一种金黄色丝绵专用型家蚕品种的培育方法

1.本发明涉及家蚕育种技术领域，尤其涉及一种金黄色丝绵专用型家蚕品种的培育方法。


背景技术：

2.蚕丝是世界上消费量最大的蛋白质纤维。中国是传统的蚕业大国，长期以来，由于蚕桑生产的目的产物是用于丝绸织物的生丝，蚕品种的选育目标集中于蚕茧优质、高产、家蚕强健易养等经济性状方面的提高与突破。蚕丝由外层丝胶和内层丝素蛋白构成，蚕茧缫丝的生丝织绸后需要炼胶，即把大部分丝胶脱去，使得织物柔软有珍珠光泽。
3.目前，我国生产上推广的蚕品种都是以生产高质量生丝为目的，其外层的丝胶含量在24-26％左右，丝胶含量太高影响蚕茧的解舒，并且是一种生产浪费，丝胶含量太低则生丝抱合度差，生丝在织造过程易发生分离而断裂，影响织造的效率和成品的质量。然而，随着人们生活水平的提高，近些年来，以国内消费市场为主的蚕丝被产业迅速发展，以“天然、舒适、健康、易储藏”为特点的蚕丝被成为百姓家庭消费的新亮点，已成为茧丝绸行业发展的一个支柱产品。据报道，2019年全国全年产蚕丝被1117万条，消耗的蚕茧占全国蚕茧产量的22％。针对蚕丝被产业发展需求，丝绵被专用型家蚕新品种的选育也引起了家蚕育种学家们的关注。如蚕丝被专用型蚕品种“丝棉1号”于2019年5月27日在缙云召开了农村生产试验现场考察会，通过了浙江省农作物品种审定委员会桑蚕专业组专家现场考察。以该品种的蚕茧为原料，生产丝棉和蚕丝被，出棉率比对照种秋丰
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白玉提高11.50％。该品种应用传统杂交育种技术结合纯系定向选择技术，经多年累代选育，茧层较厚，但其丝胶含量与普通品种并没有明显差异。可以说家蚕实用蚕品种在丝量、丝质与体质的平衡点已经达到极限状态，应用传统育种技术要有更大的突破相当困难。传统的育种方法已不能完全满足蚕业多方位、高层次发展的需求。
4.随着分子生物学特别是基因工程技术的研究突破，利用dna重组技术来改良家蚕品种和创新种质资源已经显得越来越迫切。探索和发展新的育种手段是获得有效目的性状从而实现家蚕种质资源创新的有效途径之一。通过基因工程进行的分子育种，比传统的杂交育种不仅具有育种目的明确和缩短育种周期的优势，而且它通过基因转移技术将外源基因导入蚕体内，使之在染色体上稳定整合，培育新型转基因家蚕品种，从而达到非常规性育种性状的目标。
5.以丝绵生产为目的的原料茧与传统的丝绸生产为目的原料茧在质量要求上有显著的差异。丝绸生产是先缫制生丝，成品绸再进行炼胶脱去大部分的丝胶，使得成品丝绸展示丝素的柔软飘逸和珍珠光泽，在生丝的缫制工艺中需要蚕茧有比较适中的丝胶含量。而丝绵的生产工艺是先脱胶再拉伸蓬松成形，蚕茧中的大部分丝胶是多余的，且在生产过程产生水体富营养污染，需要增加污水处理的成本。蚕丝蛋白是由丝素轻链蛋白、丝素重链蛋白、p25蛋白、以及5种丝胶蛋白等少数几种蛋白按一定比例组合而成的纤维状蛋白质，如果能把实用家蚕品种通过基因编辑技术敲除部分丝胶基因，可显著减少蚕丝蛋白的丝胶含
量，极大提高蚕丝蛋白的利用效率及丝绵的生产效益。


技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种实用家蚕品种分子设计育种技术，能使实用家蚕品种通过基因编辑技术创制金黄色丝绵专用型家蚕品种选育方法，创制全新的家蚕种质。
7.具体技术方案如下：
8.本发明提供了一种金黄色丝绵专用型家蚕品种的培育方法，包括以下步骤：
9.(1)家蚕在春季饲养产卵后，通过对蚕种进行越夏，冷藏处理，控制蚕卵孵育条件，调节幼虫饲养温度，得到下一代非滞育性蚕卵；
10.(2)提取所述非滞育性蚕卵孵化饲养后5龄幼虫的中部丝腺体基因，获得丝胶蛋白基因的碱基序列，根据crispr/cas9技术的设计原则，针对丝胶蛋白基因的碱基序列设计基因敲除靶点sgrna；
