一种检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药突变的引物探针及方法与流程

一种检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药突变的引物探针及方法
1.技术领域：本发明属于核酸检测技术领域，特别涉及一种检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药突变的引物探针及方法。
2.

背景技术：
2016年结核病仍是全球第十大死因，尤其在低收入和中低收入国家，该死因排名更靠前，结核病目前仍是全球对人类最具威胁的传染病之一。据who肺结核报告统计估算，全球结核潜伏感染人群约17亿，占全人群的1/4左右。2018年全球约1000万人患有肺结核，各国结核病负担差异较大，发病率分布在低于5/10万到部分国家高于500/10万之间，平均约130/10万人。从地理位置看，主要分布在东南亚（44%）、非洲（24%）、西太平洋地区（18%）、东地中海（8%）、美洲（3%）和欧洲（3%）；从国家分布看，30个结核病高负担国家的新发患者依然占到了全球新发患者数的87%，其中印度（27%）、中国（9%）、印度尼西亚（8%）、菲律宾（6%）、巴基斯坦（6%）、尼日利亚（4%）、孟加拉国（4%）和南非（3%）等8个国家的新发患者约占全球的2/3。中国的估算结核病新发患者数为86.6万（2017年88.9万），估算结核病发病率为61/10万（2017年63/10万），在30个结核病高负担国家中估算结核病发病率排第28位，高于俄罗斯（54/10万）和巴西（45/10万）。
3.结核耐药仍然是很严重的公共问题，2018年全球约有48.4万新增结核病例出现利福平耐药（其中78%为耐多药），约3.4%的新增病例和18%的既往治疗病例出现耐多药或耐利福平（mdr/rr-tb），根据已发现的病原学阳性肺结核患者数计算的中国利福平耐药肺结核患者数约为2.5万。鉴定结核耐药的方法主要是结核菌耐药性试验、分子快速测试和测序法。传统的结核菌耐药试验检测方法主要依据细菌生长，操作复杂，培养周期至少4周以上；测序法可以检测到各种未知突变及突变性质，但一代测序的灵敏度不够，二代测序则费用太高。因此有必要建立一种快速鉴定结核耐药基因的方法，能够指导结核病人科学合理有效用药。目前鉴定结核分枝杆菌耐药基因的分子生物学方法主要是利用不对称pcr扩增的熔解曲线法和反向斑点杂交法（rbd），其中反向斑点杂交法（rbd）是将pcr技术和反向点杂交技术相结合的一种可以检测耐药突变的生物学方法，由于需要在正常pcr扩增后进行杂交、洗膜和显色等步骤，因此操作复杂，总检测时间也较长。不对称pcr熔解曲线分析法操作简单，检测灵敏度高，应用更广泛。
4.公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
5.

技术实现要素：
本发明的目的在于采用一种热稳定的dna聚合酶（可具有5’核酸酶活性）和不对称pcr法检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药基因多个突变位点检测，从而克服上述现有技术中的缺陷。
6.为实现上述目的，本发明提供了一种检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药突变的引物探针，包括：依据结核分枝杆菌81bp耐药核心区域，设计seq id no.1～no.2的引物、
no.6，探针seq id no.3，seq id no.5和seq id no.8的浓度为100~500nmol；所述引物混合液b含有上述的4条特异性引物具体为：seq id no.1~2，seq id no.9~10和2条探针具体为：seq id no.4和seq id no.11，其中，引物seq id no.1和seq id no.9的浓度为10~50 nmol、引物seq id no.2和seq id no.10及探针seq id no.4和seq id no.11的浓度为100~500nmol所述反应液含有0.1~1mm dntps、2
×
pcr反应缓冲液、2~4mm mgcl2；所述dna聚合酶可为普通 taq dna聚合酶，浓度为1~5u/
µ
l。
12.优选地，上述技术方案中，pcr扩增及熔解曲线分析程序如下:步骤一：37℃ 5min, 1个循环;步骤二：95℃ 10min, 1 个循环;步骤三：95℃ 10s, 60℃ 10~15s, 72℃ 20~30s, 15 个循环;步骤四：95℃ 10s, 55℃ 10~15s, 72℃ 20~30s, 35 个循环, 72℃收集fam、vic/hex/joe、rox、cy3、cy5等通道荧光信号;步骤五：95℃ 20s, 40℃~80℃，每1℃收集fam、vic/hex/joe、rox、cy3、cy5等通道荧光信号。
