一种人类卵母细胞体外受精前培养方法和系列培养液与应用与流程

1.本发明实施例涉及细胞内分泌技术领域，特别涉及一种人类卵母细胞体外受精前培养方法和系列培养液与应用。


背景技术：

2.卵泡颗粒细胞(granulosa cells,gcs)是卵泡内的体细胞，在卵泡的生长发育过程中起着至关重要的作用。随着卵泡的发育至窦卵泡期，颗粒细胞分化为在空间和功能上不同的两个种群：围绕在卵母细胞周围的卵丘细胞(cumulus cells,ccs)和排列在卵泡壁上的壁颗粒细胞(mural granulosa cells，mgcs)。一般认为，卵丘细胞与壁颗粒细胞是起源一致、位置不同的的同一种细胞。因为根据不同促排方案和个体卵巢反应不一，所有卵泡的大小也不均一，所以可以认为根据不同卵泡的大小获取的卵子成熟度也会具有一定的差异。辅助生殖技术体外受精要求，在注射hcg后36小时取卵和40-41小时进行体外受精比较合适，也就是说获取卵子后是在体外培养4-6小时左右再进行加精(或媒精)。目前，大多数胚胎室都是把获取的卵子立刻转移到“受精培养液”里进行培养后再加精。
3.然而，上述现有技术的方法存在：获卵后授精前，卵子在“受精培养液”中，虽然只有短短数小时，但是这一受精培养液并不是卵子的最佳环境。为此，可能会影响卵子质量、继之的正常受精率和优质胚胎发育率、囊胚形成率和优质囊胚率。
4.因此，如何成功开发一种人类卵母细胞体外受精前培养方法和系列培养液，应用这些系列培养液以提高卵子质量、正常受精率和优质卵裂期胚胎发育率、囊胚形成率和优质囊胚率，成为亟待解决的技术问题。


技术实现要素：

5.本发明实施例目的是提供一种人类卵母细胞体外受精前培养方法和系列培养液与应用，采用本发明的卵子体外成熟培养液于取卵后受精前对卵丘细胞-卵子-复合体进行短时培养，促进卵子细胞核和细胞质的同步成熟，进而提高卵子质量；继而采用本发明的受精培养液授精提高正常受精率；相应地采用本发明的胚胎发育培养液培养受精卵提高优质卵裂期胚胎发育率和提高囊胚形成率和优质囊胚率；由此可能提高胚胎移植后的临床妊娠率和胚胎着床率。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.在本发明的第一方面，提供了一种卵子体外成熟培养液，所述卵子体外成熟培养液的组成成分包括：
8.a液：包括5.5～8.5g/l氯化钠、0.25～0.7g/l氯化钾、0.02～0.06g/l七水硫酸镁、0.03～0.08g/l磷酸二氢钠、2.1～5g/l碳酸氢钠、1～3g/ld-(+)-葡萄糖、0.15～0.5g/l丙酮酸钠、0.15～0.5g/l二水氯化钙、1.5～3g/l的dl-乳酸钠、0.1～0.3g/l丙氨酰谷氨酰胺、0.01～0.04g/l的l-天门冬酰胺、0.01～0.03g/l的l-天门冬氨酸、0.006～0.02g/l甘氨酸、0.01～0.04g/l的l-脯氨酸、0.01～0.05g/l的l-丝氨酸、0.1～0.4g/l的l-盐酸精氨酸、
0.02～0.05g/l的l-盐酸胱氨酸、0.02～0.05g/l的l-组氨酸盐酸盐一水合物、0.05～0.2g/l的l-异亮氨酸、0.05～0.2g/l的l-亮氨酸、0.07～0.3g/l赖氨酸盐酸盐、0.01～0.05g/l的l-蛋氨酸、0.03～0.09g/l的l-苯丙氨酸、0.04～0.09g/l苏氨酸、0.01～0.03g/l的l-色氨酸、0.02～0.05g/l的l-酪氨酸、0.02～0.05g/l的l-缬氨酸、0.001～0.003g/l的d-泛酸钙、0.001～0.004g/l氯化胆碱、0.001～0.002g/l叶酸、0.002～0.005g/l肌醇、0.001～0.003g/l烟酰胺、0.001～0.004g/l盐酸吡哆醇、0.0001～0.0005g/l核黄素、0.001～0.005g/l盐酸硫胺素、0.01～0.05g/l庆大霉素和1～5g/l人血清白蛋白；
9.b液：7～8iu/mlhmg。
10.在本发明的第二方面，提供了一种受精培养液，所述受精培养液的组成成分包括：
11.5.5～8.5g/l氯化钠、0.2～0.5g/l氯化钾、0.02～0.06g/l七水硫酸镁、0.03～0.07g/l磷酸二氢钠、2.1～5.2g/l碳酸氢钠、0.5～2g/ld-(+)-葡萄糖、0.02～0.05g/l丙酮酸钠、0.2～0.5g/l二水氯化钙、2～4g/l的dl-乳酸钠，0.01～0.05g/l庆大霉素和1～5g/l人血清白蛋白。
12.在本发明的第三方面，提供了一种胚胎发育培养液，所述胚胎发育培养液的组成成分包括：
