一种近红外荧光分子探针及其制备方法与应用

1.本发明属于有机合成与分析检测技术领域，具体涉及阿尔茨海默症(ad)判断和分析技术领域，即一种近红外荧光分子探针及其制备方法与应用。


背景技术：

2.阿尔茨海默症(ad)是一种进行性神经退行性脑疾病，被认为是一种不治之症，大脑中淀粉样β(aβ)斑块的形成和积聚被认为是ad早期诊断的一个重要病理学标志。商业硫黄素衍生物(tht或ths)是众所周知的体外组织学染色淀粉样纤维的金标准探针。其存在固有缺陷，包括荧光富集猝灭效应产生的畸变信号、常亮模式产生的不可避免噪音以及血脑屏障(bbb)渗透性有限，严重阻碍了其转化为体内成像。事实上，对于aβ斑块的原位定位，目前还远未获得准确的生物学及光学定位信息。
3.aβ的产生需要β-分泌酶和γ-分泌酶参与剪切，β-分泌酶，通常被称为淀粉蛋白前体蛋白β-分解酶1(β-site app cleaving enzyme 1，bace1)，是一种天冬氨酸水解酶。β-分泌酶切割app产生可溶性细胞外片段(sappβ)和细胞膜结合片段(c99)，被γ-分泌酶切割释放aβ单体。因此，抑制β-分泌酶的活性在限制体内aβ产生速率方面起着重要作用。事实上，β-分泌酶是一种新的跨膜天冬氨酸蛋白酶，称为β-位点app裂解酶1(bace1)，因此bace1在ad的发生发展中起着重要作用，是ad治疗的重要靶点。
4.以正常小鼠为对象的研究，证实了低剂量的bace1抑制剂可以在不影响记忆的情况下阻断aβ的生成，高剂量bace1抑制剂则会导致突触损伤和记忆丢失。另外，bace1敲除小鼠也显示出空间参考记忆异常以及颞叶相关记忆的损伤。因此，bace1对学习记忆是有双重效果的。
5.目前，基于医学影像的技术一直应用于ad的诊断和分期，由于发病机理复杂，表征与其他病症易混淆，临床很难确诊，确诊难度大而且误诊率较高。ad可能在出现特定症状之前几年发生，因此早期诊断十分关键。目前临床诊断主要依靠以主观量表检查患者认知水平，如用简明精神状态量表(mmse)等进行诊断，但其特异性和敏感度很低。此外，结构影像学，ct、mri常规检查，pet、spect、mrs等分子影像学手段也作为诊断评价ad的方法，但测试成本较高，而且确诊率不高，存在误诊、漏诊的情况，而当临床上被确诊时，患者早已错过了最佳治疗时期。病情一旦发展到严重程度就很难挽回，但是若在早期确诊还是可以用响应的药物和治疗手段控制病情的发展，延长患者寿命，提高患者生存质量。因此，探索和发展高灵敏度、高特异性的技术和分析方法实现ad早诊疗具有重要研究意义和临床价值。利用分子影像技术的实时无创高精度等优势，可对这类疾病相关的复杂进程进行监测和分类。
6.尽管已经开发了一些用于检测bace1的荧光探针，例如franz等人开发了一种基于荧光共振能量转移(fret)机制的荧光探针，该探针可用于使用活hela细胞实时监测bace活性。通过bace底物与dabcyl猝灭剂连接的dmaca具有较宽的吸收峰(420-520nm)，但没有荧光。然后在bace存在下，去除dabcyl猝灭剂可使dmaca荧光恢复。peg基团为bace在细胞中水解探针提供合适的间距和方向，促进探针在活细胞中的使用。tian团队已经开发了一种新
型双光子荧光探针，用于基于fret的活体细胞bace1成像。探针包含一个供体(mcyd)和受体(af633)，通过一个肽底物(链长小于10nm)连接，可被bace1特异性切割。在bace1存在下，探针的荧光信号从af633发射变为mcyd发射，这是由于bace1分离fret供体-受体对水解肽底物所致。该系统是第一个用于bace1测定的双光子比值荧光探针，目前基于荧光分子探针的bace1特异性检测方法还不多见。