11.(3)基于piggybac转座子构建基因敲除质粒，并将sgrna、cas9基因、丝胶启动子和标记基因连接，获得具有完整表达框的转基因质粒；
12.(4)通过昆虫卵可视化自吸式外源基因导入法，将所述转基因质粒及其辅助质粒注入至家蚕产卵后两个小时内的受精卵中，培养g0代家蚕至化蛾；
13.(5)g0代雌雄蛾自交配后产卵，获得g1代个体，观察g1代孵化蚁蚕，获得具有荧光标记的阳性个体，g1代阳性个体饲养至化蛾后进行雌雄交配，产卵后获得g2代个体，对g2代个体进行基因测序，获得基因表型相同的蛾圈，饲养至化蛾后交配产卵，获得基因敲除的纯合突变体家蚕品种g3代，即为金黄色丝绵专用型家蚕品种。
14.进一步地，步骤(1)和(4)中，所述家蚕的品种为春黄或秋色。但不限定于这两个品种，其他滞育型彩色茧家蚕品种采用类似方法获得非滞育蚕卵亦可。
15.进一步地，步骤(1)中，所述冷藏温度为2～3℃，冷藏至次年3月底；所述孵育的条件为：蚕卵出外库7～8℃保护22～26h；置恒温恒湿箱13～17℃、相对湿度70～80％保护孵育6～8天，17～19℃、相对湿度75～85％孵育12～16天，第20～24天孵化收蚁。
16.进一步地，步骤(1)中，所述幼虫饲养的方法为：孵化后幼虫用桑叶饲养，饲养温度为一龄20℃，二龄21℃，二龄眠22℃，三龄23℃，四龄24℃，五龄25℃，蔟中保护、蛹期保护、交配、产卵均在25℃下进行。
17.进一步地，步骤(2)中，春黄的家蚕丝胶蛋白的碱基序列如seq id no.1所示；秋色的家蚕丝胶蛋白的碱基序列如seq id no.2所示。
18.进一步地，步骤(2)中，所述sgrna的序列为gattatcacagcgatccgaa；当然，其他根据crispr/cas9技术的靶点设计原则，以春黄或秋色丝胶蛋白基因进行设计获得的sgrna均可用于丝胶蛋白的基因敲除。
19.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
20.(1)本发明方法通过控制实用家蚕品种的蚕卵孵育和幼虫饲养技术获得非滞育性蚕卵，利用crispr/cas9系统设计针对蚕卵品种丝胶基因的敲除靶点，基于piggybac转座子构建带有标记基因、靶点序列、启动子等完整表达框的质粒，用昆虫卵可视化自吸式外源基因导入方法将质粒注入非滞育蚕卵中，依据荧光表达和基因测序，创制蚕茧丝胶含量比目
前实用家蚕品种蚕茧低10％以上的家蚕新品种。
21.(2)本发明创制的家蚕品种生产茧丝具有低丝胶含量特征，能够降低丝棉生产过程中的脱胶成本，降低蚕茧生产成本，可极大提高蚕丝蛋白的利用效率及丝绵的生产效益。
22.(3)与普通蚕丝用于丝绵生产比较，本发明所生产蚕丝可显著降低丝胶蛋白的含量，提高丝绵的出绵率，减少丝绵加工过程的丝胶蛋白污染，降低污水处理成本，提高企业经济效益。
23.(4)本发明获得的转基因家蚕可以通过常规的家蚕种繁育技术进行繁育，家蚕幼虫标准饲养技术进行饲养，用于大面积生产的技术和条件与普通实用家蚕品种没有差异，可以直接在生产上推广使用。
附图说明
24.图1为春黄品种家蚕经过基因敲除后生产蚕茧丝胶含量与普通春黄品种家蚕生产蚕茧丝胶含量对比分析。
具体实施方式
25.下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。
26.下列实施例中涉及到的家蚕品种春黄和秋色，均为生产天然金黄色蚕茧的特色家蚕品种，目前已经通过浙江省家蚕品种认定，在浙江湖州、嘉兴和绍兴等地区以及四川南充市等多个地区推广饲养，饲养量已达5万张，在特定点蚕种场均可购买获得。
27.实施例1
28.一种金黄色丝绵专用型家蚕品种的培育方法，具体步骤如下：
29.1、蚕种处理技术：春黄家蚕在春季饲养产卵后用标准技术处理蚕卵，经过越夏、浴消后进，冷库2.5℃冷藏至次年3月底。
30.2、蚕卵孵育条件控制：蚕卵出外库7.5℃保护24h，置恒温恒湿箱15℃、相对湿度75％保护孵育7天，18℃、相对湿度80％孵育14天，第22天孵化收蚁。
