜(榨菜)及特种作物板蓝根和山葵等。十字花科作物根肿病是由芸薹根肿菌(plasmodiophorabrassicae)侵染引起的土传病害，该病主要危害十字花科作物的根部。由于该病原菌土壤中存活时间长，传染性强，传播速度快，传播途径多样，使得根肿病的发生越来越严重。十字花科根肿病的发生，严重影响蔬菜产量，极其严重时减产70％-80％。随着国内外对十字花科蔬菜日益增长的需求，十字花科蔬菜的栽培面积不断扩大，导致十字花科蔬菜的连作种植现象越来越普遍，使得土壤中的根肿病病原数量逐年累积，根肿病大面积爆发，适合种植十字花科蔬菜的土地越来越少。5.目前，防治上述病害主要采用农业栽培措施，选用抗病品种及化学药剂防治等措施，但是随着生理小种变异快、化学防治对环境污染严重等问题，导致作物真菌病害防治效果不理想，均有一定的局限性。因此开发玉米大斑病、穗腐病，辣椒炭疽病和十字花科根肿病的生物制剂具有重要的实践意义。6.溶杆菌(lysobacterspp.)属于变形菌门，黄单胞菌目，黄单胞菌科，溶杆菌属的一类革兰氏阴性细菌，在生防微生物领域占据着重要的地位。自1978年建立溶杆菌属，命名为4个种，分别是：产酶溶杆菌(l.enzymogenes)，抗生素溶杆菌(l.antibioticus)，变棕溶杆菌(l.brunescens)和胶状溶杆菌(l.gummosus)。大量国内外研究发现溶杆菌属代谢产物中含有大量的小分子化合物对作物病原真菌、细菌以及线虫都有良好的拮抗作用。如已报道产酶溶杆菌中可产生抗真菌类的环肽类活性物质hsaf，表明产酶溶杆菌属细菌在生物防治方面极具开发潜力；经查阅国内外文献报道，产酶溶杆菌作为生防菌剂的报道很少，且少有制成生物菌剂用于大田防治作物病害。综上所述，开发具有安全、高效、广谱生防潜力的产酶溶杆菌菌株，对于生防溶杆菌资源库的构建，保护生态环境和减少化学农药的使用具有重要意义，同时也可以促进生态农业和绿色农业的发展。7.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：8.(1)由于玉米大斑病菌、蔬菜根肿病生理小种变异快、化学防治对环境污染严重等问题，玉米大斑病的危害呈现出明显加重趋势。9.(2)随着生理小种变异快、化学防治对环境污染严重等问题，导致作物真菌病害防治效果不理想，均有一定的局限性。10.(3)已有产酶溶杆菌多从抑菌谱和防病机制方面进行报道，但从鲜食玉米根际获得未见报道，且少有制备成生物菌剂用于大田防治病害。11.解决以上问题及缺陷的难度为：将产酶溶杆菌经培养发酵，制备成水剂或可湿性粉剂和种子包衣剂，或与有机肥配合使用，易于操作生产。生物制剂作为喷雾和灌根使用，也是农业上常见的使用方法，操作简单，产品方便使用。12.解决以上问题及缺陷的意义为：制备生产的产酶溶杆菌生物菌剂，防控作物主要病害，达到了减肥减药提质增效的目标，促进蔬菜、中药材等产业的绿色发展。同时构建了作物病害绿色防控技术体系，作为绿色产品生产提供新产品、新技术支撑。技术实现要素：13.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种产酶溶杆菌及其应用。14.本发明是这样实现的，产酶溶杆菌bn3-15新菌株，该菌株为本发明从云南省西双版纳傣族自治州鲜食玉米根际土中分离获得的新菌株，其分类命名为产酶溶杆菌，所述产酶溶杆菌bn3-15新菌种已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmccno.21259。15.进一步，所述产酶溶杆菌bn3-15呈高度粘液状，颜色呈奶油状，具有滑行能力，无鞭毛，菌体杆状，菌落呈圆形，边缘光滑。16.本发明的另一目的在于提供一种所述的产酶溶杆菌bn3-15在田间病害防治中的应用，所述病害包括玉米大斑病、辣椒炭疽病、十字花科作物根肿病和三七根腐病。17.进一步，所述产酶溶杆菌bn3-15可制成水剂、可湿性粉剂或包衣剂中的任意一种形式使用。18.进一步，所述产酶溶杆菌bn3-15水剂的制备方法，包括：19.(1)菌种培养20.①复壮培养：将na培养基121℃灭菌30min后加入试管中，做成斜面，接种菌株后，恒温培养箱26℃培养24～48h；21.②菌种摇床扩大培养：将斜面种子接种茄瓶斜面na培养基上，于26℃条件下培养24～48h，获得茄瓶种子；22.(2)发酵23.①种子悬浮液的制备：用灭菌水洗下茄瓶斜面上的菌苔，得到种子悬浮液；24.②接种：将种子悬浮液通过接种口，利用压差接入发酵罐培养基上；25.③液体发酵：发酵罐培养基在接种后，培养36～48h；所述发酵罐培养基的罐温为25～32℃，罐压为0.5kg/cm2，罐内搅拌速度为200r/min，在接种升压过程中，罐压不超过1.5kg/cm2。26.进一步，所述na培养基的配方及处理方法为：葡萄糖l0g，蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，酵母浸膏1g，琼脂粉17g，用蒸馏水补足到1000ml，调节ph＝7.0。27.进一步，所述发酵罐培养基的配方及处理方法为：发酵培养基包含5％蛋白胨、10％玉米粉、20％黄豆粉、2％酵母提取物、20％蔗糖、3％磷酸氢二钾、10％甘油，灭菌前调节ph＝7.0，于121℃灭菌30min。28.进一步，所述产酶溶杆菌菌株bn3-15水剂的使用方法包括喷雾、灌根以及浸种。29.进一步，所述产酶溶杆菌菌株bn3-15包衣剂的制备方法，包括：30.(1)将产酶溶杆菌接种于kb液体培养液，于28℃、160r/min进行摇瓶发酵培养48h制备成发酵液，初始产酶溶杆菌含量≥1×109cfu/ml；31.(2)将聚乙烯醇与壳聚糖混合物、op-10、木质素磺酸钠、黄原胶、丙三醇、曙红混合，搅拌均匀，然后放入研磨机中进行研磨，研磨时间为4～8h，研磨至物料的平均粒径小于5μm，制备成助剂；32.(3)将步骤(1)所得产酶溶杆菌发酵液与步骤(2)所得助剂按体积1：99的比例混匀制得生物型种衣剂。33.本发明的另一目的在于提供一种所述的产酶溶杆菌bn3-15作为生长剂在促进十字花科蔬菜、玉米和三七生长中的应用。34.结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的产酶溶杆菌bn3-15，安全无残留、具有防病促生效果，该菌株分离于云南省西双版纳傣族自治州玉米根际土中；该产酶溶杆菌菌株bn3-15已制成水剂、可湿性粉剂或种子包衣剂，用于玉米、十字花科作物、三七等作物上，田间防治玉米大斑病、辣椒炭疽病、白菜根肿病、三七根腐病等病害。35.本发明提供了一种高效、无毒、无残留，使用简便防治根腐、十字花科蔬菜根肿病等土传病害的生防菌剂，其有效活性成分为产酶溶杆菌bn3-15及其次生代谢产物，该菌株产生的抗菌活性物质，可降解病原菌的细胞壁结构，对引起玉米大斑病、玉米穗腐病、辣椒炭疽病、三七根腐病等病害的病原真菌有强烈的抑制作用。因而具有作为生物防治制剂的开发利用前景。36.本发明提供了一种以产酶溶杆菌(lysobacterenzymogenes)bn3-15菌株及其代谢物为主要活性有效成分的生物制剂，该生防菌对多种病原真菌具有较好的抑制效果，对玉米大斑病、玉米穗腐病、辣椒炭疽病、三七锈斑病和三七根腐病等病原真菌抑制效果可达46.15-68.60％。产酶溶杆菌(lysobacterenzymogenes)bn3-15通过产生次级代谢产物，如葡聚糖酶、蛋白酶、几丁质酶、纤维素酶、热稳定抗真菌因子(heat-stableantifungalfactor，hsaf)等抑菌活性物质，通过降解病原菌细胞壁、抑制病原菌孢子萌发和芽管延伸，影响病原菌的代谢途径，从而实现高效的生防效果。该菌株制备的生物制剂具有抑菌谱广、抑菌能力突出，定殖能力强等优势，而且具有高效、无毒、安全无残留，防病促生效果较好，易于工业化生产的特点，可通过灌根、喷雾、包衣等多种方式施用。