13.5～8g/l氯化钠、0.2～0.5g/l氯化钾、0.01～0.05g/l六水氯化镁、0.04～0.09g/l磷酸二氢钠、2.1～6.2g/l碳酸氢钠、0.04～0.5g/l的d-(+)-葡萄糖、0.05～0.15g/l丙酮酸钠、0.2～0.5g/l二水氯化钙、1.5～5g/l的dl-乳酸钠、0.003～0.008g/l的edta四钠盐二水合物、0.004～0.09g/l丙氨酰谷氨酰胺、0.003～0.007g/l的l-天门冬酰胺、0.005～0.02g/l的l-天门冬氨酸、0.004～0.009g/l甘氨酸、0.004～0.009g/l的l-脯氨酸、0.003～0.008g/l的l-丝氨酸、0.003～0.007g/l的l-盐酸精氨酸、0.005～0.02g/l的l-盐酸胱氨酸、0.01～0.03g/l的l-半胱氨酸、0.005～0.02g/l的l-组氨酸盐酸盐一水合物、0.02～0.05g/l的l-异亮氨酸、0.02～0.06g/l的l-亮氨酸、0.03～0.09g/l的赖氨酸盐酸盐、0.005～0.02g/l的l-蛋氨酸、0.01～0.03g/l的l-苯丙氨酸、0.015～0.04g/l的苏氨酸、0.025～0.07g/l的l-色氨酸、0.005～0.02g/l得到l-酪氨酸、0.007～0.02g/l的l-缬氨酸、0.01～0.05g/l庆大霉素和1～5g/l人血清白蛋白。
14.在本发明的第四方面，提供了所述的卵子体外成熟培养液在卵丘细胞-卵子-复合体的体外成熟培养中的应用。
15.进一步地，所述卵子体外成熟培养液在使用前包括：在37℃，5％二氧化碳浓度条件下至少平衡30分钟以上。
16.进一步地，所述体外成熟培养中，所述卵丘细胞-卵子-复合体与所述卵子体外成熟培养液中的比值为：10～15个/ml。
17.进一步地，在取卵后授精前，把获取的卵丘细胞-卵子-复合体在所述卵子体外成熟培养液中前培养3～6h。
18.在本发明的第五方面，提供了一种人类卵母细胞体外受精前培养的系列培养液，所述系列培养液包括所述的卵子体外成熟培养液、所述的受精培养液和所述的胚胎发育培养液。
19.在本发明的第四方面，提供了一种获卵后体外受精前培养的方法，所述方法包括：
20.在取卵后授精前，把获取的卵丘细胞-卵子-复合体在所述卵子体外成熟培养液中
前培养3～6h；
21.将所述成熟卵丘细胞-卵子-复合体转移到受精培养液中进行加精授精，获得受精卵；
22.将所述受精卵转移到胚胎发育培养液中进行胚胎发育培养，获得优质的卵裂胚和囊胚(为一步式胚胎发育培养液)。
23.本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
24.本发明实施例提供的一种卵子体外成熟培养液及其制备方法与应用，采用本发明的卵子体外成熟培养液于取卵后受精前对卵丘细胞-卵子-复合体进行短时培养，可以促进卵子细胞核和细胞质的同步成熟，进而提高卵子质量；本发明实施例提供的一种受精培养液及其制备方法与应用，联合采用本发明的卵子体外成熟培养液和受精培养液授精，可以提高正常受精率；本发明实施例提供的一种胚胎发育培养液及其制备方法与应用，联合采用本发明的卵子体外成熟培养液、受精培养液和胚胎发育培养液，可以提高优质卵裂期胚胎发育率和提高囊胚形成率和优质囊胚率；为此，可能提高胚胎移植后的临床妊娠率和胚胎着床率。
25.本发明通过取卵后受精前短时培养的体外受精体系的建立、可能改变现有常规和传统的体外受精流程，为提高治疗效率提供有力治疗手段。
附图说明
26.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明实施例的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
27.图1为本发明实施例提供的从卵子到囊胚的发育过程示意图；
28.图2为本发明实施例提供的授精前培养效果临床试验流程图。
具体实施方式
29.下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明实施例，本发明实施例的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明实施例，而非限制本发明实施例。
30.在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为根据本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明实施例所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
31.除非另有特别说明，本发明实施例中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
32.需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。
33.本发明实施例提供的技术方案为解决上述技术问题，总体思路根据下：
34.1、技术难题的原因分析
35.现有技术的方法存在：卵子质量、正常受精率和优质卵裂期胚胎发育率、囊胚形成率和优质囊胚率可能不是最高的缺点。本技术的发明人对存在上述技术问题进行原因分析：
