一种外泌体表面功能化处理PEEK材料的制作方法

一种外泌体表面功能化处理peek材料
技术领域
1.本发明属于生物材料的技术领域，特别涉及一种骨科疾病及美容整形用骨科材料。


背景技术：

2.当人体的骨骼受到损伤时，需要对骨骼进行修复。目前常用的材料有:1. 天然骨材料：自体骨、同种异体骨、异种骨。
3.2. 生物陶瓷材料：生物惰性陶瓷、生物活性陶瓷、生物可降解陶瓷、生物陶瓷复合物。
4.3. 高分子材料：胶原、纤维蛋白、几丁质等。
5.4. 复合类材料。
6.传统骨替代材料具有诱导成骨细胞体外成骨的能力，可促进骨再生。然而，在体外实验和体内实验中发现了一些不一致的地方，如有利于体外成骨的材料不能促进体内的骨再生。传统骨替代材料还会引起体内免疫反应，抑制成骨从而导致植入材料松动。
7.如专利申请201610793039.2公开了骨修补材料及其固定部件在制备修复幼小动物骨缺损的产品中的应用。骨修补材料通过固定部件固定于幼小动物骨骼上，固定部件在幼小动物骨骼内滑动(从而对幼小动物骨骼发育不产生束缚或其他影响)。
8.又如专利申请202011539232.6公开了一种基于改性钙钛矿量子点的骨缺损修复材料及其制备方法，包括以下质量百分比原料：羟基磷灰石20～30％、磷酸八钙10～20％、骨形态发生蛋白0.5～2％、胶原蛋白1～5％、硫酸软骨素0.5～2％、羧甲基壳聚糖3～5％、改性钙钛矿量子点溶液补足余量；改性钙钛矿量子点/氨基碳量子点溶液的反应原料及质量份如下：钙钛矿量子点0.5～1.5份、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺8～16份、酸性氨基酸3～7份、还原型谷胱甘肽1～3份、edc
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hcl 0.5～1份、氯仿20～30份、去离子水100份。本发明首次在骨缺损修复材料中引入钙钛矿量子点、氨基碳量子点，利用量子点介导干细胞的转染，利用荧光显微成像技术监测干细胞行为变化；同时，诱导干细胞向成骨细胞和成软骨细胞方向分化，刺激骨细胞增殖再生。
9.然而，传统骨替代材料难以促进体内成骨，并且会引起体内免疫反应抑制成骨。一种合适的骨生物材料不仅应该能够介导骨形成，还必须能够操纵免疫反应，发挥协同作用，以实现令人满意的骨结合，因此亟需研发一种能够控制免疫反应的有效的介质骨，以实现与人体的有效结合。
10.