7.分子成像依赖于特异性探针来实现体外和体内生物分子的定性和定量检测。其通过收集有关分子途径在细胞和生物过程的病变组织下的信息而广泛应用于准确的疾病检测，定位和分期。因此，它可以临床应用于药物的发现和发展，并以实时评估方式评估药物治疗的疗效，并大大改善图像引导手术。而荧光探针则是利用荧光强度或荧光寿命等的变化来实现对脑胶质瘤进行精准靶向和成像，灵敏度高，选择性好，响应速度快。目前，荧光探针在生物医学领域已经得到了广泛的应用，但是也具有一些不足，是反应前后荧光信号变化通常较小(增强1～2倍)。发射波长短，生物穿透性弱，对于影像分析带来不利。因此，构建新型的具有靶向检测ad的近红外高水溶性荧光材料，发展合成工艺简单、能够准确诊断ad的荧光探针具有实际应用前景。


技术实现要素：

8.本发明提供了一种近红外荧光分子探针及其制备方法与应用，本发明的荧光探针对诊断ad具有高靶向性、高灵敏度、强抗干扰能力、宽检测范围、可反复使用的优点。
9.本发明这种近红外荧光分子探针，其结构如式i所示：
[0010][0011]
其中：r1为氢、甲基、氟、氯、溴、碘中的一种；r2为氢、卤素、烷基、烷氧基、胺基、二甲氨基中的一种。
[0012]
优选的，所述近红外荧光分子探针，其结构是如式ⅱ所示：
[0013][0014]
本发明这种近红外荧光分子探针的制备方法，包括以下步骤：
[0015]
(1)将化合物1置于圆底烧瓶中，接着加入溶剂进行溶解；然后依次加入化合物2、30％双氧水和浓盐酸(36％～38％)，并在室温下进行反应，反应完毕后，将反应液倒入冰水中，使用氢氧化钠溶液调节ph至中性；此时大量黄色絮状物产生，抽滤，得粗产物；将粗产物
通过硅胶柱层析进行分离纯化，得到化合物3；其合成路线如下：
[0016][0017]
(2)向圆底烧瓶中加入步骤(1)制备的化合物3，并加入化合物六次甲基四胺(hmt)和溶剂，氮气保护，然后再移至设定温度下进行回流反应；待反应完毕后将反应液吸出旋干，柱层析分离，得到化合物4；其合成路线如下：
[0018][0019]
(3)向圆底烧瓶中加入步骤(2)制备的化合物4，并加入化合物5和溶剂，并滴加饱和的naoh溶液，接着在氮气保护和无水条件下，滴加二茂铁二氯化钯试剂，滴加完毕后，进行加热回流反应，待反应完毕后，将反应液吸出旋干，柱层析分离，得到化合物6；其合成路线如下：
[0020][0021]
(4)向圆底烧瓶中加入步骤(3)制备的化合物6，并加入化合物7和溶剂，氮气保护和无水条件下滴加二茂铁二氯化钯试剂，滴加完毕后，进行加热回流反应，待反应完毕后将反应液吸出旋干，柱层析分离，得到化合物8；其合成路线如下：
[0022][0023]
(5)向圆底烧瓶中加入步骤(4)制备的化合物8，并加入溶剂，接着将反应体系抽真空并用氮气置换三次，并在氮气保护和无水的条件下，加入碘甲烷，然后进行加热回流反应；待反应完毕后将反应液吸出旋干，柱层析分离，得到近红外荧光分子探针ⅰ，其合成路线如下：
[0024][0025]
所述步骤(1)中，溶剂为甲醇、冰醋酸、二氯甲烷、乙腈、n,n-二甲基甲酰胺、二甲亚砜中的一种或多种；化合物1与溶剂的质量体积比为(5～15)mmol:(30～50)ml；化合物1与化合物2的摩尔比为1:(0.5～1.5)；化合物1、30％双氧水和浓盐酸(36％～38％)的摩尔:体积:体积比为0.5mmol:(0.5～1.5)ml:(0.5～1.5)ml；反应时间为2～12h；纯化过程为：抽滤，饱和氯化钠水溶液洗涤，环己烷重结晶。
[0026]