36.目前所有临床胚胎室都是把获取的cocs立刻转移到“受精培养液”里进行培养数小时后再加精。然而，根据体外受精培养液的成份分析发现，这一培养液主要是有利于精子获能受精，并不是卵子受精前的的最佳环境，因为体外受精培养液成份里并不含有卵子成熟的重要营养成份。
37.为此，我们认为在取卵后加精前，这些卵子应该在适当的培养液，即由我们研究开发的“卵子体外成熟培养液”里进行授精前的培养进一步促进卵子细胞核和细胞质的同步成熟，进而会有益于卵子正常受精、胚胎早期发育和移植后着床和妊娠。
38.2、解决方法的探究
39.对于以上技术难题，本技术人尝试了多种方法，最终研发出了本发明的卵子体外成熟培养液的配方、受精培养液配方和胚胎发育培养液配方，采用本发明的卵子体外成熟培养液于取卵后受精前对卵丘细胞-卵子-复合体进行短时培养，可以促进卵子细胞核和细胞质的同步成熟，进而提高卵子质量；继而采用本发明的受精培养液进行授精，可以提高正常受精率；进一步采用本发明的胚胎发育培养液，可以提高优质卵裂期胚胎发育率和提高囊胚形成率和优质囊胚率；可能提高胚胎移植后的临床妊娠率和胚胎着床率。
40.根据本发明实施例一种典型的实施方式，提供了一种卵子体外成熟培养液，所述卵子体外成熟培养液的组成成分包括：
41.a液：包括5.5～8.5g/l氯化钠、0.25～0.7g/l氯化钾、0.02～0.06g/l七水硫酸镁、0.03～0.08g/l磷酸二氢钠、2.1～5g/l碳酸氢钠、1～3g/ld-(+)-葡萄糖、0.15～0.5g/l丙酮酸钠、0.15～0.5g/l二水氯化钙、1.5～3g/l的dl-乳酸钠、0.1～0.3g/l丙氨酰谷氨酰胺、0.01～0.04g/l的l-天门冬酰胺、0.01～0.03g/l的l-天门冬氨酸、0.006～0.02g/l甘氨酸、0.01～0.04g/l的l-脯氨酸、0.01～0.05g/l的l-丝氨酸、0.1～0.4g/l的l-盐酸精氨酸、0.02～0.05g/l的l-盐酸胱氨酸、0.02～0.05g/l的l-组氨酸盐酸盐一水合物、0.05～0.2g/l的l-异亮氨酸、0.05～0.2g/l的l-亮氨酸、0.07～0.3g/l赖氨酸盐酸盐、0.01～0.05g/l的l-蛋氨酸、0.03～0.09g/l的l-苯丙氨酸、0.04～0.09g/l苏氨酸、0.01～0.03g/l的l-色氨酸、0.02～0.05g/l的l-酪氨酸、0.02～0.05g/l的l-缬氨酸、0.001～0.003g/l的d-泛酸钙、0.001～0.004g/l氯化胆碱、0.001～0.002g/l叶酸、0.002～0.005g/l肌醇、0.001～0.003g/l烟酰胺、0.001～0.004g/l盐酸吡哆醇、0.0001～0.0005g/l核黄素、0.001～0.005g/l盐酸硫胺素、0.01～0.05g/l庆大霉素和1～5g/l人血清白蛋白；
42.b液：7～8iu/mlhmg。
43.本发明的所述浓度均为终浓度；
44.上述技术方案中，卵子体外成熟培养液具有以下特点：
45.酸碱度ph:7.1-7.6；渗透压osmolality:265-315mosm/kg；鼠胚测试mea≥80％；
46.内毒素endotoxins:《0.25eu/ml；过滤灭菌sterile:filtered(sal10-3)；储存温度store:at2-8℃。
47.使用方法：卵子体外成熟培养液专为卵子体外成熟设计，使用前需要添加7～8iu/毫升hmg(fsh和lh)后再使用。卵子体外成熟培养液使用前需要在5％二氧化碳培养箱中至
少平衡30分钟以上方可使用(也可以过夜准备)。推荐使用1毫升容量的卵子体外成熟培养液放入10-15个cocs进行前培养。在取卵后授精前，把获取的卵丘细胞-卵子-复合体(cumulus-oocyte-complexes，cocs)在卵子体外成熟培养液中培养3-6小时，有助于卵子的最终成熟。然后把cocs转移到受精培养液中进行加精授精，或转移到颗粒细胞去除液中进行裸卵后，用于精子卵胞浆内注入(intro-cytoplasmic sperm injection，icsi)。
48.根据本发明实施例另一种典型的实施方式，提供了一种受精培养液，所述受精培养液的组成成分包括：
49.5.5～8.5g/l氯化钠、0.2～0.5g/l氯化钾、0.02～0.06g/l七水硫酸镁、0.03～0.07g/l磷酸二氢钠、2.1～5.2g/l碳酸氢钠、0.5～2g/ld-(+)-葡萄糖、0.02～0.05g/l丙酮酸钠、0.2～0.5g/l二水氯化钙、2～4g/l的dl-乳酸钠，0.01～0.05g/l庆大霉素和1～5g/l人血清白蛋白。
50.特点：酸碱度7.1-7.6；渗透压265-315mosm/kg；鼠胚试验囊胚率≥80％；内毒素《0.25eu/ml；过滤灭菌(sal10-3
)；2-8℃储存。
