一种同时检测干血片中多种新生儿筛查代谢物的方法与流程

1.本发明涉及一种代谢物的检测方法，尤其涉及一种同时检测干血片中多种新生儿筛查代谢物的方法。


背景技术：

2.串联质谱方法由于其高灵敏性、高特异性及高通量等优点，被广泛应用于新生儿遗传代谢病筛查。目前常用串联质谱法测量和评估采集到滤纸片上的新生儿干血样中的氨基酸、游离肉碱及酰基肉碱的浓度，通过半定量法得到分析物的浓度分布，从而诊断30多种疾病。
3.然而，有些疾病仅依赖目前的检测指标很难区分，如尿素循环障碍中的氨甲酰磷酸合成酶(cps)缺乏症和鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症(oct)都会引起瓜氨酸降低，以往对于瓜氨酸降低的新生儿，一般都会召回留取尿液进行乳清酸检测来鉴别诊断。若能在初筛时增加“乳清酸”这个新的标志物，既能避免新生儿留尿困难，又能在血片初筛时就能进行疾病的鉴别诊断，尽早得到治疗，以符合新生儿筛查的宗旨。
4.目前的常规新生儿筛查方法，仅包括常规的氨基酸和c0-c18的游离和酰基肉碱，常常缺少对于c20-/c22-/c24-/c26-溶血卵磷脂酰胆碱(c20-/c22-/c24-/c26-lpc)和极长链酰基肉碱(c20-/c22-/c24-/c26-脂酰肉碱)的检测。其中c26-lpc是x连锁肾上腺脑白质营养不良及其它过氧化物酶体病的标志物，其它几个化合物对过氧化物酶体病的诊断和分型判断等也具有一定的作用。
5.目前公布的关于新生儿筛查检测方法的专利中，仅对个别组分进行方法学建立，然而，关于常规的氨基酸、酰基肉碱、c20-/c22-/c24-/c26-溶血卵磷脂酰胆碱和乳清酸并没有统一的测试方法。例如，专利文献cn109164194a仅对c20-/c22-/c24-/c26-溶血卵磷脂酰胆碱进行了分析，并没有和常规的检测项目融合；专利文献cn110187012a和cn103278584b仅介绍了常规的氨基酸、酰基肉碱的检测方法。
6.因此，为了满足氨基酸代谢异常(包括尿素循环障碍)、有机酸代谢异常和脂肪酸氧化代谢异常以及过氧化酶体病四大类代谢障碍疾病的筛查检测需求，有必要对现有新生儿代谢物的筛查方法进行改进。


技术实现要素：

7.本发明所要解决的技术问题是提供一种同时检测干血片中多种新生儿筛查代谢物的方法，操作简单，使用相同的前处理条件和仪器条件就能实现氨基酸、肉碱、溶血卵磷脂酰胆碱类、酮类、乳清酸五大类物质的同时检测，缩减了检测工作步骤和时间，提高了检测效率。
8.本发明为解决上述技术问题而采用的技术方案是提供一种同时检测干血片中多种新生儿筛查代谢物的方法，包括如下步骤：获取包括乳清酸的代谢物作为样品，其特征在于，包括如下步骤：s1、使用提取液从所述样品中提取所述代谢物；s2、提供包含已知量的一
种或多种稳定同位素标记的内标溶液，所述内标溶液对应于样品中待检测的代谢物；s3、使所述代谢物和所述内标溶液离子化以产生离子；s4、多反应监测模式下在质谱图中获得一种或多种离子的质荷比；以及s5、在多反应监测模式下确定乳清酸的信号强度；s6、使用对应于以上代谢物的稳定同位素标记的内标溶液，检测和定量乳清酸的量。
9.进一步地，所述代谢物包含氨基酸、游离和酰基肉碱、溶血卵磷脂酰胆碱、琥珀酰丙酮和极长碳链的酰基肉碱中的一种或多种。
10.进一步地，所述氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、瓜氨酸、甘氨酸、亮氨酸/异亮氨酸/羟基脯氨酸、蛋氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸和/或缬氨酸；