所述步骤2)中，溶剂为三氟乙酸、二氯甲烷、乙醇、乙腈、四氢呋喃中的一种或多种，化合物3、化合物六次甲基四胺和溶剂的摩尔:摩尔:体积比为1mmol:(2～4)mmol:(2～4)ml；设定温度为80～100℃，回流反应时间为10～14h；纯化过程为：采用石油醚/二氯甲烷＝5/1，v/v，进行柱层析。
[0027]
所述步骤(3)中，溶剂为乙醇、甲醇、二氯甲烷、乙腈、四氢呋喃中的一种或多种，化合物4、化合物5和二茂铁二氯化钯的摩尔比为1:(0.5～1.5):(0.01～0.03)；化合物4、溶剂和饱和的naoh溶液的摩尔:体积:体积比为1mmol:(4～6)ml:(1～3)ml；加热温度为80～100℃，回流反应时间为10～14h。
[0028]
所述步骤(4)中，溶剂为甲苯、乙腈、n,n-二甲基甲酰胺、二甲亚砜中的一种或多种，化合物6、化合物7和二茂铁二氯化钯试剂的摩尔比为1:(0.5～1.5):(0.01～0.03)；化合物6与溶剂的摩尔体积比为1mmol:1～3ml；加热温度为80～100℃，回流反应时间为10～14h。
[0029]
所述步骤(5)中，溶剂为乙腈、n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、二甲亚砜中的一种或多种；化合物8与溶剂的摩尔体积比为1mmol:(10～30)ml；化合物8与碘甲烷的摩尔比为1:(8～12)；加热温度为80～100℃，回流反应时间为10～14h。
[0030]
所述的近红外荧光分子探针在作为阿尔茨海默症(ad)成像与治疗方面的应用。
[0031]
本发明的目的是提供一种诊断成像ad荧光探针试剂盒，该探针试剂盒中包括所述的近红外荧光分子探针。
[0032]
本发明的具有以下优点：
[0033]
本发明提供的诊断ad的荧光分子探针的制备方法简单，原料便宜易得，合成工艺简单，产率高，适合规模化生产以及推广运用。本荧光探针由于具有近红外荧光发射，可有效避免自吸收与生物背景荧光的干扰，可避免由于探针使用浓度、探针分布不均等导致的误差。此外，该探针在实际检测中，操作大幅简化，荧光背景信号低，信噪比高。本荧光探针响应快速，检测范围宽，灵敏度高，对于ad样本具有高选择性。本发明的探针在诊断ad方面具有广阔的应用前景。
附图说明
[0034]
图1实施例1中荧光探针ii的化学合成路线。
[0035]
图2实施例1中荧光探针探针ii核磁图。
[0036]
图3实施例2中荧光探针iii的化学合成路线。
[0037]
图4实施例3中荧光探针iv的化学合成路线。
[0038]
图5实施例1中荧光探针ii对不同细胞膜蛋白的响应图。
[0039]
图6实施例1中荧光探针ii的细胞活力测试图。
[0040]
图7实施例1中荧光探针ii的对四种脑细胞荧光染色实验图。
[0041]
图8实施例1中荧光探针ii的穿透血脑屏障实验图。
[0042]
图9实施例1中荧光探针ii对ad模型鼠脑部原位成像实验图。
[0043]
图10实施例1中荧光探针探针ii对ad模型鼠脑部冰冻切片染色实验图。
具体实施方式
[0044]
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
[0045]
实施例1
[0046]
荧光探针ii的合成
[0047]
本实施例制备的荧光探针结构式中的r1＝h，r2＝h。
[0048]
本实施例的合成技术路线如图1所示，具体包括以下步骤：
[0049]
化合物3的合成
[0050]
称取化合物1(1.96g，10mmol)置于250ml圆底烧瓶中，加入40ml甲醇，溶解后室温搅拌下滴入化合物2(1.25g，10mmol)，常温搅拌5h，在反应过程中，反应溶液逐渐由灰色浊液变为淡黄色澄清液体；tlc监测反应进程，原料暗点斑逐渐减少，出现相对极性更小的蓝色荧光点。待反应完毕后，将反应液倾入200ml水中，析出大量淡黄色色固体沉淀析出，减压抽滤得到淡黄色固体，并用饱和氯化钠水溶液洗涤3次，置于45℃烘箱中烘干，复溶于二氯甲烷后使用环己烷重结晶得到淡黄色固体粉末2.35g，产率90.0％。