13.优选地，上述技术方案中，tm值的变化判断具体为：对上述反应体系进行荧光定量pcr不对称扩增和熔解曲线分析，当检测样品的tm值低于对照管2℃以上时，可判读为结核分枝杆菌耐药突变；当检测样品出现双峰，一个峰tm值与对照tm值一致（差异小于1），一个峰tm值低于对照tm值2℃以上时，可判读为结核分枝杆菌杂合耐药突变。
14.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明的突变设在探针上，为了增加探针的分辨率，对探针上的碱基序列引入部分碱基突变，以更容易区分耐药突变。
15.以上所述方法，应保证体系中探针过量，经pcr扩增剪切后剩余的探针可与生成的产物单链dna进行熔解曲线分析。
16.附图说明：图1是a反应管检测结核分枝杆菌rpob基因野生型和516位点耐药突变熔解曲线分析。
17.图2是a反应管检测结核分枝杆菌rpob基因野生型和531位点耐药突变熔解曲线分析。
18.图3是a反应管检测结核分枝杆菌katg基因野生型和315位点耐药突变熔解曲线分析。
19.图4是b反应管检测结核分枝杆菌rpob基因野生型和526位点耐药突变熔解曲线分析.图5是b反应管检测结核分枝杆菌maba(fabg1)-inha启动子基因野生型和-15位点耐药突变熔解曲线分析。
20.图6是a反应管检测结核分枝杆菌rpob基因516位点50%耐药突变熔解曲线分析。
21.图7是a反应液管检测结核分枝杆菌异烟肼耐药基因检测试剂用国家参考品n1-n10的熔解曲线分析图谱。
22.图8是b反应液管检测结核分枝杆菌异烟肼耐药基因检测试剂用国家参考品n1-n10的熔解曲线分析图谱。
23.图9-图11是检测结核分枝杆菌异烟肼耐药基因检测试剂用国家参考品不同浓度，不同耐药比例下的katg s315t1位点熔解曲线分析图谱。
24.具体实施方式：下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护 范围并不受具体实施方式的限制。
25.除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包 括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或 组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
26.实施例1不对称pcr扩增反应体系的准备：（1）核酸扩增反应液：100mm dntps、10
×
pcr反应缓冲液、1m mgcl2，dntps和mgcl2终浓度为300um和 3mm；
27.（2）引物探针反应液a：引物探针反应液a含有所述seq id no.1包括25nmol rpob引物1、25nmol katg引物1、200nmol rpob引物2、200nmol katg引物2、200nmol rpob探针1、200nmol rpob探针3、200nmol katg探针；。
28.（3）引物探针反应液b：包括0.2pmol rpob引物1、0.2pmol inha引物1、10pmol rpob引物2、10pmol inha引物2、10pmol rpob探针2、10pmol inha探针；。
29.（4）dna聚合酶：taq dna聚合酶，浓度为5u/
µ
l，每个反应体系使用0.9
µ
l；（5）ung酶：浓度为5u/
µ
l，每个反应体系使用0.1
µ
l；（6）荧光定量pcr仪：abi 7500、roche lightcycler 480、bio-rad cfx96等。
30.用上述反应体系按以下方法对结核分枝杆菌耐药进行检测。本实施例的待检样品为已鉴定为结核分枝杆菌患者的痰液，当然，也可以为已鉴定为结核分枝杆菌患者的结核分枝杆菌分离培养物。
31.1、痰液样本的采集：按照《肺结核诊断ws288
‑‑
2017》痰标本的采集进行。可采集患者即时痰、清晨痰及夜间痰。合格的痰标本应是脓样、干酪样或脓性黏液样性质的痰液，痰量以3~5ml为宜。留取痰标本的容器应采用国际通用螺旋盖痰瓶，或选用直径40mm、高20mm有螺旋盖可密封的塑料盒。留取痰标本后应及时检测，2~8℃保存3天内完成检测，-20℃保存期4个月，-70℃可以保存12个月。样本避免反复冻融，冻融次数不能超过5次，采用冰袋低温运输不能超过3天。