11.所述游离和酰基肉碱包括游离肉碱、乙酰肉碱、丙酰肉碱、丙二酰肉碱/3-羟基-异戊酰肉碱、异戊酰肉碱、异戊烯酰肉碱、戊二酰肉碱/3-羟基-己酰肉碱、己酰肉碱、己二酰肉碱、辛酰肉碱、辛烯酰肉碱、癸酰肉碱、癸烯酰肉碱、癸二烯酰肉碱、十二碳酰肉碱、十二碳烯酰肉碱、十四碳酰肉碱、十四碳烯酰肉碱、十四碳二烯酰肉碱、3-羟基-十四碳酰肉碱、十六碳酰肉碱、十六碳烯酰肉碱、3-羟基-十六碳酰肉碱、3-羟基-十六碳烯酰肉碱、十八碳酰肉碱、十八碳烯酰肉碱、十八碳二烯酰肉碱、3-羟基-十八碳酰肉碱和/或3-羟基-十八碳烯酰肉碱；
12.所述极长碳链的酰基肉碱包括c20-脂酰肉碱、c22-脂酰肉碱、c24-脂酰肉碱和/或c26-脂酰肉碱；
13.所述溶血卵磷脂酰胆碱包括c20-lpc、c22-lpc、c24-lpc和/或c26-lpc。
14.进一步地，所述提取液由甲醇、水和羧酸组成，所述甲醇的体积含量为50％-100％，羧酸浓度为0.05-1mol/l，溶剂为水，所述羧酸选自甲酸、乙酸和草酸中的一种或其组合。
15.进一步地，所述样品为体液样品或血液样品。
16.进一步地，所述样品为干燥的血液样品。
17.进一步地，所述步骤s3通过将提取的代谢物和内标溶液制成的标准品通过液相系统输送至质谱仪的离子源进行离子化，所述步骤s4使用三重四极杆质谱仪或高分辨率质谱仪获取一种或多种离子的质荷比，所述步骤s5通过选择至少一种精确的质荷比离子确定乳清酸的信号强度。
18.进一步地，所述液相系统所用的流动相溶液由乙腈、水和饱和一元羧酸组成，所述乙腈的体积含量为50％-100％，所述饱和一元羧酸浓度为0.05-1mol/l，溶剂为水，所述饱和一元羧酸为甲酸、乙酸、丙酸或丁酸。
19.进一步地，所述内标溶液为对应于以下一种或多种稳定同位素标记的内标准品：丙氨酸、精氨酸、瓜氨酸、甘氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、游离肉碱、乙酰肉碱、丙酰肉碱、丙二酰肉碱、异戊酰肉碱、戊二酰肉碱、己酰肉碱、辛酰肉碱、癸酰肉碱、癸烯酰肉碱、十二碳酰肉碱、十四碳酰肉碱、十六碳酰肉碱、十八碳酰肉碱、c26-脂酰肉碱、c26-lpc、乳清酸和琥珀酰丙酮衍生物3-(5甲基-1h-吡唑-3yl)丙酸。
20.进一步地，所述内标溶液为对应于以下一种或多种稳定同位素标记的内标准品：2h
4-丙氨酸，2h4,
13
c-精氨酸、2h
2-瓜氨酸、
14
n,2-13
c-甘氨酸、2h
3-亮氨酸、2h
3-蛋氨酸、2h
6-鸟氨酸、
13c6-苯丙氨酸、
13c5-脯氨酸、
13c6-酪氨酸、2h
4-缬氨酸、2h
9-游离肉碱、2h
3-乙酰肉碱、2h
3-丙酰肉碱、2h
6-戊二酰肉碱、2h
3-丁酰肉碱、2h
9-异戊酰肉碱、2h
3-己酰肉碱、2h
3-辛酰肉
碱、2h
3-癸酰肉碱、2h
3-十二碳酰肉碱、2h
3-十四碳酰肉碱、2h
3-十六碳酰肉碱、2h
3-十八碳酰肉碱、2h
3-二十六碳酰肉碱、2h
4-c26:0-lpc、
15n2-乳清酸和
13c5-mpp3。
21.本发明对比现有技术有如下的有益效果：本发明提供的同时检测干血片中多种新生儿筛查代谢物的方法，操作简单，使用相同的前处理条件和仪器条件，可实现氨基酸、肉碱、溶血卵磷脂酰胆碱类、酮类、乳清酸五大类物质的同时检测，缩减了检测工作步骤和时间，提高了检测效率。此外，本发明避免了被召回的新生儿的重新检测，对提高代谢病的诊断水平，提高患儿代谢病筛查效率，减少社会负担，提高人口素质有重要意义。
附图说明
22.图1为本发明的分析物及同位素(共69种)标准总离子流图；
23.图2为本发明的分析物及同位素(共67种)标准总离子流图(正离子模式)；