[0051]
化合物4的合成
[0052]
将化合物3(0.24g 1mmol)用3ml三氟乙酸溶于圆底烧瓶中，加入六次甲基四胺(0.50g，3mmol)氮气保护，90℃加热回流12h。待反应完毕后，将反应液吸出旋干，采用石油醚/二氯甲烷＝5/1(v/v)柱层析分离，得到淡黄色固体粉末0.45g化合物4，产率67.0％。
[0053]
化合物6的合成
[0054]
称取化合物4(0.27g，1mmol)和化合物5(0.19g，1mmol)于圆底烧瓶中，加入5ml乙醇后，滴加饱和naoh水溶液2ml，接着在氮气保护和无水条件下，滴加二茂铁二氯化钯(10mg，0.02mmol)试剂，滴加完毕后，然后再移至90℃温度下进行回流反应12h；待反应完毕后将反应液吸出旋干，柱层析分离，得到淡黄色固体粉末0.45g，产率87.0％。
[0055]
化合物8的合成
[0056]
称取化合物6(0.45g，1mmol)、化合物7(0.13g，1mmol)和2ml甲苯加入圆底烧瓶中，接着在氮气保护和无水条件下，滴加二茂铁二氯化钯(10mg，0.02mmol)试剂，滴加完毕后，然后再移至90℃温度下进行回流反应12h。待反应完毕后将反应液吸出旋干，柱层析分离，得到淡黄色固体粉末0.45g，产率57.0％。
[0057]
荧光分子探针ii的合成
[0058]
称取化合物8(0.44g，1mmol)置于100ml圆底烧瓶中，加入20ml乙腈，将反应体系抽真空并用氮气置换三次，在氮气保护和无水的条件下，加入碘甲烷(0.11g，10mmol)，90℃搅拌12h；tlc监测反应进程，待反应完毕后，将反应液复溶于二氯甲烷中，旋干，采用干法上样，柱层析分离纯化(石油醚/二氯甲烷＝5/1,v/v)，得到黄色固体粉末0.52g，即为该例中的荧光分子探针ⅱ，其结构式如合成路线图1中所示，产率76.3％。
[0059]
本实施例中的荧光探针ⅱ的核磁谱图如图2所示，其谱图与探针ⅱ的结构式是完全对应的。
[0060]
实施例2
[0061]
荧光探针iii的合成
[0062]
本实施例制备的荧光探针结构式中的r1＝ch3，r2＝h。
[0063]
本实施例的合成技术路线如图2所示，具体包括步骤：
[0064]
化合物3的合成
[0065]
称取化合物1(1.96g，10mmol)置于250ml圆底烧瓶中，加入40ml甲醇，溶解后室温搅拌下滴入化合物2(1.40g，10mmol)，常温搅拌5h，在反应过程中，反应溶液逐渐由灰色浊液变为淡黄色澄清液体；tlc监测反应进程，原料暗点斑逐渐减少，出现相对极性更小的蓝色荧光点。待反应完毕后，将反应液倾入200ml水中，析出大量淡黄色色固体沉淀析出，减压抽滤得到淡黄色固体，并用饱和氯化钠水溶液洗涤3次，置于45℃烘箱中烘干，复溶于二氯甲烷后使用环己烷重结晶得到淡黄色固体粉末2.20g，产率85.0％。
[0066]
化合物4的合成
[0067]
将化合物3(0.24g 1mmol)用3ml三氟乙酸溶于圆底烧瓶中，加入六次甲基四胺(0.50g，3mmol)氮气保护，90℃加热回流12h。待反应完毕后，将反应液吸出旋干，采用石油醚/二氯甲烷＝5/1(v/v)柱层析分离，得到淡黄色固体粉末0.40g化合物4，产率61.0％。
[0068]
化合物6的合成
[0069]