51.使用方法：受精培养液使用前需要在5％二氧化碳培养箱中至少平衡30分钟以上方可使用(也可以过夜准备)。推荐使用1毫升容量的受精培养液，可放入10～15个cocs进行体外受精。把在卵子成熟培养液里培养3～6小时后的cocs转移到受精培养液中，然后把处理后的精子加入到受精培养液里，在5％二氧化碳(或三气)培养箱条件下培养16～18小时。用剥卵管把卵子周边的卵丘细胞和颗粒细胞以及精子剥离后，在显微镜下观察卵细胞质中是否存在两原核(2pn)来判别卵子是否受精。把受精卵转移到胚胎发育培养液中进行胚胎发育培养。
52.根据本发明实施例另一种典型的实施方式，提供了一种胚胎发育培养液，所述胚胎发育培养液的组成成分包括：
53.5～8g/l氯化钠、0.2～0.5g/l氯化钾、0.01～0.05g/l六水氯化镁、0.04～0.09g/l磷酸二氢钠、2.1～6.2g/l碳酸氢钠、0.04～0.5g/l的d-(+)-葡萄糖、0.05～0.15g/l丙酮酸钠、0.2～0.5g/l二水氯化钙、1.5～5g/l的dl-乳酸钠、0.003～0.008g/l的edta四钠盐二水合物、0.004～0.09g/l丙氨酰谷氨酰胺、0.003～0.007g/l的l-天门冬酰胺、0.005～0.02g/l的l-天门冬氨酸、0.004～0.009g/l甘氨酸、0.004～0.009g/l的l-脯氨酸、0.003～0.008g/l的l-丝氨酸、0.003～0.007g/l的l-盐酸精氨酸、0.005～0.02g/l的l-盐酸胱氨酸、0.01～0.03g/l的l-半胱氨酸、0.005～0.02g/l的l-组氨酸盐酸盐一水合物、0.02～0.05g/l的l-异亮氨酸、0.02～0.06g/l的l-亮氨酸、0.03～0.09g/l的赖氨酸盐酸盐、0.005～0.02g/l的l-蛋氨酸、0.01～0.03g/l的l-苯丙氨酸、0.015～0.04g/l的苏氨酸、0.025～0.07g/l的l-色氨酸、0.005～0.02g/l得到l-酪氨酸、0.007～0.02g/l的l-缬氨酸、0.01～0.05g/l庆大霉素和1～5g/l人血清白蛋白。
54.特点：酸碱度7.2-7.7；渗透压265-315mosm/kg；鼠胚试验囊胚率≥80％；内毒素《0.25eu/ml；过滤灭菌(sal10-3)；2-8℃储存。
55.使用方法：胚胎发育培养液使用前需要在5％二氧化碳培养箱中至少平衡30分钟以上方可使用(也可以过夜准备)。推荐使用10微升容量的胚胎发育培养液小滴盖油进行培养。每一胚胎发育培养液小滴可放入1个受精卵进行体外发育培养。在培养至第三天时，可以把8-细胞期的卵裂胚转移到新鲜的胚胎发育培养液里继续培养到第五天。如果使用时时
监控培养箱(timelapse)也可以在培养的第三天不用更换胚胎发育培养液。
56.根据本发明实施例另一种典型的实施方式，提供了一种人类卵母细胞体外受精前培养的系列培养液，所述系列培养液包括所述的卵子体外成熟培养液、所述的受精培养液和所述的胚胎发育培养液。
57.根据本发明实施例一种典型的实施方式，提供了一种人类卵母细胞体外受精前培养方法，所述方法包括：
58.s1、在取卵后授精前，把获取的卵丘细胞-卵子-复合体在所述卵子体外成熟培养液中前培养3～6h；
59.s2、将所述成熟卵丘细胞-卵子-复合体转移到受精培养液中进行加精授精，获得受精卵；
60.s3、将所述受精卵转移到胚胎发育培养液中进行胚胎发育培养，获得卵裂期胚胎和囊胚。
61.本发明实施例联合使用本发明的卵子体外成熟培养液的配方、受精培养液配方和胚胎发育培养液配方，采用本发明的卵子体外成熟培养液于取卵后受精前对卵丘细胞-卵子-复合体进行短时培养，可以促进卵子细胞核和细胞质的同步成熟，进而提高卵子质量；继而采用本发明的受精培养液进行授精，可以提高正常受精率；进一步采用本发明的胚胎发育培养液，可以提高优质卵裂期胚胎发育率和提高囊胚形成率和优质囊胚率；由此可能提高胚胎移植后的临床妊娠率和胚胎着床率。
62.下面将结合实施例、对比实验数据对本技术的一种卵子体外成熟培养液及其制备方法与应用进行详细说明。
63.实施例1、人类卵母细胞体外受精体系：联合使用卵子体外成熟培养液、受精培养液和胚胎发育培养液的方法
64.1、一种人类卵母细胞体外受精前培养的系列培养液及其应用
65.(1)卵子体外成熟培养液，其组成成分包括：