24.图3为本发明的分析物及同位素(共2种)标准总离子流图(负离子模式)；
25.图4为本发明的32种分析物的标准曲线。
具体实施方式
26.下面结合附图和实施例对本发明作进一步的描述。
27.本发明的目的在于提供同时检测干血片中多种遗传代谢疾病相关物质的方法，包括：常规的氨基酸、c0-c18的游离和酰基肉碱、乳清酸、琥珀酰丙酮、c20-/c22-/c24-/c26-溶血卵磷脂酰胆碱(c20-/c22-/c24-/c26-lpc)和极长链酰基肉碱(c20-/c22-/c24-/c26-脂酰肉碱)。也就是说，本发明除了能检测常规的氨基酸和c0-c18的游离和酰基肉碱之外，还能够同时检测其他10种有机化合物，使得一个样品同时检测化合物的总数达到了52种。新增的这10种有机化合物可以分为三类：
①
乳清酸，它是鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症的标志物；
②
琥珀酰丙酮，它是i型酪氨酸血症的标志物；
③
c20-/c22-/c24-/c26-溶血卵磷脂酰胆碱(c20-/c22-/c24-/c26-lpc)和极长链酰基肉碱(c20-/c22-/c24-/c26-脂酰肉碱)的检测。这就把串联质谱从三大类疾病检测扩展为氨基酸代谢异常(包括尿素循环障碍)、有机酸代谢异常和脂肪酸氧化代谢异常以及过氧化酶体病四大类代谢障碍疾病。
28.为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
29.(1)提取工作液的制备：将内标准品配制成储备液后，再由萃取液和琥珀酰丙酮处理液稀释，制成提取工作液；
30.其中，如果不检测琥珀酰丙酮，则可以不需要添加琥珀酰丙酮处理液，直接加入萃取液即可制成提取工作液，如果检测琥珀酰丙酮，则可以需要添加萃取液和琥珀酰丙酮处理液制成提取工作液；
31.(2)采用步骤(1)制备的提取工作液对待测血片样本进行孵育；
32.(3)对步骤(2)孵育的产物取上清液，采用液相-串联质谱进行检测，使所述代谢物和所述一种或多种稳定同位素标记的内标离子化以产生离子；在多反应监测(mrm)模式下在质谱图中获得所述一种或多种离子的质荷比(m/z)，以及在mrm模式下确定分析物的总和。使用对应于以上分析物的稳定同位素标记的内标，检测和定量分析物的量。
33.其中，内标准品包括氨基酸同位素内标准品、肉碱同位素内标准品、c26-溶血卵磷脂酰胆碱同位素内标准品、琥珀酰丙酮衍生后产物(3-(5甲基-1h-吡唑-3yl)丙酸)同位素
内标准品和乳清酸同位素内标准品；琥珀酰丙酮处理液中含有水合肼；
34.在一些实施例中，所述琥珀酰丙酮样本前处理液由水合肼、水组成，其中水合肼的含量为100-1000mg/l，优选200mg/l-600mg/l。
35.需要说明的是，本发明的检测方法，在提取工作液中添加氨基酸同位素内标准品、肉碱同位素内标准品、c26-溶血卵磷脂酰胆碱同位素内标准品、琥珀酰丙酮衍生后产物(3-(5甲基-1h-吡唑-3yl)丙酸)同位素内标准品和乳清酸同位素内标准品，并采用串联质谱，可以实现氨基酸、肉碱、溶血卵磷脂酰胆碱类、酮类、乳清酸五大类物质的同时检测。本发明的方法，只需要一次采血就可以完成氨基酸代谢异常(包括尿素循环障碍)、有机酸代谢异常和脂肪酸氧化代谢异常以及过氧化酶体病等多种类的多项疾病的筛查，一方面缩减了检测工作步骤和时间，提高了检测效率，另一方面，能避免被召回的新生儿的重新检测，能在血片初筛时就能进行疾病的鉴别诊断，使尽早得到治疗。