称取化合物4(0.27g，1mmol)和化合物5(0.19g，1mmol)于圆底烧瓶中，加入饱和naoh水溶液2ml，接着在氮气保护和无水条件下，滴加二茂铁二氯化钯(10mg，0.02mmol)试剂，滴加完毕后，然后再移至90℃温度下进行回流反应12h。待反应完毕后将反应液吸出旋干，柱层析分离，得到淡黄色固体粉末0.45g，产率87.0％。
[0070]
化合物8的合成
[0071]
称取化合物6(0.45g，1mmol)、化合物7(0.13g，1mmol)和2ml甲苯加入圆底烧瓶中，接着在氮气保护和无水条件下，滴加二茂铁二氯化钯(10mg，0.02mmol)试剂，滴加完毕后，然后再移至90℃温度下进行回流反应12h。待反应完毕后将反应液吸出旋干，柱层析分离，得到淡黄色固体粉末0.45g，产率57.0％。
[0072]
荧光分子探针iii的合成
[0073]
称取化合物8(0.44g，1mmol)置于100ml圆底烧瓶中，加入20ml乙腈，将反应体系抽真空并用氮气置换三次，在氮气保护、无水的条件下加入碘甲烷(0.11g，10mmol)，90℃搅拌12h；tlc监测反应进程，待反应完毕后，将反应液复溶于二氯甲烷中，旋干，采用干法上样，柱层析分离纯化(石油醚/二氯甲烷＝5/1,v/v)，得到黄色固体粉末0.52g，即为该例中的荧光分子探针ⅲ，其结构式如合成路线图3中所示，产率76.3％。
[0074]
实施例3
[0075]
荧光探针iv的合成
[0076]
本实施例制备的荧光探针结构式中的r1＝ch3，r2＝ch3。
[0077]
本实施例的合成技术路线如图4所示，具体包括步骤：
[0078]
化合物3的合成
[0079]
称取化合物1(1.96g，10mmol)置于250ml圆底烧瓶中，加入40ml甲醇，溶解后室温搅拌下滴入化合物2(1.40g，10mmol)，常温搅拌5h，在反应过程中，反应溶液逐渐由灰色浊液变为淡黄色澄清液体；tlc监测反应进程，原料暗点斑逐渐减少，出现相对极性更小的蓝色荧光点。待反应完毕后，将反应液倾入200ml水中，析出大量淡黄色色固体沉淀析出，减压抽滤得到淡黄色固体，并用饱和氯化钠水溶液洗涤3次，置于45℃烘箱中烘干，复溶于二氯甲烷后使用环己烷重结晶得到淡黄色固体粉末2.20g，产率83.0％。
[0080]
化合物4的合成
[0081]
将化合物3(0.24g 1mmol)用3ml三氟乙酸溶于圆底烧瓶中，加入六次甲基四胺(0.50g，3mmol)氮气保护，90℃加热回流12h。待反应完毕后，将反应液吸出旋干，采用石油醚/二氯甲烷＝5/1(v/v)柱层析分离，得到淡黄色固体粉末0.47g化合物4，产率68.0％。
[0082]
化合物6的合成
[0083]
称取化合物4(0.27g，1mmol)和化合物5(0.19g，1mmol)于圆底烧瓶中，加入饱和naoh水溶液2ml，接着在氮气保护和无水条件下，滴加二茂铁二氯化钯(10mg，0.02mmol)试剂，滴加完毕后，然后再移至90℃温度下进行回流反应12h。待反应完毕后将反应液吸出旋干，柱层析分离，得到淡黄色固体粉末0.35g，产率67.0％。
[0084]
化合物8的合成
[0085]
称取化合物6(0.45g，1mmol)、化合物7(0.15g，1mmol)和2ml甲苯加入圆底烧瓶中，接着在氮气保护和无水条件下滴加二茂铁二氯化钯(10mg，0.02mmol)试剂，滴加完毕后，然后再移至90℃温度下进行回流反应12h。待反应完毕后将反应液吸出旋干，柱层析分离，得到淡黄色固体粉末0.50g，产率67.0％。
[0086]
荧光分子探针iv的合成
[0087]