技术实现要素：

11.鉴于以上现有技术的缺点，本发明提供一种外泌体表面功能化处理peek材料，该材料能够介导骨形成，操纵免疫反应，实现与人体的有效结合。
12.本发明的另一个目的在于提供一种外泌体表面功能化处理peek材料，该材料可通
过nf-κ b途径调节巨噬细胞m2极化，以达到调控免疫反应效果促进成骨，并提供了更有利的骨免疫微环境，有利于骨髓间充质细胞进一步成骨分化。
13.基于此，本发明是这样实现的：一种外泌体表面功能化处理peek材料，其特征在于所述材料是通过下述方法制得：步骤一，培养髓间充骨质干细胞，所述髓间充骨质干细胞取自雌性sd大鼠双侧肱骨和股骨；其中，髓间充骨质干细胞在dulbecco的改良的鹰培养基dulbecco (dmem, gibco)含有10%胎牛血清(fbs, gibco)的培养基中培养，在37℃与5% co2。
14.raw264.7细胞购自atcc细胞库，在1640培养基(gibco)中37℃和5% co2培养。其中，髓间充质干细胞与材料共培养用于证明该材料有成骨效应，raw264.7细胞同于与材料共培养用于证明该材料有调控免疫反应从而促进成骨作用。
15.在4℃下以120000 g超离心14 h制备体外无胎牛血清(optima-90 k, beckman coulter)，以无胎牛血清进一步培养髓间充骨质干细胞，培养48 h后收集髓间充骨质干细胞培养基。
16.步骤二，离心分离；将髓间充骨质干细胞离心分离制备外泌体；然后进行多步离心，2000 g离心20 min, 10000 g离心30 min，最后100000 g离心90 min分离外泌体。外泌体的作用是促进骨髓间充质细胞直接成骨分化。
17.步骤三，磺化，将peek（polyether ether ketone聚醚醚酮）浸入95-98 wt%的硫酸溶液(aldrich chemical corp)中，使peek形成均匀的多孔结构；步骤四，制备speek，对磺化的peek进行水热处理(条件：120℃, 6 h)以去除残留的硫酸，得到speek；speek随后按照最终浓度(fecl
3 6h2o: 0.1 mg/ml, ta: 0.4 mg/ml)浸泡在40ml的含fecl
3 6h2o: 0.1 mg/ml, ta: 0.4 mg/ml溶液中。
18.步骤五，制备ta-speek（tannicacid-sulfonated polyether ether ketone 单宁酸磺化聚醚醚酮），在步骤四得到的溶液中滴入naoh溶液，将溶液ph调整到8，在磁性搅拌条件下speek与4mgta溶于0.6ml去离子水中得到的ta溶液反应，得到ta-speek。
19.之后，用pbs反复冲洗获得的样品，以去除未聚合的单体。
20.步骤六，合成exo-ta-speek（exosomes-tannicacid-sulfonated polyether ether ketone 负载外泌体的单宁酸磺化聚醚醚酮），将127.39 μg/cm2 髓间充骨质干细胞来源的外泌体滴到ta-speek上，在4℃下共培养24 h以上，即可合成exo-ta-speek。
21.本发明以peek为载体，髓间充骨质干细胞附着在其上，形成exo-ta-speek，外泌体涂层ta-speek可以促进骨髓间充质细胞直接成骨分化，由此，exo的ta-speek可通过nf-κ b途径调节巨噬细胞m2极化，以达到调控免疫反应效果促进成骨；因此，exoo
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speek提供了更有利的骨免疫微环境，有利于骨髓间充质细胞进一步成骨分化。
22.附图说明
23.图1是本发明所实现的peek材料制备示意图。
24.具体实施方式
25.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
26.图1所示，本发明所实现的外泌体表面功能化处理peek材料，是通过下述方法制得：步骤一，培养髓间充骨质干细胞，所述髓间充骨质干细胞取自雌性sd大鼠双侧肱骨和股骨；其中，髓间充骨质干细胞在dulbecco的改良的鹰培养基dulbecco (dmem, gibco)含有10%胎牛血清(fbs, gibco)的培养基中培养，条件是37℃与5% co2。
27.同时进行raw264.7培养，raw264.7细胞购自atcc细胞库，在1640培养基(gibco)中37℃和5% co2培养。
28.其中，髓间充质干细胞与材料共培养用于证明该材料有成骨效应，raw264.7细胞同于与材料共培养用于证明该材料有调控免疫反应从而促进成骨作用。
29.在4℃下以120000 g超离心14 h制备体外无胎牛血清(optima-90 k, beckman coulter)，以无胎牛血清进一步培养髓间充骨质干细胞。培养48 h后收集髓间充骨质干细胞培养基。
30.步骤二，离心分离；将髓间充骨质干细胞离心分离制备外泌体；然后进行多步离心，2000 g离心20 min, 10000 g离心30 min，最后100000 g离心90 min分离外泌体。
31.步骤三，磺化，将peek（polyether ether ketone聚醚醚酮）浸入95-98 wt%的硫酸溶液(aldrich chemical corp)中，搅拌2分钟，形成均匀的多孔结构。