36.还需要说明的是，本发明的提取工作液中，氨基酸同位素内标准品、肉碱同位素内标准品、c26-溶血卵磷脂酰胆碱同位素内标准品、琥珀酰丙酮衍生后产物(3-(5甲基-1h-吡唑-3yl)丙酸)同位素内标准品和乳清酸同位素内标准品可以采用市售的各种同位素标准品，在此不做具体限定。在本发明的优选方案中，对氨基酸同位素内标准品、肉碱同位素内标准品、c26-溶血卵磷脂酰胆碱同位素内标准品、琥珀酰丙酮衍生后产物(3-(5甲基-1h-吡唑-3yl)丙酸)同位素内标准品和乳清酸同位素内标准品进行了限定。
37.步骤(1)中，萃取液由甲醇、水、羧酸组成，其中甲醇含量为50％-100％(v/v)，羧酸浓度为0.05-1mol/l，溶剂为水，所述羧酸选自下组：甲酸、乙酸、草酸，或其组合。
38.优选的，步骤(1)中的内标准品包括：2h
4-丙氨酸，2h4,
13
c-精氨酸、2h
2-瓜氨酸、
14
n,2-13
c-甘氨酸、2h
3-亮氨酸、2h
3-蛋氨酸、2h
6-鸟氨酸、
13c6-苯丙氨酸、
13c5-脯氨酸、
13c6-酪氨酸、2h
4-缬氨酸、2h
9-游离肉碱、2h
3-乙酰肉碱、2h
3-丙酰肉碱、2h
6-戊二酰肉碱、2h
3-丁酰肉碱、2h
9-异戊酰肉碱、2h
3-己酰肉碱、2h
3-辛酰肉碱、2h
3-癸酰肉碱、2h
3-十二碳酰肉碱、2h
3-十四碳酰肉碱、2h
3-十六碳酰肉碱、2h
3-十八碳酰肉碱、2h
3-二十六碳酰肉碱、2h
4-c26:0-lpc、
15n2-乳清酸、
13c5-mpp3。
39.优选的，步骤(2)中孵育的条件为40-50℃，650-750rpm条件下振荡30-40分钟。
40.需要说明的是，本发明的一种实现方式中，采用2h
4-丙氨酸，2h4,
13
c-精氨酸、2h
2-瓜氨酸、
14
n,2-13
c-甘氨酸、2h
3-亮氨酸、2h
3-蛋氨酸、2h
6-鸟氨酸、
13c6-苯丙氨酸、
13c5-脯氨酸、
13c6-酪氨酸、2h
4-缬氨酸、2h
9-游离肉碱、2h
3-乙酰肉碱、2h
3-丙酰肉碱、2h
6-戊二酰肉碱、2h
3-丁酰肉碱、2h
9-异戊酰肉碱、2h
3-己酰肉碱、2h
3-辛酰肉碱、2h
3-癸酰肉碱、2h
3-十二碳酰肉碱、2h
3-十四碳酰肉碱、2h
3-十六碳酰肉碱、2h
3-十八碳酰肉碱、2h
3-二十六碳酰肉碱、2h
4-c26:0-lpc、
15n2-乳清酸、
13c5-mpp3，这几种同位素内标准品，按照本发明的半定量方法，通过结构近似的内标定量分析物，可以对至少42种分析物进行检测。
41.步骤(3)中，所述离子化步骤是通过将所述提取的代谢物和标准品通过液相系统输送至质谱仪的离子源而进行，和/或其中所述数据获得是使用三重四极杆质谱仪或高分辨率质谱仪进行，和/或其中所述步骤(3)是通过选择至少一种精确的质荷比(m/z)离子而进行，所述精确的质荷比离子对应于所述样品中存在的所述一种或多种代谢物的至少一种计算的质荷比(m/z)。
42.步骤(3)中，液相系统所用的流动相溶液由乙腈、水、饱和一元羧酸组成，其中乙腈
含量为50％-100％(v/v)，优选70％-90％(v/v)，饱和一元羧酸浓度为0.05-1mol/l，溶剂为水，所述羧酸为甲酸、乙酸、丙酸或丁酸，其中优选为甲酸。
43.在一些实施例中，所述前处理方法还需用到v型截底96孔萃取板、v型底96孔检测板、粘性萃取板贴膜和检测板铝箔。
44.本发明采用串联质谱仪电喷雾正/负离子模式。辅助加热气温度350-450℃，优选为400℃；质谱接口加热温度200-300℃，优选为250℃；喷雾电压正离子模式+4500-5500v，优选为5000v；负离子模式电压-3500—4500v，优选为-4000v；反吹气80-120，优选为100；雾化气220-280，优选为250。多反应监测(mrm)模式收集数据。