经云南农业大学，昆明市寻甸和德宏芒市等地温室和田间防效促生实验表明，该生物制剂防效显著，效果稳定，对十字花科蔬菜根肿病防效可达50.1-77.99％，对玉米大斑病防治效果可达40.42％。且对十字花科蔬菜、玉米、三七有较好的促生作用。37.本发明创造的生物制剂，已与云南省多家微生物菌剂生产企业合作生产，用于联合研发种子包衣剂、生物有机肥等新产品，已广泛用于田间作物真菌病害色防控，在农田减少化学药剂和减少化肥的使用量和残留量，取得了显著的生态和经济效益。附图说明38.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。39.图1是本发明实施例提供的产酶溶杆菌bn3-15水剂的制备方法流程图。40.图2是本发明实施例提供的产酶溶杆菌菌株bn3-15包衣剂的制备方法流程图。具体实施方式41.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。42.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种产酶溶杆菌及其应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。43.本发明实施例提供的产酶溶杆菌为产酶溶杆菌bn3-15菌株，该菌株分离于云南省西双版纳傣族自治州鲜食玉米根际土中，其分类命名为产酶溶杆菌，所述产酶溶杆菌bn3-15已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmccno.21259。44.本发明实施例提供的产酶溶杆菌bn3-15呈高度粘液状，颜色呈奶油状，具有滑行能力，无鞭毛，菌体杆状，菌落呈圆形，边缘光滑。45.如图1所示，本发明实施例提供的产酶溶杆菌bn3-15水剂的制备方法包括：46.s101，复壮培养：将na培养基121℃灭菌30min后加入试管中，做成斜面，接种菌株后，恒温培养箱26℃培养24～48h；47.s102，菌种摇床扩大培养：将斜面种子接种茄瓶斜面na培养基上，于26℃条件下培养24～48h，获得茄瓶种子；48.s103，种子悬浮液的制备：用灭菌水洗下茄瓶斜面上的菌苔，得到种子悬浮液；49.s104，接种：将种子悬浮液通过接种口，利用压差接入发酵罐培养基上；50.s105，液体发酵：发酵罐培养基在接种后，培养36～48h；所述发酵罐培养基的罐温为25～32℃，罐压为0.5kg/cm2，罐内搅拌速度为200r/min，在接种升压过程中，罐压不超过1.5kg/cm2。51.如图2所示，本发明实施例提供的产酶溶杆菌菌株bn3-15包衣剂的制备方法，包括：52.s201，将产酶溶杆菌接种于kb液体培养液，于28℃、160r/min进行摇瓶发酵培养48h制备成发酵液，初始产酶溶杆菌含量≥1×109cfu/ml；53.s202，将聚乙烯醇与壳聚糖混合物、op-10、木质素磺酸钠、黄原胶、丙三醇、曙红混合，搅拌均匀，然后放入研磨机中进行研磨，研磨时间为4～8h，研磨至物料的平均粒径小于5μm，制备成助剂；54.s203，将步骤s201所得产酶溶杆菌发酵液与步骤s202所得助剂按体积1：99的比例混匀制得生物型种衣剂。55.下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步描述。56.实施例1：产酶溶杆菌(lysobacterenzymogenes)bn3-15水剂的制备57.(1)菌种来源：从云南省西双版纳傣族自治州玉米根际土分离产酶溶杆菌(lysobacterenzymogenes)bn3-15。58.(2)菌种培养59.a.试管种培养(以下均为重量百分比)：60.将na培养基放入试管中，做成斜面，接种产酶溶杆菌bn3-15菌株，26℃培养24h。na培养基配制及其灭菌方法如下：蛋白胨5g，蔗糖l0g，酵母粉lg，牛肉浸膏3g，琼脂17-20g，用蒸馏水补足到1000ml，调节ph＝7.0后，121℃灭菌30min。61.b.菌种摇床扩大培养：62.将上述步骤中获得的种子接种茄瓶斜面培养基上(培养基为na培养基，其配方与前述试管种培养相同)，26℃培养48h，获得茄瓶种子。63.(3)发酵：64.具体发酵生产过程如下：65.a.种子悬浮液的制备：用灭菌水洗下茄瓶斜面上的菌苔，得到种子悬浮液。66.b.接种：将种子悬浮液通过接种口，利用压差接入发酵罐(发酵培养基：5％蛋白胨、10％玉米粉、20％黄豆粉、2％酵母提取物、20％蔗糖、3％磷酸氢二钾、10％甘油灭菌前调节ph＝7.0，121℃灭菌30min)。发酵罐的培养温度为25-32℃，罐压为0.5kg/cm2，罐内搅拌速度为200r/min，注意避免污染；升压时罐压不能超过1.5kg/cm2。67.c.液体发酵：发酵罐在接种后，培养36h，至菌数不再增加，立即放罐，经平板计数测定含菌量，含菌量达180亿cfu/ml。68.实施例2：产酶溶杆菌(lysobacterenzymogenes)bn3-15可湿性粉剂的制备69.(1)制备液体生防菌剂：同实施例1，得发酵液；70.(2)添加填充剂：将发酵液压入贮罐，根据以下计算公式加入硅藻土(轻质碳酸钙)作为填充剂，搅拌30min；71.填充剂的加入量(公斤)＝[发酵液菌数(亿/毫升)×放罐体积(升)×收率]/成品菌数-发酵液中的残存物(公斤)。然后经、板框压滤、打浆、干燥、粉碎、制成可湿性粉剂，供大田施用。[0072](3)板框过滤：用2kg/cm2的压力，将物料由贮罐压入板框，通过7号滤布过滤，压力随时调节，使滤液中的含菌量不超过0.2亿/毫升，得滤饼和滤液；[0073](4)打浆：将滤饼卸入打浆罐中，按加入碳酸钙量的8％加入浓乳100号，或按3％加入sds，加入适量的滤液均匀搅拌30min；[0074](5)干燥：将浆液置于60℃以下的烘干房内通风干燥至含水量为5％-8％，得半成品；[0075](6)粉碎：将半成品进行粉碎，粉碎时出料温度≤60℃；[0076](7)成品质量指标测定：含菌量、含水量、悬浮率、细度的测定均参照国家企业标准(q/kwl02-2003)进行，含菌量18亿cfu/g，其余各项指标均符合标准。[0077]实施例3：产酶溶杆菌(lysobacterenzymogenes)bn3-15对玉米大斑病、玉米穗腐病、辣椒炭疽病、三七根腐病的病原真菌离体抑菌实验[0078]1.1供试培养基如下[0079]na培养基(蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，酵母浸膏1g，蔗糖10g，琼脂17g，水1000ml，ph＝7.0)；pda培养基(马铃薯200g，葡萄糖15g，琼脂17g，水1000ml，ph＝7.0)。[0080]1.2供试菌株：产酶溶杆菌(lysobacterenzymogenes)bn3-15；供试病原真菌：玉米大斑病菌(exserohilumturcicum)hxmy13、玉米穗腐病菌(fusariummoniliforme)sf、辣椒炭疽病菌(colletotrichumacutatum)l2-18、三七根腐病菌(fusariumoxysporum)sljd2、三七锈斑病菌(cylindrocarpondestructans)rs006、三七根腐病菌(fusariumsolani)pn21。均由云南农业大学生物多样性与病害控制国家工程中心细菌研究室提供。[0081]1.3实验方法[0082]生防菌和病原真菌的活化：将得到的产酶溶杆菌从保存管中取出20ul加入na培养基中，生长至2-3d后用接种针平板划线，纯化备用。将病原真菌取一小块放入pda培养基中，待长出菌丝后，挑取新鲜无污染的菌丝，接种于新的培养基上备用。[0083]测定方法：对病原真菌抑菌作用的测定：在pda平板中心接种病原真菌菌盘(直径5mm)，两侧2.5cm处接种bn3-15菌株，置于28℃培养箱中，7d后观察抑菌情况。