66.a液：包括7g/l氯化钠、0.5g/l氯化钾、0.04g/l七水硫酸镁、0.05g/l磷酸二氢钠、3g/l碳酸氢钠、2g/ld-(+)-葡萄糖、0.3g/l丙酮酸钠、0.3g/l二水氯化钙、2.2g/l的dl-乳酸钠、0.2g/l丙氨酰谷氨酰胺、0.02g/l的l-天门冬酰胺、0.02g/l的l-天门冬氨酸、0.01g/l甘氨酸、0.02g/l的l-脯氨酸、0.03g/l的l-丝氨酸、0.3g/l的l-盐酸精氨酸、0.035g/l的l-盐酸胱氨酸、0.035g/l的l-组氨酸盐酸盐一水合物、0.1g/l的l-异亮氨酸、0.1g/l的l-亮氨酸、0.15g/l赖氨酸盐酸盐、0.03g/l的l-蛋氨酸、0.06g/l的l-苯丙氨酸、0.06g/l苏氨酸、0.02g/l的l-色氨酸、0.03g/l的l-酪氨酸、0.03g/l的l-缬氨酸、0.002g/l的d-泛酸钙、0.002g/l氯化胆碱、0.0015g/l叶酸、0.003g/l肌醇、0.002g/l烟酰胺、0.0025g/l盐酸吡哆醇、0.00035g/l核黄素、0.003g/l盐酸硫胺素、0.03g/l庆大霉素和3g/l人血清白蛋白；
67.b液：7.5iu/mlhmg。
68.(2)受精培养液，其组成成分包括：
69.7g/l氯化钠、0.35g/l氯化钾、0.04g/l七水硫酸镁、0.05g/l磷酸二氢钠、3g/l碳酸氢钠、1g/ld-(+)-葡萄糖、0.035g/l丙酮酸钠、0.35g/l二水氯化钙、3g/l的dl-乳酸钠，0.035g/l庆大霉素和3g/l人血清白蛋白。
70.(3)胚胎发育培养液，其组成成分包括：
71.6g/l氯化钠、0.3g/l氯化钾、0.03g/l六水氯化镁、0.07g/l磷酸二氢钠、4g/l碳酸氢钠、0.3g/l的d-(+)-葡萄糖、0.1g/l丙酮酸钠、0.3g/l二水氯化钙、3g/l的dl-乳酸钠、0.005g/l的edta四钠盐二水合物、0.006g/l丙氨酰谷氨酰胺、0.006g/l的l-天门冬酰胺、0.01g/l的l-天门冬氨酸、0.006g/l甘氨酸、0.006g/l的l-脯氨酸、0.006g/l的l-丝氨酸、0.005g/l的l-盐酸精氨酸、0.01g/l的l-盐酸胱氨酸、0.02g/l的l-半胱氨酸、0.01g/l的l-组氨酸盐酸盐一水合物、0.03g/l的l-异亮氨酸、0.04g/l的l-亮氨酸、0.06g/l的赖氨酸盐酸盐、0.01g/l的l-蛋氨酸、0.02g/l的l-苯丙氨酸、0.03g/l的苏氨酸、0.05g/l的l-色氨酸、0.01g/l得到l-酪氨酸、0.01g/l的l-缬氨酸、0.03g/l庆大霉素和3g/l人血清白蛋白。
72.2、一种获卵后体外受精前培养的方法，包括如下步骤：
73.s1、在取卵后授精前，把获取的卵丘细胞-卵子-复合体在所述卵子体外成熟培养液中前培养3～6h；
74.s2、将所述前培养卵丘细胞-卵子-复合体转移到受精培养液中进行加精授精，获得受精卵；
75.s3、将所述受精卵转移到胚胎发育培养液中进行胚胎发育培养，获得优质的卵裂胚和囊胚(为一步式胚胎发育培养液)。
76.实施例2、人类卵母细胞体外受精体系：联合使用卵子体外成熟培养液、受精培养液和胚胎发育培养液的方法
77.1、一种人类卵母细胞体外受精前培养的系列培养液
78.(1)卵子体外成熟培养液，其组成成分包括：
79.a液：包括5.5g/l氯化钠、0.25g/l氯化钾、0.02g/l七水硫酸镁、0.03g/l磷酸二氢钠、2.1g/l碳酸氢钠、1g/ld-(+)-葡萄糖、0.15g/l丙酮酸钠、0.15g/l二水氯化钙、1.5g/l的dl-乳酸钠、0.1g/l丙氨酰谷氨酰胺、0.01g/l的l-天门冬酰胺、0.01g/l的l-天门冬氨酸、0.006g/l甘氨酸、0.01g/l的l-脯氨酸、0.01g/l的l-丝氨酸、0.1g/l的l-盐酸精氨酸、0.02g/l的l-盐酸胱氨酸、0.02g/l的l-组氨酸盐酸盐一水合物、0.05g/l的l-异亮氨酸、0.05g/l的l-亮氨酸、0.07g/l赖氨酸盐酸盐、0.01g/l的l-蛋氨酸、0.03g/l的l-苯丙氨酸、0.04g/l苏氨酸、0.01g/l的l-色氨酸、0.02g/l的l-酪氨酸、0.02g/l的l-缬氨酸、0.001g/l的d-泛酸钙、0.001g/l氯化胆碱、0.001g/l叶酸、0.002g/l肌醇、0.001g/l烟酰胺、0.001g/l盐酸吡哆醇、0.0001g/l核黄素、0.001g/l盐酸硫胺素、0.01g/l庆大霉素和1g/l人血清白蛋白；
80.b液：7iu/ml hmg。
81.(2)受精培养液，其组成成分包括：
82.5.5g/l氯化钠、0.2g/l氯化钾、0.02g/l七水硫酸镁、0.03g/l磷酸二氢钠、2.1g/l碳酸氢钠、0.5g/ld-(+)-葡萄糖、0.02g/l丙酮酸钠、0.2g/l二水氯化钙、2g/l的dl-乳酸钠，0.01g/l庆大霉素和1g/l人血清白蛋白。
83.(3)胚胎发育培养液，其组成成分包括：
84.5g/l氯化钠、0.2g/l氯化钾、0.01g/l六水氯化镁、0.04g/l磷酸二氢钠、2.1g/l碳酸氢钠、0.04g/l的d-(+)-葡萄糖、0.05g/l丙酮酸钠、0.2g/l二水氯化钙、1.5g/l的dl-乳酸钠、0.003g/l的edta四钠盐二水合物、0.004g/l丙氨酰谷氨酰胺、0.003g/l的l-天门冬酰胺、0.005g/l的l-天门冬氨酸、0.004g/l甘氨酸、0.004g/l的l-脯氨酸、0.003g/l的l-丝氨