45.优选地，在所述的步骤(3)中的质谱条件中，多反应检测离子对(mrm)及相应的参数如表1：
46.表1多反应监测离子对(mrm)及相应的电压等参数
47.[0048][0049]
下列实施例中未标注具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。下列较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0050]
仪器、材料与试剂
[0051]
qsight 220lc-ms/ms(美国perkinelmer公司)；milli-q plus超纯水仪(美国millipore公司)；微孔板恒温振荡器wz80-2(美国thermofisher公司)；电子天平xpe105(瑞士mettler公司)；用于切割直径为3.2mm(1/8英寸)的滤纸血片的手动打孔器；前处理用96孔板(v型截底，洁净微孔板，无包被，96孔)、上样用96孔板(v型底，耐热微孔板，无包被，96孔)粘性微孔板封套及铝箔制微孔板封套来自美国perkinelmer公司。
[0052]
标准品包括14种氨基酸、25种酰基肉碱、琥珀酰丙酮、乳清酸、c20-/c22-/c24-/c26-溶血卵磷脂酰胆碱，以及对应的稳定同位素混合标准品。用到的试剂和药品：甲醇、乙腈、甲酸、无水草酸均为lc-ms级，水为超纯水，空白人全血来自上海市儿童医院，滤纸型号为whatman 903滤纸干血片采集卡。
[0053]
所涉及到的标准品的说明如表1所示。
[0054]
表1所用标准物质信息表
[0055]
[0056][0057]
本实施例的检测方法包括下列步骤：
[0058]
1、制备内标储备溶液和混合内标中间液
[0059]
a配制储备液：准备以下内标标准品原料：2h
4-丙氨酸，2h4,
13
c-精氨酸、2h
2-瓜氨酸、
14
n,2-13
c-甘氨酸、2h
3-亮氨酸、2h
3-蛋氨酸、2h
6-鸟氨酸、
13c6-苯丙氨酸、
13c5-脯氨酸、
13c6-酪氨酸、2h
4-缬氨酸、2h
9-游离肉碱、2h
3-乙酰肉碱、2h
3-丙酰肉碱、2h
6-戊二酰肉碱、2h
3-丁酰肉碱、2h
9-异戊酰肉碱、2h
3-己酰肉碱、2h
3-辛酰肉碱、2h
3-癸酰肉碱、2h
3-十二碳酰肉碱、2h
3-十四碳酰肉碱、2h
3-十六碳酰肉碱、2h
3-十八碳酰肉碱、2h
3-二十六碳酰肉碱、2h
4-c26:0-lpc、
15n2-乳清酸、
13c5-mpp3，采用重量重量法或母液稀释法配置含目标物的标准溶液，溶液为水、甲醇、甲酸或其组合，浓度为1
×
10
2-1
×
107umol/l，内标储备液可在+2～+8℃冰箱或-20℃冰箱密封保存。
[0060]
b配制混合内标中间液，按照以下三种类型:
[0061]
①
氨基酸混合内标，包括2h
4-丙氨酸，2h4,
13
c-精氨酸、2h
2-瓜氨酸、
14
n,2-13
c-甘氨酸、2h
3-亮氨酸、2h
3-蛋氨酸、2h
6-鸟氨酸、
13c6-苯丙氨酸、
13c5-脯氨酸、
13c6-酪氨酸、2h
4-缬氨酸，
[0062]
②
肉碱混合内标，包括2h
9-游离肉碱、2h
3-乙酰肉碱、2h
3-丙酰肉碱、2h
6-戊二酰肉碱、2h
3-丁酰肉碱、2h
9-异戊酰肉碱、2h
3-己酰肉碱、2h
3-辛酰肉碱、2h
3-癸酰肉碱、2h
3-十二碳酰肉碱、2h
3-十四碳酰肉碱、2h
3-十六碳酰肉碱、2h
3-十八碳酰肉碱、2h
3-二十六碳酰肉碱，
[0063]
③
其他混合内标，包括2h
4-c26:0-lpc、
15n2-乳清酸、
13c5-mpp3。
[0064]