[0084]抑制生长率(％)＝(对照菌落半径-处理菌落半径)/对照菌落半径*100。[0085]1.4试验结果与分析[0086]试验结果如表1[0087]表1产酶溶杆菌bn3-15菌株对不同病原真菌的抑菌效果[0088][0089]注：菌落平均直径为接种后第7d观察结果。[0090]由表1可知，产酶溶杆菌bn3-15对6种病原真菌具有良好的拮抗效果，对玉米大斑病和穗腐病，辣椒炭疽病，三七根腐病和三七锈斑病的病原真菌凸脐蠕孢菌(exserohilumturcicum)hxmy13、禾谷镰刀菌(fusariummoniliforme)sf、尖孢炭疽菌(colletotrichumacutatum)l2-18、尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)sljd2、腐皮镰刀菌(fusariumsolani)pn21、和毁灭柱孢菌(cylindrocarpondestructans)rs006的生长抑制率均超过45％，其中对玉米大斑病的最高达68.60％。[0091]实施例4：产酶溶杆菌(lysobacterenzymogenes)bn3-15对十字花科蔬菜根肿病的控病促生实验[0092]1.实验材料[0093]1.1供试菌剂：产酶溶杆菌bn3-15生防菌剂；[0094]1.2供试培养基：kb液体培养基：蛋白胨20g，甘油10ml，磷酸氢二钾1.5g，七水硫酸镁1.5g，蒸馏水1000ml，ph＝7.0，121℃灭菌15min备用。[0095]1.3供试作物：白菜品种83-1(鲁春白1号)对十字花科蔬菜根肿病表现为感病；[0096]1.4防治对象：十字花科蔬菜根肿病；[0097]1.5试验地点：云南农业大学植物保护学院温室大棚(白菜品种83-1(鲁春白1号)种植于30cm×15cm的育苗盆中，每盆10株。使用播种用消毒干净的培养土，体积比按普通土壤：草炭：蛭石：珍珠岩＝1：2：1：1配制。采用(90×210mm)培养盆，每盆5穴，每穴3粒种子。实验处理为：产酶溶杆菌bn3-15生防菌剂、化学农药氰霜唑和清水接种处理作为阳性和阴性对照，每个处理设置3个重复。)[0098]2.实验方法[0099]2.1病原菌孢子悬浮液的制备[0100]取白菜根肿组织搅碎，8层纱布过滤后离心，先2000rpm离心5min，弃上清液，沉淀后用蒸馏水悬浮后再4000rpm离心10min，重复2次。弃上清液，用蒸馏水悬浮沉淀物，将悬浮液的孢子浓度调至4×107个/g，4℃保存备用。[0101]2.2生防菌剂的制备[0102]将菌株bn3-15在na培养基上活化，于28℃细菌培养箱倒置培养48h，后接种于液体kb培养基，160rpm振荡培养3d，用分光光度计在600nm波长下调整od值到0.5(浓度为107-108cfu/ml)备用。[0103]2.3接种方法[0104]白菜出苗一周后，选择生长一致的白菜，将制备好的根肿病孢子悬浮液(浓度为4×107个/g)对白菜进行灌根，每盆接种的根肿病菌孢子悬浮液用量为10ml，接种病原菌24h后使用产酶溶杆菌bn3-15生防菌剂(浓度为3×108cfu/ml)灌根处理，每盆生防菌剂用量为20ml，于第一次使用生防菌剂灌根后的第7d和14d追施2-3次生防菌剂。于播种后40d进行调查，记录根肿病的发病情况及植株的生理指标，计算并分析结果。[0105]2.4数据调查[0106]于播种后40d分别测量白菜株高、叶片数、叶面积等性状指标，以及记录白菜根肿病的发生情况，计算病情指数和相对防效。[0107]白菜根肿病病情分级标准如下：0：根部无肿瘤，根系发育正常；1级：侧根有小肿瘤；3级：根肿大，其直径小于2倍茎基部；5级：主根肿大，其直径是茎基部的2-3倍；7级：主根肿大，其直径是茎基部的3-4倍；9级：主根肿大，其直径是茎基部的4倍以上或肿大的根部变黑。[0108]病情指数＝[∑(发病级各代表值×各级病株数)/(调查总株数×最高级发病代表值)]×100％[0109]相对防效(％)＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100％。[0110]2.5实验结果与分析[0111]表2产酶溶杆菌(lysobacterenzymogenes)bn3-15防治白菜根肿病效果[0112][0113]从表2结果可知：产酶溶杆菌bn3-15菌剂对白菜根肿病有较好的防治效果，使用产酶溶杆菌bn3-15菌剂处理的根肿病病情指数均低于化学农药氰霜唑处理、无菌水处理，其对根肿病的防治效果高达74.99％，高于氰霜唑处理(66.67％)的防效。[0114]表3产酶溶杆菌(lysobacterenzymogenes)bn3-15对白菜的促生作用[0115][0116][0117]由表3可知bn3-15对白菜的促生效果显著。用bn3-15灌根的处理株高、叶片数、叶面积都高于化学农药氰霜唑处理和无菌水处理，说明bn3-15能很好的促进白菜的生长，增加白菜的株高、叶片数、叶面积。[0118]实施例5：产酶溶杆菌(lysobacterenzymogenes)bn3-15鲜食玉米种子包衣田间控病促生实验[0119]1.实验设置[0120]1.1供试作物：鲜食玉米(双色之星)；[0121]1.2防治对象：玉米大斑病；[0122]1.3实验地点：云南省德宏州芒市鲜食玉米种植基地；[0123]2.实验方法[0124]2.1生防菌剂制备：同实施例4中2.2。[0125]2.2包衣剂制备：聚乙烯醇4g溶于96ml蒸馏水中制备成4％聚乙烯醇溶液；壳聚糖4g溶于96ml蒸馏水中制备成4％壳聚糖溶液；黄原胶2g溶于98ml蒸馏水中制备成2％黄原胶溶液。按4％聚乙烯醇：4％壳聚糖：2％黄原胶＝4：1：1的体积配成混合溶液，放置过夜待溶解后使用。[0126]2.3生物种衣剂的包衣：精选饱满玉米种子，清水中浸泡5-10min，取出玉米种子，除去多余水分，以不滴水为准，再将玉米种子、生物种衣剂按药种体积比100：1置于容器中混匀，按照gb15671标准(药剂包裹种子表面积≥80％)包衣后晾至全干备用。[0127]2.4实验处理：使用产酶溶杆菌bn3-15菌剂对鲜食玉米种子进行包衣处理，申嗪霉素包衣处理的做阳性对照，玉米种子未包衣处理(ck)作为阴性对照。实验共3个处理，每个处理重复3次，共9个小区，四周设置1m的保护行。每个小区面积14m2，每小区种植4行玉米，种植行距为0.45m、株距为0.35m，待出苗后剔除多余的苗，每穴保留2株，约计80株。[0128]2.5数据调查[0129]鲜食玉米种植后分别在苗期、抽穗期调查各处理的出苗率、株高、茎粗、玉米大斑病发生情况。在玉米成熟期进行产量调查；[0130]调查发现芒市鲜食玉米主要病害为玉米大斑病，分级标准如下：[0131]0级：全株叶片无病斑；[0132]1级：全株叶片上有少量病斑，病斑占叶面积少于或等于5％；[0133]3级：全株叶片上有少量病斑，占叶面积6-10％，穗位上部叶片有零星病斑；[0134]5级：全株叶片上病斑较多，占叶面积11-30％，穗位上部叶片有较多病斑；[0135]7级：全株叶片有大量病斑，病斑相连，占叶面积31-70％，下部病叶枯死；[0136]9级：全株叶片基本为病斑覆盖，叶片枯死；[0137]发病率(％)＝发病株数/总株数100％；[0138]病情指数＝[∑(发病级值各级病株数)/(调查总株数最高级发病值)]100％；[0139]防治效果(％)＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100％。[0140]3.实验结果[0141]表4生防菌bn3-15包衣处理鲜食玉米对玉米大斑病的防治效果[0142][0143]由表4可知，使用bn3-15生物型种衣剂包衣后对鲜食玉米大斑病的防效为40.42％，效果好于申嗪霉素包衣处理的8.98％。对照(ck)处理和申嗪霉素包衣处理的玉米发病率和病情指数均高于bn3-15包衣剂处理。