31.3、幼虫饲养技术:孵化后用桑叶饲养，采叶、饲喂、消毒等标准按常规饲养技术要求，饲养温度一龄20℃，二龄21℃，二龄眠22℃，三龄23℃，四龄24℃，五龄25℃，蔟中保护、蛹期保护、交配、产卵25℃。
32.4、crispr/cas9靶点设计：根据家蚕基因库中现有sericin1基因序列设计基因扩增引物；引物序列为：前引物atagtcgtcttatcatcgggtctct；后引物ctaggcaacacaattacattttttttc。随后，提取春黄品种家蚕5龄幼虫的中部丝腺体基因，根据引物进行pcr扩增、电泳条带验证后送样测序后，获得春黄丝胶蛋白的基因序列。
33.根据获得的丝胶基因序列和crispr/cas9技术gg-n19-gg的设计原则，靶点通式为5
’‑
nnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-ngg-3’,靶点选择在基因cds的前2/3区域，在外显子上，也可选择在内含子和外显子交界处，并选择多个靶点提高敲除效率。据此设计了针对春黄丝胶蛋白基因两个敲除靶点sgrna1和sgrna2，序列分别为sgrna1:gattatcacagcgatccgaa，sgrna2:aagttcttcgcggtcatctc。用靶点序列在ncbi上进行blast比对，确认靶点专一性，另外扩增靶点周围序列，测序验证靶点序列是否纯合。
34.5、转基因质粒的构建：构建piggybac转座子介导的转基因载体。
35.根据家蚕基因序列设计引物扩增获得ser1启动子，电泳确认后进行纯化得到ser1启动子片段。以商业合成的sgrna骨架质粒为模板，设计引物扩增分别获得sgrna1和sgrna2序列片段，电泳纯化。随后，将两个sgrna分别和ser1启动子经过克隆、t4酶连接，获得ser1-sgrna1和ser1-sgrna2，再通过融合pcr的方法进行连接，最终获得ser1-sgrna1-ser1-sgrna2。pigggybac转座子介导的ca9蛋白表达质粒来源于合作实验室提供，其中cas9蛋白由nos启动，绿色荧光标记蛋白egfp由广谱启动子ie1启动，质粒框架为pbac[ie1-egfp-nos-cas9]。随后，将此质粒酶切获得线性质粒片段，电泳鉴定，胶收后获得目的条带，将此质粒片段克隆与ser1-sgrna进行连接，并进行纯化验证。最后，将融合质粒转化进感受态细胞，进行质粒抽提和纯化，获得具有完整表达框的质粒，pbac[ser1-sgrna-ie1-egfp-nos-cas9]。
[0036]
6、基因导入及突变个体筛选：将上述获得的质粒和提供酶转座基因的辅助质粒同比例混匀后通过“昆虫卵可视化自吸式外源基因导入方法”(中国发明专利200410073439.3)分别注入春黄家蚕产卵后2h以内的受精卵，培养箱中培养约10天后出蚁，为g0代。25℃、80％湿度条件下培养g0代家蚕至化蛾。g0代雌雄蛾自交配后产卵，获得g1代个体。用荧光显微镜观察g1代蚕卵刚孵化后蚁蚕，获得具有荧光标记的阳性个体。g1代阳性个体继续饲养至化蛾后进行雌雄交配，产卵后获得g2代。g2代蚕卵经过浸酸处理后于10天后孵化，继续饲养至5龄后每个蛾区域随机选取家蚕进行基因测序，获得基因表型相同的蛾圈，饲养至化蛾后交配产卵，获得g3代，为基因敲除的纯合突变体家蚕品系。
[0037]
对上述获得的突变体家蚕品系进行表型检测和纯合突变体家蚕吐丝后的蚕茧进行丝胶含量测定。其中，丝胶含量的具体测定方法为：取一定数量蚕茧，茧壳剪碎洗净后晾干称重。将碎茧壳置于2％碳酸钠沸水溶液中脱胶30min，脱茧2次后将丝纤维烘干后称重，根据脱胶前后重量差异确定其丝胶含量，并与非转基因家蚕茧对比确定降低比例。
[0038]
结果如附图1所示，突变体家蚕蚕茧丝胶含量约为12％，而野生型家蚕丝胶含量接近23％。试验证明：基因编辑后的家蚕茧丝丝胶含量显著降低，成功获得金黄色丝绵专用型家蚕品种。