其中稀释溶液为为萃取液，稀释倍数为10-1000倍，混合内标中间液可在+2～+8℃冰箱或-20℃冰箱密封保存。
[0065]
2、工作液制备
[0066]
a.将混合内标中间液放置室温20分钟。
[0067]
b.以每孔125ul萃取液用量，计算当日测定样本和质控所需的萃取液总量。
[0068]
c.按稀释倍数萃取剂：同位素标记氨基酸内标液为100：1、萃取剂：同位素标记肉碱内标液为100：1、萃取剂：同位素标记其他混合内标(2h
4-c26:0-lpc、
15n2-乳清酸、
13c5-mpp3)为100：1、和/或萃取剂：琥珀酰丙酮样本前处理液为40：1配制包含氨基酸混合内标、肉碱混合内标、其他混合内标和/或琥珀酰丙酮样本前处理液的工作液。例如测10个样品，配13ml含内标的萃取工作液。取12.35ml萃取液，分别加入0.13ml氨基酸混合内标中间液、0.13ml酰基肉碱混合内标中间液、0.13ml其他混合内标中间液和/或0.26ml琥珀酰丙酮样本前处理液，即配成工作液。(注意，如果不需要测试琥珀酰丙酮，可以不加入琥珀酰丙酮前处理液。)
[0069]
d.工作液24小时稳定。
[0070]
e.内标工作液的浓度范围和优选范围如表2所示。
[0071]
表2内标工作液的浓度范围和优选范围
[0072][0073][0074]
3、取样
[0075]
将质控血片、样本血片在96孔萃取板排序。用3.2mm打孔器顺序将血片打入v型截底96孔萃取板中。
[0076]
4、样本萃取
[0077]
5、将125ul含内标和琥珀酰丙酮样本前处理液的日常工作萃取液分别加入到96孔板的反应孔中，萃取样本。用粘性贴膜密封孔板。在40-50℃的孵育震荡其中，650-750rpm震荡25-35分钟。
[0078]
6、样本上机检测
[0079]
a.揭去密封膜。用移液器移出100ul溶液，顺序置入v型底96孔检测板。用铝箔密封96孔板。如果用于测试琥珀酰丙酮，转移溶液后在第1次测量之间必须留足1小时，以使得琥珀酰丙酮完全衍生化。仪器的日常维护和运行设置可以在此期间进行。
[0080]
b.样品放入质谱自动进样器托盘，供质谱检测，进样量10ul，每针之间用50％甲醇水溶液满针洗4次。进样速度：0-0.1min为0.10ml/min，0.1-0.16min为0.012ml/min，0.16-1.8min为0.70ml/min，1.8-1.9min为0.10ml/min。每份样本1.9min。采用串联质谱仪电喷雾正/负离子模式。离子源温度400℃，解离温度250℃，喷雾电压正离子模式+5.0kv，负离子模式-4.0kv，反吹气100，雾化气250。多反应监测(mrm)模式收集数据。每个离子对10ms依次循环检测离子对，每份样本采集0.4-1.7min时间段的检测信号，叠加信号强度供定量。样本可保存约12小时供质谱检测。分析物的多反应监测条件如表3所示。
[0081]
表3串联质谱检测多种分析物的多反应监测条件
[0082]
[0083][0084]
[0085]
*行内的这些分析物为同分异构体或同分子量，在串联质谱试验中无法将它们区分。
[0086]
其中，图1显示69种分析物及同位素标准总离子流图，图2显示了正离子模式下67种分析物及同位素标准总离子流图，图3显示了负离子模式下2种分析物及同位素标准总离子流图。
[0087]
取处理好的质控品和检测样本注入高效液相色谱-串联质谱仪进行检测，记录色谱图与检测样本中多种分析物的峰面积和多种分析物同位素内标的离子强度。
[0088]
计算公式：样品浓度＝相关因子
×
内标浓度
×
内标离子强度/外标离子强度；其中待测物对应内标的浓度单位μmol/l，内标为同位素标记的内标准品。