说明菌株bn3-15包衣处理鲜食玉米种子对玉米大斑病有较好的病害控制效果。[0144]表5生防菌bn3-15包衣处理对鲜食玉米促生作用[0145][0146]由表5可知，使用bn3-15包衣处理的出苗率为80.28％，明显高于对照(ck)和申嗪霉素包衣的处理。bn3-15包衣处理后的苗期株高和茎粗、抽穗期的株高和茎粗都要高于其他两个处理，说明bn3-15包衣对玉米的生长具有较好的促生效果。[0147]表6生防菌bn3-15包衣处理对鲜食玉米田间产量的影响[0148][0149]生防菌bn3-15包衣处理对鲜食玉米田间产量的影响如表6所示，使用产酶溶杆菌bn3-15包衣处理每亩产量为1098kg,均高于对照(ck)和申嗪霉素包衣处理，与对照处理相比每亩增产22.71％。说明产酶溶杆菌bn3-15包衣后对鲜食玉米增产效果显著。[0150]实施例6：产酶溶杆菌(lysobacterenzymogenes)bn3-15菌剂对三七的田间促生实验[0151]1.实验材料[0152]1.1供试试剂：产酶溶杆菌(lysobacterenzymogenes)bn3-15；[0153]1.2供试作物：一年生三七；[0154]1.3实验地点：云南省昆明市寻甸县大河桥农大基地；[0155]2.实验方法[0156]2.1生防菌剂制备：同实施例4中2.2；[0157]2.2实验处理：共设置3个处理，依次是bn3-15：产酶溶杆菌bn3-15菌剂灌根处理；靠山多霸：靠山多霸药剂稀释1000倍灌根处理；ck：使用清水灌根处理；使用一次性筷子和绳将小区划分为长1.5m宽1.2m的小区，每个处理3个重复。每隔14-15天灌根处理一次，连续处理3次；[0158]2.3数据调查：最后一次灌根90天后，每个小区随机取10株三七(每个处理10×3＝30株)带回实验室，对各处理中的三七植株进行株高、根长、鲜重、干重等指标进行测定。[0159]3.实验结果[0160]表7处理一年三七苗后生理指标测定[0161][0162]不同处理三七株高、叶片数、根长、块根鲜重等生理指标结果见表7。结果显示，使用bn3-15灌根处理三七的株高、叶片数、根长、块根鲜重等指标均高于其对照(ck)和靠山多霸处理，说明产酶溶杆菌bn3-15灌根处理对三七促生作用效果显著。[0163]以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
：的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。当前第1页12当前第1页12
技术特征：
1.一种产酶溶杆菌，其特征在于，所述产酶溶杆菌为产酶溶杆菌bn3-15菌株，所述产酶溶杆菌bn3-15菌株保藏编号为：cgmcc no.21259，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。2.一种如权利要求1所述的产酶溶杆菌bn3-15在田间病害防治中的应用，所述病害包括玉米大斑病、辣椒炭疽病、十字花科作物根肿病和三七根腐病。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产酶溶杆菌bn3-15制成水剂、可湿性粉剂或种子包衣剂中的任意一种形式使用。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产酶溶杆菌菌株bn3-15水剂的使用方法包括喷雾、灌根以及浸种。5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产酶溶杆菌bn3-15水剂的制备方法，包括：(1)菌种培养
①
复壮培养：将na培养基121℃灭菌30min后加入试管中，做成斜面，接种菌株后，恒温培养箱26℃培养24～48h；
②
菌种摇床扩大培养：将斜面种子接种茄瓶斜面na培养基上，于26℃条件下培养24～48h，获得茄瓶种子；(2)发酵
①
种子悬浮液的制备：用灭菌水洗下茄瓶斜面上的菌苔，得到种子悬浮液；
②
接种：将种子悬浮液通过接种口，利用压差接入发酵罐培养基上；
③
液体发酵：发酵罐培养基在接种后，培养36～48h；所述发酵罐培养基的罐温为25～32℃，罐压为0.5kg/cm2，罐内搅拌速度为200r/min，在接种升压过程中，罐压不超过1.5kg/cm2。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述na培养基的配方及处理方法为：葡萄糖l0g，蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，酵母浸膏1g，琼脂粉17g，用蒸馏水补足到1000ml，调节ph＝7.0。7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述发酵罐培养基的配方及处理方法为：发酵培养基包含5％蛋白胨、10％玉米粉、20％黄豆粉、2％酵母提取物、20％蔗糖、3％磷酸氢二钾、10％甘油，灭菌前调节ph＝7.0，于121℃灭菌30min。8.如权利要求5所述的产酶溶杆菌bn3-15在田间病害防治中的应用，其特征在于，所述产酶溶杆菌菌株bn3-15包衣剂的制备方法，包括：(1)将产酶溶杆菌接种于kb液体培养液，于28℃、160r/min进行摇瓶发酵培养48h制备成发酵液，初始产酶溶杆菌含量≥1
×
109cfu/ml；(2)将聚乙烯醇与壳聚糖混合物、木质素磺酸钠、黄原胶、丙三醇、曙红混合，搅拌均匀，然后放入研磨机中进行研磨，研磨时间为4～8h，研磨至物料的平均粒径小于5μm，制备成助剂；(3)将步骤(1)所得产酶溶杆菌发酵液与步骤(2)所得助剂按体积1：99的比例混匀制得生物型种衣剂。9.一种如权利要求1所述的产酶溶杆菌作为生长剂在促进十字花科蔬菜、玉米和三七生长中的应用。
技术总结
本发明属于生物防治技术领域，公开了一种产酶溶杆菌及其应用，所述产酶溶杆菌为产酶溶杆菌BN3-15菌株，该菌株分离于云南省西双版纳傣族自治州鲜食玉米根际土中，其分类命名为产酶溶杆菌，所述产酶溶杆菌BN3-15已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.21259。本发明提供的产酶溶杆菌BN3-15，安全无残留、具有防病促生效果，可制成水剂、可湿性粉剂或种子包衣剂，用于田间防治玉米大斑病、辣椒炭疽病、白菜根肿病、三七根腐病等病害。本发明提供的生物制剂综合性状较好，对真菌病害的防效显著，有助于减少化学药剂在农产品中的使用量和残留量，使用更安全，且易于工业化生产。且易于工业化生产。且易于工业化生产。
技术研发人员：魏兰芳 姬广海 代真林 汪娅婷
受保护的技术使用者：云南农业大学
技术研发日：2021.06.08
技术公布日：2022/3/8
技术领域：
：，尤其涉及一种产酶溶杆菌及其应用。
背景技术：