酸、0.003g/l的l-盐酸精氨酸、0.005g/l的l-盐酸胱氨酸、0.01g/l的l-半胱氨酸、0.005g/l的l-组氨酸盐酸盐一水合物、0.02g/l的l-异亮氨酸、0.02g/l的l-亮氨酸、0.03g/l的赖氨酸盐酸盐、0.005g/l的l-蛋氨酸、0.01g/l的l-苯丙氨酸、0.015g/l的苏氨酸、0.025g/l的l-色氨酸、0.005g/l得到l-酪氨酸、0.007g/l的l-缬氨酸、0.01g/l庆大霉素和1g/l人血清白蛋白。
85.2、一种获卵后体外受精前培养的方法，包括如下步骤：
86.s1、在取卵后授精前，把获取的卵丘细胞-卵子-复合体在所述卵子体外成熟培养液中前培养3～6h；
87.s2、将所述成熟卵丘细胞-卵子-复合体转移到受精培养液中进行加精授精，获得受精卵；
88.s3、将所述受精卵转移到胚胎发育培养液中进行胚胎发育培养，获得优质的卵裂胚和囊胚(为一步式胚胎发育培养液)。
89.实施例3、人类卵母细胞体外受精体系：联合使用卵子体外成熟培养液、受精培养液和胚胎发育培养液的方法
90.1、一种人类卵母细胞体外受精前培养的系列培养液
91.(1)卵子体外成熟培养液，其组成成分包括：
92.a液：包括8.5g/l氯化钠、0.7g/l氯化钾、0.06g/l七水硫酸镁、0.08g/l磷酸二氢钠、5g/l碳酸氢钠、3g/ld-(+)-葡萄糖、0.5g/l丙酮酸钠、0.5g/l二水氯化钙、3g/l的dl-乳酸钠、0.3g/l丙氨酰谷氨酰胺、0.04g/l的l-天门冬酰胺、0.03g/l的l-天门冬氨酸、0.02g/l甘氨酸、0.04g/l的l-脯氨酸、0.05g/l的l-丝氨酸、0.4g/l的l-盐酸精氨酸、0.05g/l的l-盐酸胱氨酸、0.05g/l的l-组氨酸盐酸盐一水合物、0.2g/l的l-异亮氨酸、0.2g/l的l-亮氨酸、0.3g/l赖氨酸盐酸盐、0.05g/l的l-蛋氨酸、0.09g/l的l-苯丙氨酸、0.09g/l苏氨酸、0.03g/l的l-色氨酸、0.05g/l的l-酪氨酸、0.05g/l的l-缬氨酸、0.003g/l的d-泛酸钙、0.004g/l氯化胆碱、0.002g/l叶酸、0.005g/l肌醇、0.003g/l烟酰胺、0.004g/l盐酸吡哆醇、0.0005g/l核黄素、0.005g/l盐酸硫胺素、0.05g/l庆大霉素和5g/l人血清白蛋白；
93.b液：8iu/mlhmg。
94.(2)受精培养液，其组成成分包括：
95.8.5g/l氯化钠、0.5g/l氯化钾、0.06g/l七水硫酸镁、0.07g/l磷酸二氢钠、5.2g/l碳酸氢钠、2g/ld-(+)-葡萄糖、0.05g/l丙酮酸钠、0.5g/l二水氯化钙、4g/l的dl-乳酸钠，0.05g/l庆大霉素和5g/l人血清白蛋白。
96.(3)胚胎发育培养液，其组成成分包括：
97.8g/l氯化钠、0.5g/l氯化钾、0.05g/l六水氯化镁、0.09g/l磷酸二氢钠、6.2g/l碳酸氢钠、0.5g/l的d-(+)-葡萄糖、0.15g/l丙酮酸钠、0.5g/l二水氯化钙、5g/l的dl-乳酸钠、0.008g/l的edta四钠盐二水合物、0.09g/l丙氨酰谷氨酰胺、0.007g/l的l-天门冬酰胺、0.02g/l的l-天门冬氨酸、0.009g/l甘氨酸、0.009g/l的l-脯氨酸、0.008g/l的l-丝氨酸、0.007g/l的l-盐酸精氨酸、0.02g/l的l-盐酸胱氨酸、0.03g/l的l-半胱氨酸、0.02g/l的l-组氨酸盐酸盐一水合物、0.05g/l的l-异亮氨酸、0.06g/l的l-亮氨酸、0.09g/l的赖氨酸盐酸盐、0.02g/l的l-蛋氨酸、0.03g/l的l-苯丙氨酸、0.04g/l的苏氨酸、0.07g/l的l-色氨酸、0.02g/l得到l-酪氨酸、0.02g/l的l-缬氨酸、0.05g/l庆大霉素和5g/l人血清白蛋白。
98.2、一种获卵后体外受精前培养的方法，包括如下步骤：
99.s1、在取卵后授精前，把获取的卵丘细胞-卵子-复合体在所述卵子体外成熟培养液中前培养3～6h；
100.s2、将所述成熟卵丘细胞-卵子-复合体转移到受精培养液中进行加精授精，获得受精卵；
101.s3、将所述受精卵转移到胚胎发育培养液中进行胚胎发育培养，获得优质的卵裂胚和囊胚(为一步式胚胎发育培养液)。
102.对比例1
103.该对比例1为对照组培养液，即cook受精培养液。
104.实验例1
105.将各实施例和对比例所得的卵子体外成熟培养液对cocs进行体外受精前培养3-6h，再把cocs将移入我们研究开发的“受精培养液”里进行加精进行体外受精。在加精16-18小时后判别正常受精率，然后把受精卵(2pn)转移到我们研究开发的“胚胎发育培养液”中继续培养。第二天观察受精卵的分裂情况，在培养到第三天(移入胚胎发育培养液后48小时)时，观察记录胚胎发育情况(优胚率)，并把胚胎转移到新的“胚胎发育培养液”里继续培养到第五天，以观察记录囊胚形成率。如图2所示，具体操作步骤为：