[0089]
选用混合实验的方法来考察标准品和内标的相对基质效应。具体操作方法：将空白干血斑样品经前处理后加入标准品工作液制成干血片基质样本，同时将萃取液加入标准品工作液制成溶剂基质样本，并将干血片基质样本和溶剂基质样本按照质量比1：1混合，将这三种基质样本中待测物与内标的峰面积比值计算，考察方法的绝对基质效应(me％)。如果1：1混合液样本的响应值与生物基质样本和纯溶液样本响应的均值相比，差值低于20％，则证明基质效应是否存在并不影响目标分析物的准确定量。考察了种分析物的基质效应，结果表明，所有被考察的分析物的基质效应偏差《20％，均符合要求(表4)。
[0090]
表4 35种分析物的相对基质效应结果
[0091]
[0092]
[0093]
[0094][0095]
进行32种分析物的在干血片的加标线性实验，设置至少6个非零浓度点，每个点测定2次，将结果进行线性拟合，所有分析物的线性方程和相关系数均符合要求，且r2》0.99，详细见图4。32种分析物分别为：丙氨酸、精氨酸、瓜氨酸、甘氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、c0、c2、c3、c4、c3dc+c4oh、c5、c6、c5dc、c8、c10、c12、c14、c16、c16oh、c18、c18oh、c20-lpc、c22-lpc、c24-lpc、c26-lpc、乳清酸、琥珀酰丙酮。
[0096]
虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的修改和完善，因此本发明的保护范围当以权利要求书所界定的为准。

技术特征：
1.一种同时检测干血片中多种新生儿筛查代谢物的方法，获取包括乳清酸的代谢物作为样品，其特征在于，包括如下步骤：s1、使用提取液从所述样品中提取所述代谢物；s2、提供包含已知量的一种或多种稳定同位素标记的内标溶液，所述内标溶液对应于样品中待检测的代谢物；s3、使所述代谢物和所述内标溶液离子化以产生离子；s4、多反应监测模式下在质谱图中获得一种或多种离子的质荷比；以及s5、在多反应监测模式下确定乳清酸的信号强度；s6、使用对应于以上代谢物的稳定同位素标记的内标溶液，检测和定量乳清酸的量。2.如权利要求1所述的同时检测干血片中多种新生儿筛查代谢物的方法，其特征在于，所述代谢物包含氨基酸、游离和酰基肉碱、溶血卵磷脂酰胆碱、琥珀酰丙酮和极长碳链的酰基肉碱中的一种或多种。3.如权利要求2所述的同时检测干血片中多种新生儿筛查代谢物的方法，其特征在于，所述氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、瓜氨酸、甘氨酸、亮氨酸/异亮氨酸/羟基脯氨酸、蛋氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸和/或缬氨酸；所述游离和酰基肉碱包括游离肉碱、乙酰肉碱、丙酰肉碱、丙二酰肉碱/3-羟基-异戊酰肉碱、异戊酰肉碱、异戊烯酰肉碱、戊二酰肉碱/3-羟基-己酰肉碱、己酰肉碱、己二酰肉碱、辛酰肉碱、辛烯酰肉碱、癸酰肉碱、癸烯酰肉碱、癸二烯酰肉碱、十二碳酰肉碱、十二碳烯酰肉碱、十四碳酰肉碱、十四碳烯酰肉碱、十四碳二烯酰肉碱、3-羟基-十四碳酰肉碱、十六碳酰肉碱、十六碳烯酰肉碱、3-羟基-十六碳酰肉碱、3-羟基-十六碳烯酰肉碱、十八碳酰肉碱、十八碳烯酰肉碱、十八碳二烯酰肉碱、3-羟基-十八碳酰肉碱和/或3-羟基-十八碳烯酰肉碱；所述极长碳链的酰基肉碱包括c20-脂酰肉碱、c22-脂酰肉碱、c24-脂酰肉碱和/或c26-脂酰肉碱；所述溶血卵磷脂酰胆碱包括c20-lpc、c22-lpc、c24-lpc和/或c26-lpc。