32.2、模板dna提取：1）将3ml的痰标本置于室温；2）在痰样标本中加入等体积的痰消化液（含1g/l蛋白酶k的磷酸盐缓冲液）震荡混匀，进行消化处理；3）消化5分钟后采用qiagen公司的qiaamp
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viral rna mini kit试剂盒进行核酸提取；4）提取好的核酸作为模板dna。
33.3、不对称扩增反应及溶解曲线分析：反应体系a/b的配制的如下表所示：。
34.所述酶混合液包括dna聚合酶、ung酶。
35.扩增程序及熔解曲线分析如下：步骤一：37℃、5min, 1个循环；步骤二：95℃、10min, 1个循环；步骤三：95℃、10s, 60℃、10~15s, 72℃、20~30s, 15个循环；步骤四：95℃、10s, 55℃、10~15s, 72℃、20~30s, 35个循环,72℃收集fam、vic/hex/joe、rox、cy3、cy5等通道荧光信号；步骤五：95℃、20s, 40℃~80℃、每1℃收集fam、vic/hex/joe、rox、cy3、cy5等通道荧光信号。
36.4、结果判定：
37.熔解曲线tm值分析，若样品检测tm值与野生型对照tm值差异大于2℃，则存在结核分枝杆菌耐药突变。当检测样品出现双峰，一个峰tm值与野生型对照tm值一致，一个峰tm值低于对照tm值2℃以上时，可判读为结核分枝杆菌杂合耐药突变。
38.实施例2反应体系性能测试-结核分枝杆菌异烟肼耐药基因检测试剂用国家参考品检测1、国家阴性参考品检测10份阴性参考品均为异烟肼敏感的结核分枝杆菌，浓度为1
×
10
5 cfu/ml。采用上述pcr反应体系，每份参考品取200ul进行提取检测，检测结果均为异烟肼敏感型，符合国家参考品检测要求。
39.2、国家阴性参考品检测检测16份国家阳性参考品，上述体系下覆盖的突变位点均能够准确检出，检测结果均符合相应要求。
40.3、最低检出限参考品检测根据下表采用敏感菌和耐药菌的混合菌液参考品配制不同浓度，不同耐药比例的检出限参考品，分别进行扩增检测和熔解曲线分析。
41.。
42.在1
×
10
4 cfu/ml菌液浓度下，可以检测到5%异烟肼katg s315t1位点突变；在1
×
10
3 cfu/ml菌液浓度下，可以检测到25%异烟肼katg s315t1位点突变；在1
×
10
2 cfu/ml菌液浓度下，可以检测到50%异烟肼katg s315t1位点突变。以上所述的结合分枝杆菌利福平和异烟肼耐药突变的引物探针及方法具有很高的灵敏度。
43.前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

技术特征：
1.一种检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药突变的引物探针，其特征在于：包括：依据结核分枝杆菌81bp耐药核心区域，设计seq id no.1～no.2的引物、seq id no.3～no.5的探针，共覆盖检测利福平耐药rpob基因511、513、516、522、526、531和533位点；依据异烟肼耐药katg基因区域设计seq id no.6～no.7的引物、seq id no.8的探针，覆盖检测katg基因315位点；依据maba(fabg1)-inha启动子基因区域设计seq id no.9～no.10的引物、seq id no.11的探针，覆盖检测maba(fabg1)-inha启动子基因-17、-15和-8位点。2.根据权利要求1所述的检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药突变的引物探针，其特征在于：探针5’端可分别采用fam、vic/hex/joe、rox、cy3、cy5等进行荧光素标记，3’端可采用bhq1、bhq2、bhq3、dabcyl、tamra等猝灭荧光基团。3.一种检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药突变的试剂盒，包括引物探针反应液，其特征在于：所述引物探针反应液包括a反应管和b反应管，其中a反应管包括针对rpob基因的1对引物和2条探针，针对katg基因的1对引物和1条探针；b反应管包括针对rpob基因的1对引物和1条探针，针对maba(fabg1)-inha启动子基因区域的1对引物和1条探针。4.根据权利要求3所述的检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药突变的试剂盒，其特征在于：a反应管中：rpob基因1的1对引物和2条探针具体为seq id no.1～no.2的引物、seq id no.3～no.4的探针；katg基因的1对引物和1条探针具体为seq id no.6～no.7的引物、seq id no.8的探针。