：：2.目前，玉米(zeamayslinn.)禾本科一年生草本植物，是我国重要的粮-饲-工业原料作物，也是我国种植面积最广泛、土地利用率最大的作物之一，也是云南省种植面积大的作物。云南省可分为四个玉米种植区：滇西北冷凉玉米区、滇中温暖玉米区、滇南暖热玉米区、滇东北温凉玉米区。近年来，鲜食玉米在我省种植面积逐渐扩大，现成为高原特色的重点发展的支柱产业。云南省籽粒玉米的主要病害类型为玉米锈病、玉米灰斑病、玉米大斑病、玉米茎腐病等，而鲜食玉米上主要以玉米大斑病、玉米茎腐病危害较为严重。玉米大斑病是由半知菌亚门大斑凸脐蠕孢(exserohilumturcicum)引起的一种叶斑类病害，近年来由于玉米大斑病菌生理小种变异快、化学防治对环境污染严重等问题，玉米大斑病的危害呈现出明显加重趋势。玉米茎腐病和穗腐病也是我国玉米产区近年来严重流行的病害，大多数研究报道禾谷镰刀菌(fusariummoniliforme)、串珠镰孢菌(fusariummoniliforme)、是引起我国茎腐/穗腐病的主要病原真菌。该病害不仅使玉米产量因果穗腐烂而导致减产，而且该病病原真菌还会产生大量的真菌毒素，降低玉米的品质。此外这些毒素具有强烈的致病、致畸、致癌性，导致人畜疾病的发生，给人畜的生命健康构成严重威胁。3.辣椒作为我国最重要的蔬菜和调味品之一，主要作用为开胃、调节口味，是我国重要的经济作物。随着近年来辛辣食品风俗的传播和辣椒提取物在医疗、保健、美容等方面功能的挖掘，辣椒的市场需求不断扩大。辣椒炭疽病是辣椒生产过程中的三大病害之一，分布广且危害严重，通常减产20％-50％，严重影响辣椒的产量及品质。尖孢炭疽菌(colletotrichumacutatum)是引起辣椒炭疽病致病菌主要真菌。4.十字花科作物包括油菜、大白菜、甘蓝、花椰菜、茎芥菜、芥菜、萝卜、小白菜、瘤芥菜(榨菜)及特种作物板蓝根和山葵等。十字花科作物根肿病是由芸薹根肿菌(plasmodiophorabrassicae)侵染引起的土传病害，该病主要危害十字花科作物的根部。由于该病原菌土壤中存活时间长，传染性强，传播速度快，传播途径多样，使得根肿病的发生越来越严重。十字花科根肿病的发生，严重影响蔬菜产量，极其严重时减产70％-80％。随着国内外对十字花科蔬菜日益增长的需求，十字花科蔬菜的栽培面积不断扩大，导致十字花科蔬菜的连作种植现象越来越普遍，使得土壤中的根肿病病原数量逐年累积，根肿病大面积爆发，适合种植十字花科蔬菜的土地越来越少。5.目前，防治上述病害主要采用农业栽培措施，选用抗病品种及化学药剂防治等措施，但是随着生理小种变异快、化学防治对环境污染严重等问题，导致作物真菌病害防治效果不理想，均有一定的局限性。因此开发玉米大斑病、穗腐病，辣椒炭疽病和十字花科根肿病的生物制剂具有重要的实践意义。6.溶杆菌(lysobacterspp.)属于变形菌门，黄单胞菌目，黄单胞菌科，溶杆菌属的一类革兰氏阴性细菌，在生防微生物领域占据着重要的地位。自1978年建立溶杆菌属，命名为4个种，分别是：产酶溶杆菌(l.enzymogenes)，抗生素溶杆菌(l.antibioticus)，变棕溶杆菌(l.brunescens)和胶状溶杆菌(l.gummosus)。大量国内外研究发现溶杆菌属代谢产物中含有大量的小分子化合物对作物病原真菌、细菌以及线虫都有良好的拮抗作用。如已报道产酶溶杆菌中可产生抗真菌类的环肽类活性物质hsaf，表明产酶溶杆菌属细菌在生物防治方面极具开发潜力；经查阅国内外文献报道，产酶溶杆菌作为生防菌剂的报道很少，且少有制成生物菌剂用于大田防治作物病害。综上所述，开发具有安全、高效、广谱生防潜力的产酶溶杆菌菌株，对于生防溶杆菌资源库的构建，保护生态环境和减少化学农药的使用具有重要意义，同时也可以促进生态农业和绿色农业的发展。7.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：8.(1)由于玉米大斑病菌、蔬菜根肿病生理小种变异快、化学防治对环境污染严重等问题，玉米大斑病的危害呈现出明显加重趋势。9.(2)随着生理小种变异快、化学防治对环境污染严重等问题，导致作物真菌病害防治效果不理想，均有一定的局限性。10.(3)已有产酶溶杆菌多从抑菌谱和防病机制方面进行报道，但从鲜食玉米根际获得未见报道，且少有制备成生物菌剂用于大田防治病害。11.解决以上问题及缺陷的难度为：将产酶溶杆菌经培养发酵，制备成水剂或可湿性粉剂和种子包衣剂，或与有机肥配合使用，易于操作生产。生物制剂作为喷雾和灌根使用，也是农业上常见的使用方法，操作简单，产品方便使用。12.解决以上问题及缺陷的意义为：制备生产的产酶溶杆菌生物菌剂，防控作物主要病害，达到了减肥减药提质增效的目标，促进蔬菜、中药材等产业的绿色发展。同时构建了作物病害绿色防控技术体系，作为绿色产品生产提供新产品、新技术支撑。技术实现要素：13.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种产酶溶杆菌及其应用。14.本发明是这样实现的，产酶溶杆菌bn3-15新菌株，该菌株为本发明从云南省西双版纳傣族自治州鲜食玉米根际土中分离获得的新菌株，其分类命名为产酶溶杆菌，所述产酶溶杆菌bn3-15新菌种已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmccno.21259。15.进一步，所述产酶溶杆菌bn3-15呈高度粘液状，颜色呈奶油状，具有滑行能力，无鞭毛，菌体杆状，菌落呈圆形，边缘光滑。16.本发明的另一目的在于提供一种所述的产酶溶杆菌bn3-15在田间病害防治中的应用，所述病害包括玉米大斑病、辣椒炭疽病、十字花科作物根肿病和三七根腐病。17.进一步，所述产酶溶杆菌bn3-15可制成水剂、可湿性粉剂或包衣剂中的任意一种形式使用。18.进一步，所述产酶溶杆菌bn3-15水剂的制备方法，包括：19.(1)菌种培养20.①复壮培养：将na培养基121℃灭菌30min后加入试管中，做成斜面，接种菌株后，恒温培养箱26℃培养24～48h；21.②菌种摇床扩大培养：将斜面种子接种茄瓶斜面na培养基上，于26℃条件下培养24～48h，获得茄瓶种子；22.(2)发酵23.①种子悬浮液的制备：用灭菌水洗下茄瓶斜面上的菌苔，得到种子悬浮液；24.②接种：将种子悬浮液通过接种口，利用压差接入发酵罐培养基上；25.③液体发酵：发酵罐培养基在接种后，培养36～48h；所述发酵罐培养基的罐温为25～32℃，罐压为0.5kg/cm2，罐内搅拌速度为200r/min，在接种升压过程中，罐压不超过1.5kg/cm2。26.进一步，所述na培养基的配方及处理方法为：葡萄糖l0g，蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，酵母浸膏1g，琼脂粉17g，用蒸馏水补足到1000ml，调节ph＝7.0。27.进一步，所述发酵罐培养基的配方及处理方法为：发酵培养基包含5％蛋白胨、10％玉米粉、20％黄豆粉、2％酵母提取物、20％蔗糖、3％磷酸氢二钾、10％甘油，灭菌前调节ph＝7.0，于121℃灭菌30min。28.进一步，所述产酶溶杆菌菌株bn3-15水剂的使用方法包括喷雾、灌根以及浸种。29.进一步，所述产酶溶杆菌菌株bn3-15包衣剂的制备方法，包括：30.(1)将产酶溶杆菌接种于kb液体培养液，于28℃、160r/min进行摇瓶发酵培养48h制备成发酵液，初始产酶溶杆菌含量≥1×109cfu/ml；31.(2)将聚乙烯醇与壳聚糖混合物、op-10、木质素磺酸钠、黄原胶、丙三醇、曙红混合，搅拌均匀，然后放入研磨机中进行研磨，研磨时间为4～8h，研磨至物料的平均粒径小于5μm，制备成助剂；32.(3)将步骤(1)所得产酶溶杆菌发酵液与步骤(2)所得助剂按体积1：99的比例混匀制得生物型种衣剂。33.本发明的另一目的在于提供一种所述的产酶溶杆菌bn3-15作为生长剂在促进十字花科蔬菜、玉米和三七生长中的应用。34.结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的产酶溶杆菌bn3-15，安全无残留、具有防病促生效果，该菌株分离于云南省西双版纳傣族自治州玉米根际土中；该产酶溶杆菌菌株bn3-15已制成水剂、可湿性粉剂或种子包衣剂，用于玉米、十字花科作物、三七等作物上，田间防治玉米大斑病、辣椒炭疽病、白菜根肿病、三七根腐病等病害。35.本发明提供了一种高效、无毒、无残留，使用简便防治根腐、十字花科蔬菜根肿病等土传病害的生防菌剂，其有效活性成分为产酶溶杆菌bn3-15及其次生代谢产物，该菌株产生的抗菌活性物质，可降解病原菌的细胞壁结构，对引起玉米大斑病、玉米穗腐病、辣椒炭疽病、三七根腐病等病害的病原真菌有强烈的抑制作用。因而具有作为生物防治制剂的开发利用前景。36.