32.步骤四，制备speek，然后对磺化的peek (speek)进行水热处理(120
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c, 6 h)以去除残留的硫酸，得到speek。
33.speek随后按照最终浓度(fecl
3 6h2o: 0.1 mg/ml, ta: 0.4 mg/ml)浸泡在40 ml溶液中。
34.步骤五，制备ta-speek ta-speek（tannicacid-sulfonated polyether ether ketone 单宁酸磺化聚醚醚酮），然后滴入1n naoh溶液，将溶液ph提高到8，在磁性搅拌条件下speek与4mgta溶于0.6ml去离子水中得到的ta溶液反应10 s，得到ta-speek。之后，用pbs反复冲洗获得的样品，以去除未聚合的单体。
35.步骤六，合成exo-ta-speek（exosomes-tannicacid-sulfonated polyether ether ketone 负载外泌体的单宁酸磺化聚醚醚酮），最终将127.39 μg/cm2 髓间充骨质干细胞来源的外泌体滴到ta-speek上，在4℃下共培养24 h，即可合成exo-ta-speek样品。
36.总之，本发明的负载exo的ta-speek可通过nf-κ b途径调节巨噬细胞m2极化。此外，exoo
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speek提供了更有利的骨免疫微环境，有利于骨髓间充质细胞进一步成骨
分化。外泌体涂层ta-speek可以促进骨髓间充质细胞直接成骨分化。此外，exo-ta-speek植入具有免疫调节和直接成骨特性，最终可促进体内骨整合和新骨形成。
37.本发明可广泛应用于骨骼修复、美容医疗等多个方面。
38.以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种外泌体表面功能化处理peek材料，其特征在于所述材料是通过下述方法制得：步骤一，培养髓间充骨质干细胞，所述髓间充骨质干细胞取自雌性sd大鼠双侧肱骨和股骨；步骤二，离心分离；将髓间充骨质干细胞离心分离制备外泌体；步骤三，磺化，将聚醚醚酮peek浸入的硫酸溶液中，使聚醚醚酮peek形成均匀的多孔结构；步骤四，制备speek，对磺化的聚醚醚酮进行水热处理以去除残留的硫酸，得到speek；步骤五，制备ta-speek；在磁性搅拌条件下speek与ta溶液反应，得到ta-speek；步骤六，合成exo-ta-speek，将127.39 μg/cm2 髓间充骨质干细胞来源的外泌体滴到ta-speek上，在4℃下共培养，即可合成exo-ta-speek。2.如权利要求1所述的外泌体表面功能化处理peek材料，其特征在于步骤一中，其中，髓间充骨质干细胞在dulbecco的改良的鹰培养基dulbecco含有10%胎牛血清的培养基中培养，在37℃与5% co2；raw264.7细胞购自atcc细胞库，在1640培养基中37℃和5% co2培养；在4℃下以120000 g超离心14 h制备体外无胎牛血清，以无胎牛血清进一步培养髓间充骨质干细胞，培养48 h后收集髓间充骨质干细胞培养基。3.如权利要求2所述的外泌体表面功能化处理peek材料，其特征在于步骤二中，进行多步离心，其中，2000 g离心20 min, 10000 g离心30 min，最后100000 g离心90 min分离外泌体。4.如权利要求1所述的外泌体表面功能化处理peek材料，其特征在于步骤三中，将peek浸入95-98 wt%的硫酸溶液中。5.如权利要求1所述的外泌体表面功能化处理peek材料，其特征在于步骤四中，水热处理的条件：120℃, 6 h；speek随后浸泡在40ml的含fecl3 6h2o: 0.1 mg/ml, ta: 0.4 mg/ml溶液中。6.如权利要求1所述的外泌体表面功能化处理peek材料，其特征在于步骤四中，髓间充骨质干细胞来源的外泌体滴到ta-speek上后，在4℃下共培养24h。7.如权利要求1所述的外泌体表面功能化处理peek材料，其特征在于步骤五中，在步骤四得到的溶液中滴入naoh溶液，将溶液ph调整到8。8.如权利要求7所述的外泌体表面功能化处理peek材料，其特征在于所述ta溶液为4mgta溶于0.6ml去离子水中得到的ta溶液。

技术总结
本发明公开了一种外泌体表面功能化处理PEEK材料，所述材料是通过下述方法制得：步骤一，培养髓间充骨质干细胞，所述髓间充骨质干细胞取自雌性SD大鼠双侧肱骨和股骨；步骤二，离心分离；将髓间充骨质干细胞离心分离制备外泌体；步骤三，磺化，将PEEK浸入的硫酸溶液中，使PEEK形成均匀的多孔结构；步骤四，制备SPEEK，对磺化的PEEK进行水热处理以去除残留的硫酸，得到SPEEK；步骤五，制备TA-SPEEK；在磁性搅拌条件下SPEEK与样品反应，得到TA-SPEEK；步骤六，合成Exo-TA-SPEEK，将髓间充骨质干细胞来源的外泌体滴到TA-SPEEK上，即可合成Exo-TA-SPEEK。本发明够介导骨形成，操纵免疫反应，实现与人体的有效结合。实现与人体的有效结合。实现与人体的有效结合。


技术研发人员：王健 范磊 史占军
受保护的技术使用者：王健
技术研发日：2021.11.26
技术公布日：2022/3/8