5.根据权利要求3所述的检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药突变的试剂盒，其特征在于：b反应管中：rpob基因1的1对引物和1条探针具体为seq id no.1～no.2的引物、seq id no.5的探针；maba(fabg1)-inha启动子基因区域的1对引物和1条探针具体为seq id no.9～no.10的引物、seq id no.11的探针。6.一种快速鉴定结核分枝杆菌耐药基因的方法，其特征在于：具体包括如下步骤：模板dna的提取：提取待检样品的dna，所述待检样品是已鉴定为含有结核分枝杆菌的痰液样品或分离培养物；不对称pcr反应：在200
µ
l pcr管配制两组20
µ
l反应体系：引物混合液a 8
µ
l，核酸扩增反应液 9
µ
l，dna聚合酶0.9
µ
l，ung酶0.1
µ
l，模板dna 2
µ
l；引物混合液b 8
µ
l，核酸扩增反应液 9
µ
l，dna聚合酶0.9
µ
l，ung酶0.1
µ
l，模板dna 2
µ
l；将上述反应管于荧光定量pcr仪进行扩增；采用dna聚合酶和不对称pcr扩增后进行熔解曲线分析，通过tm值的变化判断是否存在结核耐药突变。7.根据权利要求6所述的快速鉴定结核分枝杆菌耐药基因的方法，其特征在于：所述引物混合液a含有上述的4条特异性引物具体为：seq id no.1~2，seq id no.6~7和3条探针具体为：seq id no.3，seq id no.5和seq id no.8，其中，引物seq id no.1和seq id no.6的浓度为10~50 nmol、引物seq id no.1和seq id no.6，探针seq id no.3，seq id no.5和seq id no.8的浓度为100~500nmol；所述引物混合液b含有上述的4条特异性引物具体为：seq id no.1~2，seq id no.9~10和2条探针具体为：seq id no.4和seq id no.11，其中，引物seq id no.1和seq id no.9的浓度为10~50 nmol、引物seq id no.2和seq id no.10及
探针seq id no.4和seq id no.11的浓度为100~500nmol所述反应液含有0.1~1mm dntps、2
×
pcr反应缓冲液、2~4mm mgcl2；所述dna聚合酶可为普通 taq dna聚合酶，浓度为1~5u/
µ
l。8.根据权利要求6所述的快速鉴定结核分枝杆菌耐药基因的方法，其特征在于：pcr扩增及熔解曲线分析程序如下:步骤一：37℃ 5min, 1个循环;步骤二：95℃ 10min, 1 个循环;步骤三：95℃ 10s, 60℃ 10~15s, 72℃ 20~30s, 15 个循环;步骤四：95℃ 10s, 55℃ 10~15s, 72℃ 20~30s, 35 个循环, 72℃收集fam、vic/hex/joe、rox、cy3、cy5等通道荧光信号;步骤五：95℃ 20s, 40℃~80℃，每1℃收集fam、vic/hex/joe、rox、cy3、cy5等通道荧光信号。9.根据权利要求6所述的快速鉴定结核分枝杆菌耐药基因的方法，其特征在于：tm值的变化判断具体为：对上述反应体系进行荧光定量pcr不对称扩增和熔解曲线分析，当检测样品的tm值低于对照管2℃以上时，可判读为结核分枝杆菌耐药突变；当检测样品出现双峰，一个峰tm值与对照tm值一致（差异小于1），一个峰tm值低于对照tm值2℃以上时，可判读为结核分枝杆菌杂合耐药突变。

技术总结
本发明公开了一种检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药突变的引物探针，主要是利用热稳定的DNA聚合酶（可具有5’核酸酶活性）和不对称PCR法检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药基因多个突变位点检测，本发明的突变设在探针上，为了增加探针的分辨率，对探针上的碱基序列引入部分碱基突变，以更容易区分耐药突变。以更容易区分耐药突变。以更容易区分耐药突变。


技术研发人员：郭玉婉 张蓉 赵西浩 张少铎 刘雪芹 贺华 陈永红 彭莉 苏波 李秀林 刘中华 王国强
受保护的技术使用者：江苏硕世生物科技股份有限公司
技术研发日：2021.06.30
技术公布日：2022/3/8