[0039]
实施例2
[0040]
一种金黄色丝绵专用型家蚕品种的培育方法，具体步骤如下：
[0041]
1、蚕种处理技术：秋色家蚕在春季饲养产卵后用标准技术处理蚕卵，经过越夏、浴消后进，冷库2.5℃冷藏至次年3月底。
[0042]
2、蚕卵孵育条件控制：蚕卵出外库7.5℃保护24h，置恒温恒湿箱16℃、相对湿度75％保护孵育7天，19℃、相对湿度80％孵育14天，第24天孵化收蚁。
[0043]
3、幼虫饲养技术:孵化后用桑叶饲养，采叶、饲喂、消毒等标准按常规饲养技术要求，饲养温度一龄20℃，二龄21℃，二龄眠22℃，三龄23℃，四龄24℃，五龄25℃，蔟中保护、蛹期保护、交配、产卵均在25℃进行。
[0044]
4、crispr/cas9靶点设计：根据家蚕基因库中现有丝胶蛋白基因序列设计基因扩增引物；引物序列为：前引物gctatagcagcagcagcagt；后引物tgtacttgaaccgcccgagg。随后，提取秋色品种家蚕5龄幼虫的中部丝腺体基因，根据引物进行pcr扩增、电泳条带验证后送样测序后，获得秋色丝胶蛋白的基因序列。
[0045]
根据获得的丝胶基因序列和crispr/cas9技术gg-n19-gg的设计原则，靶点通式为5
’‑
nnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-ngg-3’,靶点选择在基因cds的前2/3区域，在外显子上，也可选择在内含子和外显子交界处，并选择多个靶点提高敲除效率。据此设计了针对秋色丝胶蛋白基因两个敲除靶点sgrna1和sgrna2，序列分别为sgrna1:ggtggttcctctcaatccag，sgrna2:ggaagcgtaacatccaccga。用靶点序列在ncbi上进行blast比对，确认靶点专一性，另外扩增靶点周围序列，测序验证靶点序列是否纯合。
[0046]
5、转基因质粒的构建：构建piggybac转座子介导的转基因载体。
[0047]
根据家蚕基因序列设计引物扩增获得ser1启动子，电泳确认后进行纯化得到ser1启动子片段。以商业合成的sgrna骨架质粒为模板，设计引物扩增分别获得sgrna1和sgrna2序列片段，电泳纯化。随后，将两个sgrna分别和ser1启动子经过克隆、t4酶连接，获得ser1-sgrna1和ser1-sgrna2，再通过融合pcr的方法进行连接，最终获得ser1-sgrna1-ser1-sgrna2。pigggybac转座子介导的ca9蛋白表达质粒来源于合作实验室提供，其中cas9蛋白由nos启动，绿色荧光标记蛋白egfp由广谱启动子ie1启动，质粒框架为pbac[ie1-egfp-nos-cas9]。随后，将此质粒酶切获得线性质粒片段，电泳鉴定，胶收后获得目的条带，将此质粒片段克隆与ser1-sgrna进行连接，并进行纯化验证。最后，将融合质粒转化进感受态细胞，进行质粒抽提和纯化，获得具有完整表达框的质粒，pbac[ser1-sgrna-ie1-egfp-nos-cas9]。
[0048]
6、基因导入及突变个体筛选：将上述获得的质粒和提供酶转座基因的辅助质粒同比例混匀后通过“昆虫卵可视化自吸式外源基因导入方法”(中国发明专利200410073439.3)分别注入秋色家蚕产卵后2h以内的受精卵，培养箱中培养约10天后出蚁，为g0代。25℃、80％湿度条件下培养g0代家蚕至化蛾。g0代雌雄蛾自交配后产卵，获得g1代个体。用荧光显微镜观察g1代蚕卵刚孵化后蚁蚕，获得具有荧光标记的阳性个体。g1代阳性个体继续饲养至化蛾后进行雌雄交配，产卵后获得g2代。g2代蚕卵经过浸酸处理后于10天后孵化，继续饲养至5龄后每个蛾区域随机选取家蚕进行基因测序，获得基因表型相同的蛾圈，饲养至化蛾后交配产卵，获得g3代，为基因敲除的纯合突变体家蚕品系。