称取化合物8(0.44g，1mmol)置于100ml圆底烧瓶中，加入20ml乙腈，将反应体系抽真空并用氮气置换三次，在氮气保护、无水的条件下加入碘甲烷(0.11g，10mmol)，90℃搅拌12h；tlc监测反应进程，待反应完毕后，将反应液复溶于二氯甲烷中，旋干，采用干法上样，柱层析分离纯化(石油醚/二氯甲烷＝5/1,v/v)，得到黄色固体粉末0.50g，即为该例中的荧光分子探针iv，其结构式如合成路线图4中所示，产率73.3％。
[0088]
实施例4
[0089]
荧光探针对不同细胞膜蛋白的响应情况
[0090]
由于bace1主要分布于细胞膜上，所以我们筛选四种细胞分别高表达或低表达bace-1：便于细胞层面验证，分别为n2a细胞(小鼠脑神经瘤细胞)、bend.3细胞(小鼠脑微血管内皮细胞，bbb主要成分)、u87-mg(人胶质母细胞瘤细胞)、hek293(人胚肾细胞)进行膜蛋白提取，观察探针对膜蛋白是否进行响应识别。
[0091]
从图5中可以看出，我们研究了探针ⅱ在水/dmso(ph＝7.4)的体系中对提取的不同细胞总蛋白的荧光响应。探针ⅱ的荧光光谱在380nm激发，在650nm处显示出强荧光。随着细胞膜蛋白的加入，在650nm处的新发射峰的荧光强度逐渐增强，是一个荧光增强型探针。
[0092]
实施例5
[0093]
荧光探针的mtt实验
[0094]
为了研究探针ⅱ的生物相容性，我们通过mtt检测法测定探针ⅱ的细胞毒性。如图6所示，指定浓度(0.0、3.125、6.25、12.5、25.0、50.0、75.0和100.0μm)的探针ⅱ处理后的细胞存活率均高于90％。这表明探针ⅱ对bend.3细胞具有低细胞毒性和良好的生物相容性，说明该探针对实验细胞系具有良好的生物相容性，可应用于后续的细胞实验。
[0095]
实施例6
[0096]
荧光探针的对四种脑细胞荧光染色实验：
[0097]
n2a细胞(小鼠脑神经瘤细胞)、bend.3细胞(小鼠脑微血管内皮细胞，bbb主要成分)、u87-mg(人胶质母细胞瘤细胞)、hek293(人胚肾细胞)均用10μm探针ⅱ处理2h。如图7所示，在380nm处激发，观察红光通道。同时，以商用细胞核跟踪器dapi为参照，用细胞共定位实验对成像区域进行评价。在相同条件下用dapi(2μg/ml)孵育。合并后的图像显示，探针的红色荧光与dapi的蓝色信号几乎没有共定位(图7)，说明探针ⅱ对bace1高表达细胞的细胞膜和细胞质具有良好的染色能力。证明探针ⅱ是bace1的有效成像探针。
[0098]
实施例7
[0099]
探针的穿透血脑屏障实验：
[0100]
在血-脑之间有一种选择性地阻止某些物质由血入脑的“屏障”存在，称为血脑屏障(bbb)。血脑屏障的功能在于保证脑的内环境的高度稳定性，但对药物递送和探针检测形成了障碍。由于bace1在大脑中具有活性，并与ad疾病密切相关。因此，如果想将探针应用于ad模型小鼠的原位检测，就必须对探针穿透血脑屏障的能力进行评估，我们使用transwell试剂盒进行试验。首先建立体外血脑屏障，实验采用transwell孔板，上室每孔接种10000个bend.3细胞，下室加入完全培基，每48h换液一次，使用跨内皮电阻仪(teer)测定电阻，待电阻值大于200ω/cm2，则成功建立体外血脑屏障，在下室接种u87-mg细胞，过夜贴壁后上室加入探针ⅱ，分别在1,2,4h后，用多聚甲醛固定下室细胞，pbs洗涤三次，加入dapi染色液对细胞核进行染色，pbs洗涤三次后荧光显微镜下观察，考察探针ⅱ跨体外bbb能力。从荧光染色图8中可以看出，下层的u87-mg细胞染色效果很明显，说明探针ⅱ可以穿透血脑屏障细胞，实现对下层细胞的染色。提示该探针可应用于ad模型小鼠的bace1原位检测。
[0101]
实施例8
[0102]
探针对ad模型鼠脑部原位成像实验：
[0103]