106.1、入组患者：女性在30岁以下输卵管因素不孕；男方精液正常amh值：大于2；三个月内无促排卵史。
107.2、温和促排方案：月经第二天两侧窦卵泡应在15以上；
108.3、月经第3天开始注射150iu/天持续5天；
109.4、第8天时b超和抽血测试激素水平；改注乐宝得hmg 150-225单位/天；当有一枚卵泡大于18毫米，两枚大于16毫米时，注射5000iu hcg，36小时后取卵，获取cocs的培养，患者随机分配。
110.5、实验组：cocs在实施例1的“卵子体外成熟培养液”中培养5小时；所述培养采用的培养皿：内为1毫升，用培养用油覆盖，外围2毫升。把cocs转移到“受精培养液”中加入处理后精子(最终浓度为1
×
105/毫升)；16-18小时后裸卵观察卵子成熟和受精情况(2pn)后把受精卵转移到10微升/个“胚胎发育培养液”中；48小时后观察受精卵分裂和胚胎发育情况选择两枚优质胚胎进行移植，剩余胚胎移植转移到新鲜10微升/个“胚胎发育培养液”中继续培养；48小时后观察囊胚形成情况优质囊胚进行玻璃化冷冻保存。
111.对照组：cocs在对比例1的“cook受精培养液”中培养5小时；培养皿：内为1毫升，用培养用油覆盖，外为2毫升；把处理后的精子加入到“cook受精培养液”(最终浓度为1
×
105/毫升)；16-18小时后裸卵观察卵子成熟和受精情况(2pn)后把受精卵转移到10微升/个“cook受精培养液”中；48小时后观察受精卵分裂和胚胎发育情况选择两枚优质胚胎进行移植，剩余胚胎移植转移到新鲜10微升/个“cook受精培养液”中继续培养；48小时后观察囊胚形成情况优质囊胚进行玻璃化冷冻保存。
112.临床研究成果如表1所示。
113.表1-短时期培养对卵子成熟率、受精率优质胚胎率和囊胚形成率的影响
114.组别实施例1培养液对比例1cook培养液p值患者数(n)3030/
年龄(x
±
y)30.2
±
3.530.2
±
3.5/卵子数(n)299305/成熟卵子数(％)273(91.3)270(88.5)p＞0.05受精卵子数(％)227(83.2)238(88.2)p＞0.05异常受精数(％)20(8.1)19(7.3)p＞0.05卵裂数(％)223(98.2)232(97.5)p＞0.05d3优胚数(％)175(78.5)161(69.4)p＜0.05d5囊胚数154(69.1)138(59.5)p＜0.05优质囊胚数(％)140(62.8)119(51.3)p＜0.05
115.卵子成熟率由ivf加精后16-18小时确认
116.由表1的数据可知，
117.相比于对比例1的cook培养液，本发明实施例联合使用本发明的卵子体外成熟培养液的配方、受精培养液配方和胚胎发育培养液配方，采用本发明实施例1的卵子体外成熟培养液于取卵后受精前对卵丘细胞-卵子-复合体进行短时培养，可以促进卵子细胞核和细胞质的同步成熟，进而提高卵子质量；提高正常受精率和优质卵裂期胚胎发育率；提高囊胚形成率和优质囊胚率；为此，可能提高胚胎移植后的临床妊娠率和胚胎着床率。
118.最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
119.尽管已描述了本发明实施例的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明实施例范围的所有变更和修改。
120.显然，本领域的技术人员可以对本发明实施例进行各种改动和变型而不脱离本发明实施例的精神和范围。这样，倘若本发明实施例的这些修改和变型属于本发明实施例权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明实施例也意图包含这些改动和变型在内。

技术特征：
1.一种卵子体外成熟培养液，其特征在于，所述卵子体外成熟培养液的组成成分包括：a液：包括5.5～8.5g/l氯化钠、0.25～0.7g/l氯化钾、0.02～0.06g/l七水硫酸镁、0.03～0.08g/l磷酸二氢钠、2.1～5g/l碳酸氢钠、1～3g/ld-(+)-葡萄糖、0.15～0.5g/l丙酮酸钠、0.15～0.5g/l二水氯化钙、1.5～3g/l的dl-乳酸钠、0.1～0.3g/l丙氨酰谷氨酰胺、0.01～0.04g/l的l-天门冬酰胺、0.01～0.03g/l的l-天门冬氨酸、0.006～0.02g/l甘氨酸、0.01～0.04g/l的l-脯氨酸、0.01～0.05g/l的l-丝氨酸、0.1～0.4g/l的l-盐酸精氨酸、0.02～0.05g/l的l-盐酸胱氨酸、0.02～0.05g/l的l-组氨酸盐酸盐一水合物、0.05～0.2g/l的l-异亮氨酸、0.05～0.2g/l的l-亮氨