4.如权利要求1所述的同时检测干血片中多种新生儿筛查代谢物的方法，其特征在于，所述提取液由甲醇、水和羧酸组成，所述甲醇的体积含量为50％-100％，羧酸浓度为0.05-1mol/l，溶剂为水，所述羧酸选自甲酸、乙酸和草酸中的一种或其组合。5.如权利要求1所述的同时检测干血片中多种新生儿筛查代谢物的方法，其特征在于，所述样品为体液样品或血液样品。6.如权利要求5所述的同时检测干血片中多种新生儿筛查代谢物的方法，其特征在于，所述样品为干燥的血液样品。7.如权利要求1所述的同时检测干血片中多种新生儿筛查代谢物的方法，其特征在于，所述步骤s3通过将提取的代谢物和内标溶液制成的标准品通过液相系统输送至质谱仪的离子源进行离子化，所述步骤s4使用三重四极杆质谱仪或高分辨率质谱仪获取一种或多种离子的质荷比，所述步骤s5通过选择至少一种精确的质荷比离子确定乳清酸的信号强度。8.如权利要求7所述的同时检测干血片中多种新生儿筛查代谢物的方法，其特征在于，所述液相系统所用的流动相溶液由乙腈、水和饱和一元羧酸组成，所述乙腈的体积含量为50％-100％，所述饱和一元羧酸浓度为0.05-1mol/l，溶剂为水，所述饱和一元羧酸为甲酸、
乙酸、丙酸或丁酸。9.如权利要求1所述的同时检测干血片中多种新生儿筛查代谢物的方法，其特征在于，所述内标溶液为对应于以下一种或多种稳定同位素标记的内标准品：丙氨酸、精氨酸、瓜氨酸、甘氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、游离肉碱、乙酰肉碱、丙酰肉碱、丙二酰肉碱、异戊酰肉碱、戊二酰肉碱、己酰肉碱、辛酰肉碱、癸酰肉碱、癸烯酰肉碱、十二碳酰肉碱、十四碳酰肉碱、十六碳酰肉碱、十八碳酰肉碱、c26-脂酰肉碱、c26-lpc、乳清酸和琥珀酰丙酮衍生物3-(5甲基-1h-吡唑-3yl)丙酸。10.如权利要求1所述的同时检测干血片中多种新生儿筛查代谢物的方法，其特征在于，所述内标溶液为对应于以下一种或多种稳定同位素标记的内标准品：2h
4-丙氨酸，2h4,
13
c-精氨酸、2h
2-瓜氨酸、
14
n,2-13
c-甘氨酸、2h
3-亮氨酸、2h
3-蛋氨酸、2h
6-鸟氨酸、
13
c
6-苯丙氨酸、
13
c
5-脯氨酸、
13
c
6-酪氨酸、2h
4-缬氨酸、2h
9-游离肉碱、2h
3-乙酰肉碱、2h
3-丙酰肉碱、2h
6-戊二酰肉碱、2h
3-丁酰肉碱、2h
9-异戊酰肉碱、2h
3-己酰肉碱、2h
3-辛酰肉碱、2h
3-癸酰肉碱、2h
3-十二碳酰肉碱、2h
3-十四碳酰肉碱、2h
3-十六碳酰肉碱、2h
3-十八碳酰肉碱、2h
3-二十六碳酰肉碱、2h
4-c26:0-lpc、
15
n
2-乳清酸和
13
c
5-mpp3。

技术总结
本发明公开了一种同时检测干血片中多种新生儿筛查代谢物的方法，获取包括乳清酸的代谢物作为样品，包括如下步骤：S1、使用提取液从样品中提取代谢物；S2、提供包含稳定同位素标记的内标溶液，所述内标溶液对应于样品中待检测的代谢物；S3、使代谢物和内标溶液离子化以产生离子；S4、多反应监测模式下在质谱图中获得一种或多种离子的质荷比；S5、在多反应监测模式下确定乳清酸的信号强度；S6、使用对应于以上代谢物的稳定同位素标记的内标溶液，检测和定量乳清酸的量。本发明操作简单，使用相同的前处理条件和仪器条件就能实现氨基酸、肉碱、溶血卵磷脂酰胆碱类、酮类、乳清酸的同时检测，缩减了检测工作步骤和时间，提高了检测效率。率。率。


技术研发人员：樊静静 陈武炼 强维 王培娟
受保护的技术使用者：上海义准生物有限公司
技术研发日：2021.04.14
技术公布日：2022/3/8