本发明提供了一种以产酶溶杆菌(lysobacterenzymogenes)bn3-15菌株及其代谢物为主要活性有效成分的生物制剂，该生防菌对多种病原真菌具有较好的抑制效果，对玉米大斑病、玉米穗腐病、辣椒炭疽病、三七锈斑病和三七根腐病等病原真菌抑制效果可达46.15-68.60％。产酶溶杆菌(lysobacterenzymogenes)bn3-15通过产生次级代谢产物，如葡聚糖酶、蛋白酶、几丁质酶、纤维素酶、热稳定抗真菌因子(heat-stableantifungalfactor，hsaf)等抑菌活性物质，通过降解病原菌细胞壁、抑制病原菌孢子萌发和芽管延伸，影响病原菌的代谢途径，从而实现高效的生防效果。该菌株制备的生物制剂具有抑菌谱广、抑菌能力突出，定殖能力强等优势，而且具有高效、无毒、安全无残留，防病促生效果较好，易于工业化生产的特点，可通过灌根、喷雾、包衣等多种方式施用。经云南农业大学，昆明市寻甸和德宏芒市等地温室和田间防效促生实验表明，该生物制剂防效显著，效果稳定，对十字花科蔬菜根肿病防效可达50.1-77.99％，对玉米大斑病防治效果可达40.42％。且对十字花科蔬菜、玉米、三七有较好的促生作用。37.本发明创造的生物制剂，已与云南省多家微生物菌剂生产企业合作生产，用于联合研发种子包衣剂、生物有机肥等新产品，已广泛用于田间作物真菌病害色防控，在农田减少化学药剂和减少化肥的使用量和残留量，取得了显著的生态和经济效益。附图说明38.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。39.图1是本发明实施例提供的产酶溶杆菌bn3-15水剂的制备方法流程图。40.图2是本发明实施例提供的产酶溶杆菌菌株bn3-15包衣剂的制备方法流程图。具体实施方式41.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。42.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种产酶溶杆菌及其应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。43.本发明实施例提供的产酶溶杆菌为产酶溶杆菌bn3-15菌株，该菌株分离于云南省西双版纳傣族自治州鲜食玉米根际土中，其分类命名为产酶溶杆菌，所述产酶溶杆菌bn3-15已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmccno.21259。44.本发明实施例提供的产酶溶杆菌bn3-15呈高度粘液状，颜色呈奶油状，具有滑行能力，无鞭毛，菌体杆状，菌落呈圆形，边缘光滑。45.如图1所示，本发明实施例提供的产酶溶杆菌bn3-15水剂的制备方法包括：46.s101，复壮培养：将na培养基121℃灭菌30min后加入试管中，做成斜面，接种菌株后，恒温培养箱26℃培养24～48h；47.s102，菌种摇床扩大培养：将斜面种子接种茄瓶斜面na培养基上，于26℃条件下培养24～48h，获得茄瓶种子；48.s103，种子悬浮液的制备：用灭菌水洗下茄瓶斜面上的菌苔，得到种子悬浮液；49.s104，接种：将种子悬浮液通过接种口，利用压差接入发酵罐培养基上；50.s105，液体发酵：发酵罐培养基在接种后，培养36～48h；所述发酵罐培养基的罐温为25～32℃，罐压为0.5kg/cm2，罐内搅拌速度为200r/min，在接种升压过程中，罐压不超过1.5kg/cm2。51.如图2所示，本发明实施例提供的产酶溶杆菌菌株bn3-15包衣剂的制备方法，包括：52.s201，将产酶溶杆菌接种于kb液体培养液，于28℃、160r/min进行摇瓶发酵培养48h制备成发酵液，初始产酶溶杆菌含量≥1×109cfu/ml；53.s202，将聚乙烯醇与壳聚糖混合物、op-10、木质素磺酸钠、黄原胶、丙三醇、曙红混合，搅拌均匀，然后放入研磨机中进行研磨，研磨时间为4～8h，研磨至物料的平均粒径小于5μm，制备成助剂；54.s203，将步骤s201所得产酶溶杆菌发酵液与步骤s202所得助剂按体积1：99的比例混匀制得生物型种衣剂。55.下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步描述。56.实施例1：产酶溶杆菌(lysobacterenzymogenes)bn3-15水剂的制备57.(1)菌种来源：从云南省西双版纳傣族自治州玉米根际土分离产酶溶杆菌(lysobacterenzymogenes)bn3-15。58.(2)菌种培养59.a.试管种培养(以下均为重量百分比)：60.将na培养基放入试管中，做成斜面，接种产酶溶杆菌bn3-15菌株，26℃培养24h。na培养基配制及其灭菌方法如下：蛋白胨5g，蔗糖l0g，酵母粉lg，牛肉浸膏3g，琼脂17-20g，用蒸馏水补足到1000ml，调节ph＝7.0后，121℃灭菌30min。61.b.菌种摇床扩大培养：62.将上述步骤中获得的种子接种茄瓶斜面培养基上(培养基为na培养基，其配方与前述试管种培养相同)，26℃培养48h，获得茄瓶种子。63.(3)发酵：64.具体发酵生产过程如下：65.a.种子悬浮液的制备：用灭菌水洗下茄瓶斜面上的菌苔，得到种子悬浮液。66.b.接种：将种子悬浮液通过接种口，利用压差接入发酵罐(发酵培养基：5％蛋白胨、10％玉米粉、20％黄豆粉、2％酵母提取物、20％蔗糖、3％磷酸氢二钾、10％甘油灭菌前调节ph＝7.0，121℃灭菌30min)。发酵罐的培养温度为25-32℃，罐压为0.5kg/cm2，罐内搅拌速度为200r/min，注意避免污染；升压时罐压不能超过1.5kg/cm2。67.c.液体发酵：发酵罐在接种后，培养36h，至菌数不再增加，立即放罐，经平板计数测定含菌量，含菌量达180亿cfu/ml。68.实施例2：产酶溶杆菌(lysobacterenzymogenes)bn3-15可湿性粉剂的制备69.(1)制备液体生防菌剂：同实施例1，得发酵液；70.(2)添加填充剂：将发酵液压入贮罐，根据以下计算公式加入硅藻土(轻质碳酸钙)作为填充剂，搅拌30min；71.填充剂的加入量(公斤)＝[发酵液菌数(亿/毫升)×放罐体积(升)×收率]/成品菌数-发酵液中的残存物(公斤)。然后经、板框压滤、打浆、干燥、粉碎、制成可湿性粉剂，供大田施用。[0072](3)板框过滤：用2kg/cm2的压力，将物料由贮罐压入板框，通过7号滤布过滤，压力随时调节，使滤液中的含菌量不超过0.2亿/毫升，得滤饼和滤液；[0073](4)打浆：将滤饼卸入打浆罐中，按加入碳酸钙量的8％加入浓乳100号，或按3％加入sds，加入适量的滤液均匀搅拌30min；[0074](5)干燥：将浆液置于60℃以下的烘干房内通风干燥至含水量为5％-8％，得半成品；[0075](6)粉碎：将半成品进行粉碎，粉碎时出料温度≤60℃；[0076](7)成品质量指标测定：含菌量、含水量、悬浮率、细度的测定均参照国家企业标准(q/kwl02-2003)进行，含菌量18亿cfu/g，其余各项指标均符合标准。[0077]实施例3：产酶溶杆菌(lysobacterenzymogenes)bn3-15对玉米大斑病、玉米穗腐病、辣椒炭疽病、三七根腐病的病原真菌离体抑菌实验[0078]1.1供试培养基如下[0079]na培养基(蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，酵母浸膏1g，蔗糖10g，琼脂17g，水1000ml，ph＝7.0)；pda培养基(马铃薯200g，葡萄糖15g，琼脂17g，水1000ml，ph＝7.0)。[0080]1.2供试菌株：产酶溶杆菌(lysobacterenzymogenes)bn3-15；供试病原真菌：玉米大斑病菌(exserohilumturcicum)hxmy13、玉米穗腐病菌(fusariummoniliforme)sf、辣椒炭疽病菌(colletotrichumacutatum)l2-18、三七根腐病菌(fusariumoxysporum)sljd2、三七锈斑病菌(cylindrocarpondestructans)rs006、三七根腐病菌(fusariumsolani)pn21。