酸、0.07～0.3g/l赖氨酸盐酸盐、0.01～0.05g/l的l-蛋氨酸、0.03～0.09g/l的l-苯丙氨酸、0.04～0.09g/l苏氨酸、0.01～0.03g/l的l-色氨酸、0.02～0.05g/l的l-酪氨酸、0.02～0.05g/l的l-缬氨酸、0.001～0.003g/l的d-泛酸钙、0.001～0.004g/l氯化胆碱、0.001～0.002g/l叶酸、0.002～0.005g/l肌醇、0.001～0.003g/l烟酰胺、0.001～0.004g/l盐酸吡哆醇、0.0001～0.0005g/l核黄素、0.001～0.005g/l盐酸硫胺素、0.01～0.05g/l庆大霉素和1～5g/l人血清白蛋白；b液：7～8iu/ml hmg。2.一种受精培养液，其特征在于，所述受精培养液的组成成分包括：5.5～8.5g/l氯化钠、0.2～0.5g/l氯化钾、0.02～0.06g/l七水硫酸镁、0.03～0.07g/l磷酸二氢钠、2.1～5.2g/l碳酸氢钠、0.5～2g/l d-(+)-葡萄糖、0.02～0.05g/l丙酮酸钠、0.2～0.5g/l二水氯化钙、2～4g/l的dl-乳酸钠，0.01～0.05g/l庆大霉素和1～5g/l人血清白蛋白。3.一种胚胎发育培养液，其特征在于，所述胚胎发育培养液的组成成分包括：5～8g/l氯化钠、0.2～0.5g/l氯化钾、0.01～0.05g/l六水氯化镁、0.04～0.09g/l磷酸二氢钠、2.1～6.2g/l碳酸氢钠、0.04～0.5g/l的d-(+)-葡萄糖、0.05～0.15g/l丙酮酸钠、0.2～0.5g/l二水氯化钙、1.5～5g/l的dl-乳酸钠、0.003～0.008g/l的edta四钠盐二水合物、0.004～0.09g/l丙氨酰谷氨酰胺、0.003～0.007g/l的l-天门冬酰胺、0.005～0.02g/l的l-天门冬氨酸、0.004～0.009g/l甘氨酸、0.004～0.009g/l的l-脯氨酸、0.003～0.008g/l的l-丝氨酸、0.003～0.007g/l的l-盐酸精氨酸、0.005～0.02g/l的l-盐酸胱氨酸、0.01～0.03g/l的l-半胱氨酸、0.005～0.02g/l的l-组氨酸盐酸盐一水合物、0.02～0.05g/l的l-异亮氨酸、0.02～0.06g/l的l-亮氨酸、0.03～0.09g/l的赖氨酸盐酸盐、0.005～0.02g/l的l-蛋氨酸、0.01～0.03g/l的l-苯丙氨酸、0.015～0.04g/l的苏氨酸、0.025～0.07g/l的l-色氨酸、0.005～0.02g/l得到l-酪氨酸、0.007～0.02g/l的l-缬氨酸、0.01～0.05g/l庆大霉素和1～5g/l人血清白蛋白。4.权利要求1所述的卵子体外成熟培养液在卵丘细胞-卵子-复合体的体外成熟培养中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述卵子体外成熟培养液在使用前包括：在37℃，5％二氧化碳浓度条件下至少平衡30分钟以上。6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述体外成熟培养中，所述卵丘细胞-卵子-复合体与所述卵子体外成熟培养液中的比值为：10～15个/ml。7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，在取卵后授精前，把获取的卵丘细胞-卵子-复合体在所述卵子体外成熟培养液中培养3～6h。
8.一种人类卵母细胞体外受精前培养的系列培养液，其特征在于，所述系列培养液包括权利要求1所述的卵子体外成熟培养液、权利要求2所述的受精培养液和权利要求3所述的胚胎发育培养液。9.一种获卵后体外受精前培养的方法，其特征在于，所述方法包括：在取卵后授精前，把获取的卵丘细胞-卵子-复合体在权利要求1所述卵子体外成熟培养液中前培养3～6h；将所述卵丘细胞-卵子-复合体转移到权利要求2所述受精培养液中进行加精授精，获得受精卵；将所述受精卵转移到权利要求3所述胚胎发育培养液中进行胚胎发育培养，获得卵裂期胚胎和囊胚。

技术总结
本发明公开了一种人类卵母细胞体外受精前培养方法和系列培养液与应用，获卵后体外受精前培养方法包括：获取的卵丘细胞-卵子-复合体(Cumulus-oocyte complex，COC)在本发明的“卵子体外成熟培养液”中进行前培养3～6小时，获卵后体外受精前培养3～6小时可以进一步促进卵子细胞核和细胞质的同步成熟，提高卵子质量、继而配合使用本发明的“受精培养液”和“胚胎发育培养液”，可以提高正常受精率、优质卵裂期胚胎发育率、囊胚形成率和优质囊胚率。囊胚形成率和优质囊胚率。囊胚形成率和优质囊胚率。


技术研发人员：千日成
受保护的技术使用者：艾尔斯（浙江）医学科技有限公司
技术研发日：2021.11.25
技术公布日：2022/3/8