为进一步证实探针ⅱ在体内成像bace1的可行性，采用22月龄雄性ad模型(5xfad)小鼠和年龄匹配的野生型小鼠静脉注射探针ⅱ观察脑动力学。如图9所示，几乎所有的荧光信号都集中在脑室内，可以非常有效地捕捉到。特别是，在注射后120分钟，ad小鼠脑区探针ⅱ的荧光强度远高于野生型小鼠对照组，表明用探针ⅱ在体内特异性靶向bace1。此外，通过mtt分析，探针ⅱ的细胞活力证明了其良好的生物相容性。显然，这些直观的结果证实了探针ⅱ可以在体内跨越血脑屏障并标记bace1。探针注射2h后即可观察到ad模型鼠有较强的荧光，相比于正常小鼠，荧光要更为明显，表面本探针可以较快速的跨越血脑屏障且非常灵敏的检测ad。连续观测2h，4h，8h，24h的小鼠脑区探针ⅱ的荧光强度，证实该探针ⅱ可长时间原位脑部成像。
[0104]
实施例9
[0105]
探针对ad模型鼠脑部冰冻切片染色实验：
[0106]
接下来，用合成探针标记ad小鼠脑组织，获得海马区的显微镜图像。随后使用探针(5.0mm)评估ad小鼠脑组织中的bace1水平。图10显示了小鼠脑片的不同区域，如海马ca1区。从图10可以看出，这是ad模型鼠脑部切片的免疫荧光。证实探针ⅱ更容易聚集在脑部海马区域，这与bace-1在海马区域高表达是一致的，荧光共定位也证明了在小鼠脑组织中对bace-1具有良好的靶向性。这些结果表明，在ad小鼠脑内不同区域bace1的水平是不均匀的。众所周知，ad最重要的临床表现是记忆力减退。大脑中主要参与记忆处理的区域，如海马体和皮层，很可能首先受到疾病的影响病理学。从实验结果在图10中可以看出，在ad小鼠的海马和皮层区域的bace1水平高于其他区域，因此它可以认为bace1水平与ad的发病密切相关。

技术特征：
1.一种近红外荧光分子探针，其特征在于，其结构如式ⅰ所示：其中：r1为氢、甲基、氟、氯、溴、碘中的一种；r2为氢、卤素、烷基、烷氧基、胺基、二甲氨基中的一种。2.根据权利要求1所述的近红外荧光分子探针，其特征在于，其结构是如式ⅱ所示：3.一种根据权利要求1或2所述的近红外荧光分子探针的制备方法，包括以下步骤：(1)将化合物1置于圆底烧瓶中，接着加入溶剂进行溶解；然后依次加入化合物2、30％双氧水和浓盐酸，并在室温下进行反应，反应完毕后，将反应液倒入冰水中，使用氢氧化钠溶液调节ph至中性；此时大量黄色絮状物产生，抽滤，得到粗产物；将粗产物通过硅胶柱层析进行分离纯化，得到化合物3；其合成路线如下：(2)向圆底烧瓶中加入步骤(1)制备的化合物3，并加入化合物六次甲基四胺和溶剂，氮气保护，然后再移至设定温度下进行回流反应；待反应完毕后将反应液吸出旋干，柱层析分离，得到化合物4；其合成路线如下：(3)向圆底烧瓶中加入步骤(2)制备的化合物4，并加入化合物5和溶剂，并滴加饱和的naoh溶液，接着在氮气保护和无水条件下，滴加二茂铁二氯化钯试剂，滴加完毕后，进行加热回流反应，待反应完毕后，将反应液吸出旋干，柱层析分离，得到化合物6；其合成路线如
下：(4)向圆底烧瓶中加入步骤(3)制备的化合物6，并加入化合物7和溶剂，氮气保护和无水条件下滴加二茂铁二氯化钯试剂，滴加完毕后，进行加热回流反应，待反应完毕后将反应液吸出旋干，柱层析分离，得到化合物8；其合成路线如下：(5)向圆底烧瓶中加入步骤(4)制备的化合物8，并加入溶剂，接着将反应体系抽真空并用氮气置换三次，并在氮气保护和无水的条件下，加入碘甲烷，然后进行加热回流反应；待反应完毕后将反应液吸出旋干，柱层析分离，得到近红外荧光分子探针ⅰ，其合成路线如下：4.