[0049]
对上述获得的突变体家蚕品系进行表型检测和纯合突变体家蚕吐丝后的蚕茧进行丝胶含量测定。其中，丝胶含量的具体测定方法为：取一定数量蚕茧，茧壳剪碎洗净后晾干称重。将碎茧壳置于2％碳酸钠沸水溶液中脱胶30min，脱茧2次后将丝纤维烘干后称重，根据脱胶前后重量差异确定其丝胶含量，并与非转基因家蚕茧对比确定降低比例。
[0050]
试验证明：基因编辑后的秋色家蚕茧丝丝胶含量显著降低，成功获得金黄色丝绵专用型家蚕品种。

技术特征：
1.一种金黄色丝绵专用型家蚕品种的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)家蚕在春季饲养产卵后，通过对蚕种进行越夏，冷藏处理，控制蚕卵孵育条件，调节幼虫饲养温度，得到下一代非滞育性蚕卵；(2)提取所述非滞育性蚕卵孵化饲养后5龄幼虫的中部丝腺体基因，获得丝胶蛋白基因的碱基序列，根据crispr/cas9技术的设计原则，针对丝胶蛋白基因的碱基序列设计基因敲除靶点sgrna；(3)基于piggybac转座子构建基因敲除质粒，并将sgrna、cas9基因、丝胶启动子和标记基因连接，获得具有完整表达框的转基因质粒；(4)通过昆虫卵可视化自吸式外源基因导入法，将所述转基因质粒及其辅助质粒注入至家蚕产卵后两个小时内的受精卵中，培养g0代家蚕至化蛾；(5)g0代雌雄蛾自交配后产卵，获得g1代个体，观察g1代孵化蚁蚕，获得具有荧光标记的阳性个体，g1代阳性个体饲养至化蛾后进行雌雄交配，产卵后获得g2代个体，对g2代个体进行基因测序，获得基因表型相同的蛾圈，饲养至化蛾后交配产卵，获得基因敲除的纯合突变体家蚕品种g3代，即为金黄色丝绵专用型家蚕品种。2.如权利要求1所述的金黄色丝绵专用型家蚕品种的培育方法，其特征在于，步骤(1)和(4)中，所述家蚕的品种为春黄或秋色。3.如权利要求1所述的金黄色丝绵专用型家蚕品种的培育方法，其特征在于，步骤(1)中，所述冷藏温度为2～3℃，冷藏至次年3月底；所述孵育的条件为：蚕卵出外库7～8℃保护22～26h；置恒温恒湿箱13～17℃、相对湿度70～80％保护孵育6～8天，17～19℃、相对湿度75～85％孵育12～16天，第20～24天孵化收蚁。4.如权利要求1所述的金黄色丝绵专用型家蚕品种的培育方法，其特征在于，步骤(1)中，所述幼虫饲养的方法为：孵化后幼虫用桑叶饲养，饲养温度为一龄20℃，二龄21℃，二龄眠22℃，三龄23℃，四龄24℃，五龄25℃，蔟中保护、蛹期保护、交配和产卵均在25℃下进行。5.如权利要求2所述的金黄色丝绵专用型家蚕品种的培育方法，其特征在于，步骤(2)中，春黄的丝胶蛋白的碱基序列如seq id no.1所示；秋色的丝胶蛋白的碱基序列如seq id no.2所示。6.如权利要求5所述的金黄色丝绵专用型家蚕品种的培育方法，其特征在于，步骤(2)中，靶点序列根据crispr/cas9技术的设计原则获得，所述sgrna的序列为gattatcacagcgatccgaa。

技术总结
本发明公开了一种金黄色丝绵专用型家蚕品种的培育方法，该方法通过控制实用家蚕品种的蚕卵孵育和幼虫饲养技术获得非滞育性蚕卵，利用CRISPR/Cas9系统设计针对蚕卵品种丝胶基因的敲除靶点，基于PiggyBac转座子构建带有标记基因、靶点序列、启动子等完整表达框的质粒，用昆虫卵可视化自吸式外源基因导入方法将质粒注入非滞育蚕卵中，依据荧光表达和基因测序，创制蚕茧丝胶含量比目前实用家蚕品种蚕茧低10％以上的家蚕新品种。本发明创制的家蚕品种生产茧丝具有低丝胶含量特征，能够降低丝棉生产过程中的脱胶成本，降低蚕茧生产成本，可极大提高蚕丝蛋白的利用效率及丝绵的生产效益。益。益。


技术研发人员：陈玉银 王捷 谷利群 杨明英
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2021.11.10
技术公布日：2022/3/8