均由云南农业大学生物多样性与病害控制国家工程中心细菌研究室提供。[0081]1.3实验方法[0082]生防菌和病原真菌的活化：将得到的产酶溶杆菌从保存管中取出20ul加入na培养基中，生长至2-3d后用接种针平板划线，纯化备用。将病原真菌取一小块放入pda培养基中，待长出菌丝后，挑取新鲜无污染的菌丝，接种于新的培养基上备用。[0083]测定方法：对病原真菌抑菌作用的测定：在pda平板中心接种病原真菌菌盘(直径5mm)，两侧2.5cm处接种bn3-15菌株，置于28℃培养箱中，7d后观察抑菌情况。[0084]抑制生长率(％)＝(对照菌落半径-处理菌落半径)/对照菌落半径*100。[0085]1.4试验结果与分析[0086]试验结果如表1[0087]表1产酶溶杆菌bn3-15菌株对不同病原真菌的抑菌效果[0088][0089]注：菌落平均直径为接种后第7d观察结果。[0090]由表1可知，产酶溶杆菌bn3-15对6种病原真菌具有良好的拮抗效果，对玉米大斑病和穗腐病，辣椒炭疽病，三七根腐病和三七锈斑病的病原真菌凸脐蠕孢菌(exserohilumturcicum)hxmy13、禾谷镰刀菌(fusariummoniliforme)sf、尖孢炭疽菌(colletotrichumacutatum)l2-18、尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)sljd2、腐皮镰刀菌(fusariumsolani)pn21、和毁灭柱孢菌(cylindrocarpondestructans)rs006的生长抑制率均超过45％，其中对玉米大斑病的最高达68.60％。[0091]实施例4：产酶溶杆菌(lysobacterenzymogenes)bn3-15对十字花科蔬菜根肿病的控病促生实验[0092]1.实验材料[0093]1.1供试菌剂：产酶溶杆菌bn3-15生防菌剂；[0094]1.2供试培养基：kb液体培养基：蛋白胨20g，甘油10ml，磷酸氢二钾1.5g，七水硫酸镁1.5g，蒸馏水1000ml，ph＝7.0，121℃灭菌15min备用。[0095]1.3供试作物：白菜品种83-1(鲁春白1号)对十字花科蔬菜根肿病表现为感病；[0096]1.4防治对象：十字花科蔬菜根肿病；[0097]1.5试验地点：云南农业大学植物保护学院温室大棚(白菜品种83-1(鲁春白1号)种植于30cm×15cm的育苗盆中，每盆10株。使用播种用消毒干净的培养土，体积比按普通土壤：草炭：蛭石：珍珠岩＝1：2：1：1配制。采用(90×210mm)培养盆，每盆5穴，每穴3粒种子。实验处理为：产酶溶杆菌bn3-15生防菌剂、化学农药氰霜唑和清水接种处理作为阳性和阴性对照，每个处理设置3个重复。)[0098]2.实验方法[0099]2.1病原菌孢子悬浮液的制备[0100]取白菜根肿组织搅碎，8层纱布过滤后离心，先2000rpm离心5min，弃上清液，沉淀后用蒸馏水悬浮后再4000rpm离心10min，重复2次。弃上清液，用蒸馏水悬浮沉淀物，将悬浮液的孢子浓度调至4×107个/g，4℃保存备用。[0101]2.2生防菌剂的制备[0102]将菌株bn3-15在na培养基上活化，于28℃细菌培养箱倒置培养48h，后接种于液体kb培养基，160rpm振荡培养3d，用分光光度计在600nm波长下调整od值到0.5(浓度为107-108cfu/ml)备用。[0103]2.3接种方法[0104]白菜出苗一周后，选择生长一致的白菜，将制备好的根肿病孢子悬浮液(浓度为4×107个/g)对白菜进行灌根，每盆接种的根肿病菌孢子悬浮液用量为10ml，接种病原菌24h后使用产酶溶杆菌bn3-15生防菌剂(浓度为3×108cfu/ml)灌根处理，每盆生防菌剂用量为20ml，于第一次使用生防菌剂灌根后的第7d和14d追施2-3次生防菌剂。于播种后40d进行调查，记录根肿病的发病情况及植株的生理指标，计算并分析结果。[0105]2.4数据调查[0106]于播种后40d分别测量白菜株高、叶片数、叶面积等性状指标，以及记录白菜根肿病的发生情况，计算病情指数和相对防效。[0107]白菜根肿病病情分级标准如下：0：根部无肿瘤，根系发育正常；1级：侧根有小肿瘤；3级：根肿大，其直径小于2倍茎基部；5级：主根肿大，其直径是茎基部的2-3倍；7级：主根肿大，其直径是茎基部的3-4倍；9级：主根肿大，其直径是茎基部的4倍以上或肿大的根部变黑。[0108]病情指数＝[∑(发病级各代表值×各级病株数)/(调查总株数×最高级发病代表值)]×100％[0109]相对防效(％)＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100％。[0110]2.5实验结果与分析[0111]表2产酶溶杆菌(lysobacterenzymogenes)bn3-15防治白菜根肿病效果[0112][0113]从表2结果可知：产酶溶杆菌bn3-15菌剂对白菜根肿病有较好的防治效果，使用产酶溶杆菌bn3-15菌剂处理的根肿病病情指数均低于化学农药氰霜唑处理、无菌水处理，其对根肿病的防治效果高达74.99％，高于氰霜唑处理(66.67％)的防效。[0114]表3产酶溶杆菌(lysobacterenzymogenes)bn3-15对白菜的促生作用[0115][0116][0117]由表3可知bn3-15对白菜的促生效果显著。用bn3-15灌根的处理株高、叶片数、叶面积都高于化学农药氰霜唑处理和无菌水处理，说明bn3-15能很好的促进白菜的生长，增加白菜的株高、叶片数、叶面积。[0118]实施例5：产酶溶杆菌(lysobacterenzymogenes)bn3-15鲜食玉米种子包衣田间控病促生实验[0119]1.实验设置[0120]1.1供试作物：鲜食玉米(双色之星)；[0121]1.2防治对象：玉米大斑病；[0122]1.3实验地点：云南省德宏州芒市鲜食玉米种植基地；[0123]2.实验方法[0124]2.1生防菌剂制备：同实施例4中2.2。[0125]2.2包衣剂制备：聚乙烯醇4g溶于96ml蒸馏水中制备成4％聚乙烯醇溶液；壳聚糖4g溶于96ml蒸馏水中制备成4％壳聚糖溶液；黄原胶2g溶于98ml蒸馏水中制备成2％黄原胶溶液。按4％聚乙烯醇：4％壳聚糖：2％黄原胶＝4：1：1的体积配成混合溶液，放置过夜待溶解后使用。[0126]2.3生物种衣剂的包衣：精选饱满玉米种子，清水中浸泡5-10min，取出玉米种子，除去多余水分，以不滴水为准，再将玉米种子、生物种衣剂按药种体积比100：1置于容器中混匀，按照gb15671标准(药剂包裹种子表面积≥80％)包衣后晾至全干备用。[0127]2.4实验处理：使用产酶溶杆菌bn3-15菌剂对鲜食玉米种子进行包衣处理，申嗪霉素包衣处理的做阳性对照，玉米种子未包衣处理(ck)作为阴性对照。实验共3个处理，每个处理重复3次，共9个小区，四周设置1m的保护行。每个小区面积14m2，每小区种植4行玉米，种植行距为0.45m、株距为0.35m，待出苗后剔除多余的苗，每穴保留2株，约计80株。[0128]2.5数据调查[0129]鲜食玉米种植后分别在苗期、抽穗期调查各处理的出苗率、株高、茎粗、玉米大斑病发生情况。