根据权利要求3所述的近红外荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，溶剂为甲醇、冰醋酸、二氯甲烷、乙腈、n,n-二甲基甲酰胺、二甲亚砜中的一种或多种；化合物1与溶剂的质量体积比为(5～15)mmol:(30～50)ml；化合物1与化合物2的摩尔比为1:(0.5～1.5)；化合物1、30％双氧水和浓盐酸的摩尔:体积:体积比为0.5mmol:(0.5～1.5)ml:(0.5～1.5)ml，其中浓盐酸的浓度为36％～38％；反应时间为2～12h；纯化过程为：抽滤，饱和氯化钠水溶液洗涤，环己烷重结晶。5.根据权利要求3所述的近红外荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中，溶剂为三氟乙酸、二氯甲烷、乙醇、乙腈、四氢呋喃中的一种或多种，化合物3、化合物六次甲基四胺和溶剂的摩尔:摩尔:体积比为1mmol:(2～4)mmol:(2～4)ml；设定温度为80～100℃，回流反应时间10～14h；纯化过程为：采用石油醚/二氯甲烷＝5/1，v/v，进行柱层析。6.根据权利要求3所述的近红外荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，溶剂为乙醇、甲醇、二氯甲烷、乙腈、四氢呋喃中的一种或多种，化合物4、化合物5和二茂铁二氯化钯的摩尔比为1:(0.5～1.5):(0.01～0.03)；化合物4、溶剂和饱和的naoh溶液的
摩尔:体积:体积比为1mmol:(4～6)ml:(1～3)ml；加热温度为80～100℃，回流反应时间为10～14h。7.根据权利要求3所述的近红外荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，溶剂为甲苯、乙腈、n,n-二甲基甲酰胺、二甲亚砜中的一种或多种，化合物6、化合物7和二茂铁二氯化钯试剂的摩尔比为1:(0.5～1.5):(0.01～0.03)；化合物6与溶剂的摩尔体积比为1mmol:(1～3)ml；加热温度为80～100℃，回流反应时间为10～14h。8.根据权利要求3所述的近红外荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中，溶剂为乙腈、n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、二甲亚砜中的一种或多种；化合物8与溶剂的摩尔体积比为1mmol:(10～30)ml；化合物8与碘甲烷的摩尔比为1:(8～12)；加热温度为80～100℃，回流反应时间为10～14h。9.根据权利要求1或2所述的近红外荧光分子探针在作为诊断ad药物中的应用。10.一种诊断成像ad荧光探针试剂盒，其特征在于，该探针试剂盒中包括权利要求1或2所述的近红外荧光分子探针。

技术总结
本发明公开了一种近红外荧光分子探针及其制备方法与应用，其结构如式Ⅰ所示：其中：R1为氢、甲基、氟、氯、溴、碘中的一种；R2为氢、卤素、烷基、烷氧基、胺基、二甲氨基中的一种。本发明提供的诊断AD的荧光分子探针的制备方法简单，原料便宜易得，合成工艺简单，产率高，适合规模化生产以及推广运用。本荧光探针由于具有近红外荧光发射，可有效避免自吸收与生物背景荧光的干扰，可避免由于探针使用浓度、探针分布不均等导致的误差。此外，该探针在实际检测中，操作大幅简化，荧光背景信号低，信噪比高。本荧光探针响应快速，检测范围宽，灵敏度高，对于AD样本具有高选择性。本发明的探针在诊断AD方面具有广阔的应用前景。阔的应用前景。阔的应用前景。


技术研发人员：曾文彬 毕桉耀 郑凡 吴军勇 丁季鹏 高峰 容鹏飞 张声旺 向大雄
受保护的技术使用者：中南大学
技术研发日：2021.12.28
技术公布日：2022/3/8