在玉米成熟期进行产量调查；[0130]调查发现芒市鲜食玉米主要病害为玉米大斑病，分级标准如下：[0131]0级：全株叶片无病斑；[0132]1级：全株叶片上有少量病斑，病斑占叶面积少于或等于5％；[0133]3级：全株叶片上有少量病斑，占叶面积6-10％，穗位上部叶片有零星病斑；[0134]5级：全株叶片上病斑较多，占叶面积11-30％，穗位上部叶片有较多病斑；[0135]7级：全株叶片有大量病斑，病斑相连，占叶面积31-70％，下部病叶枯死；[0136]9级：全株叶片基本为病斑覆盖，叶片枯死；[0137]发病率(％)＝发病株数/总株数100％；[0138]病情指数＝[∑(发病级值各级病株数)/(调查总株数最高级发病值)]100％；[0139]防治效果(％)＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100％。[0140]3.实验结果[0141]表4生防菌bn3-15包衣处理鲜食玉米对玉米大斑病的防治效果[0142][0143]由表4可知，使用bn3-15生物型种衣剂包衣后对鲜食玉米大斑病的防效为40.42％，效果好于申嗪霉素包衣处理的8.98％。对照(ck)处理和申嗪霉素包衣处理的玉米发病率和病情指数均高于bn3-15包衣剂处理。说明菌株bn3-15包衣处理鲜食玉米种子对玉米大斑病有较好的病害控制效果。[0144]表5生防菌bn3-15包衣处理对鲜食玉米促生作用[0145][0146]由表5可知，使用bn3-15包衣处理的出苗率为80.28％，明显高于对照(ck)和申嗪霉素包衣的处理。bn3-15包衣处理后的苗期株高和茎粗、抽穗期的株高和茎粗都要高于其他两个处理，说明bn3-15包衣对玉米的生长具有较好的促生效果。[0147]表6生防菌bn3-15包衣处理对鲜食玉米田间产量的影响[0148][0149]生防菌bn3-15包衣处理对鲜食玉米田间产量的影响如表6所示，使用产酶溶杆菌bn3-15包衣处理每亩产量为1098kg,均高于对照(ck)和申嗪霉素包衣处理，与对照处理相比每亩增产22.71％。说明产酶溶杆菌bn3-15包衣后对鲜食玉米增产效果显著。[0150]实施例6：产酶溶杆菌(lysobacterenzymogenes)bn3-15菌剂对三七的田间促生实验[0151]1.实验材料[0152]1.1供试试剂：产酶溶杆菌(lysobacterenzymogenes)bn3-15；[0153]1.2供试作物：一年生三七；[0154]1.3实验地点：云南省昆明市寻甸县大河桥农大基地；[0155]2.实验方法[0156]2.1生防菌剂制备：同实施例4中2.2；[0157]2.2实验处理：共设置3个处理，依次是bn3-15：产酶溶杆菌bn3-15菌剂灌根处理；靠山多霸：靠山多霸药剂稀释1000倍灌根处理；ck：使用清水灌根处理；使用一次性筷子和绳将小区划分为长1.5m宽1.2m的小区，每个处理3个重复。每隔14-15天灌根处理一次，连续处理3次；[0158]2.3数据调查：最后一次灌根90天后，每个小区随机取10株三七(每个处理10×3＝30株)带回实验室，对各处理中的三七植株进行株高、根长、鲜重、干重等指标进行测定。[0159]3.实验结果[0160]表7处理一年三七苗后生理指标测定[0161][0162]不同处理三七株高、叶片数、根长、块根鲜重等生理指标结果见表7。结果显示，使用bn3-15灌根处理三七的株高、叶片数、根长、块根鲜重等指标均高于其对照(ck)和靠山多霸处理，说明产酶溶杆菌bn3-15灌根处理对三七促生作用效果显著。[0163]以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
：的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。当前第1页12当前第1页12
技术特征：
1.一种产酶溶杆菌，其特征在于，所述产酶溶杆菌为产酶溶杆菌bn3-15菌株，所述产酶溶杆菌bn3-15菌株保藏编号为：cgmcc no.21259，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。2.一种如权利要求1所述的产酶溶杆菌bn3-15在田间病害防治中的应用，所述病害包括玉米大斑病、辣椒炭疽病、十字花科作物根肿病和三七根腐病。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产酶溶杆菌bn3-15制成水剂、可湿性粉剂或种子包衣剂中的任意一种形式使用。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产酶溶杆菌菌株bn3-15水剂的使用方法包括喷雾、灌根以及浸种。5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产酶溶杆菌bn3-15水剂的制备方法，包括：(1)菌种培养
①
复壮培养：将na培养基121℃灭菌30min后加入试管中，做成斜面，接种菌株后，恒温培养箱26℃培养24～48h；
②
菌种摇床扩大培养：将斜面种子接种茄瓶斜面na培养基上，于26℃条件下培养24～48h，获得茄瓶种子；(2)发酵
①
种子悬浮液的制备：用灭菌水洗下茄瓶斜面上的菌苔，得到种子悬浮液；
②
接种：将种子悬浮液通过接种口，利用压差接入发酵罐培养基上；
③
液体发酵：发酵罐培养基在接种后，培养36～48h；所述发酵罐培养基的罐温为25～32℃，罐压为0.5kg/cm2，罐内搅拌速度为200r/min，在接种升压过程中，罐压不超过1.5kg/cm2。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述na培养基的配方及处理方法为：葡萄糖l0g，蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，酵母浸膏1g，琼脂粉17g，用蒸馏水补足到1000ml，调节ph＝7.0。7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述发酵罐培养基的配方及处理方法为：发酵培养基包含5％蛋白胨、10％玉米粉、20％黄豆粉、2％酵母提取物、20％蔗糖、3％磷酸氢二钾、10％甘油，灭菌前调节ph＝7.0，于121℃灭菌30min。8.如权利要求5所述的产酶溶杆菌bn3-15在田间病害防治中的应用，其特征在于，所述产酶溶杆菌菌株bn3-15包衣剂的制备方法，包括：(1)将产酶溶杆菌接种于kb液体培养液，于28℃、160r/min进行摇瓶发酵培养48h制备成发酵液，初始产酶溶杆菌含量≥1
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109cfu/ml；(2)将聚乙烯醇与壳聚糖混合物、木质素磺酸钠、黄原胶、丙三醇、曙红混合，搅拌均匀，然后放入研磨机中进行研磨，研磨时间为4～8h，研磨至物料的平均粒径小于5μm，制备成助剂；(3)将步骤(1)所得产酶溶杆菌发酵液与步骤(2)所得助剂按体积1：99的比例混匀制得生物型种衣剂。9.一种如权利要求1所述的产酶溶杆菌作为生长剂在促进十字花科蔬菜、玉米和三七生长中的应用。
技术总结
本发明属于生物防治技术领域，公开了一种产酶溶杆菌及其应用，所述产酶溶杆菌为产酶溶杆菌BN3-15菌株，该菌株分离于云南省西双版纳傣族自治州鲜食玉米根际土中，其分类命名为产酶溶杆菌，所述产酶溶杆菌BN3-15已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.21259。本发明提供的产酶溶杆菌BN3-15，安全无残留、具有防病促生效果，可制成水剂、可湿性粉剂或种子包衣剂，用于田间防治玉米大斑病、辣椒炭疽病、白菜根肿病、三七根腐病等病害。本发明提供的生物制剂综合性状较好，对真菌病害的防效显著，有助于减少化学药剂在农产品中的使用量和残留量，使用更安全，且易于工业化生产。且易于工业化生产。且易于工业化生产。
技术研发人员：魏兰芳 姬广海 代真林 汪娅婷
受保护的技术使用者：云南农业大学
技术研发日：2021.06.08
技术公布日：2022/3/8
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