一种抗菌肽WR及其透明质酸包被物和应用

一种抗菌肽wr及其透明质酸包被物和应用
技术领域
1.本发明属于农业畜牧兽医应用领域，具体涉及一种抗菌肽wr及其透明质酸包被物和应用。


背景技术：

2.在饲料禁抗的大背景下，抗菌肽因其广谱抗菌及无耐药性的特性已成为代替饲用抗生素的潜力物质。抗菌肽具有独特的抑菌机理，即利用肽的两亲性(肽的氨基酸残基带有正电荷以及疏水特性)物理破坏细菌膜并使抗菌肽插入到脂质膜组分扰乱膜构象，干扰细菌正常代谢，最终形成细胞膜孔洞，造成细菌胞质内溶物流出而死亡。这种杀菌机制不参与细胞内的合成代谢，因此不会对细菌产生广谱耐药性。然而，抗菌肽作为一种小分子多肽，对动物胃肠道中各种蛋白酶非常敏感，这也是饲用型抗菌肽开发的瓶颈问题。因此，迫切需要开发一种能够抵抗蛋白酶水解的方法来延长抗菌肽的体内半衰期。


技术实现要素：

3.基于以上不足之处，本发明的目的是提供一种抗菌肽wr，是一种阳离子抗菌肽。本抗菌肽wr不但对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌等六种菌种有高效的抑制作用，而且具有很低的溶血活性和真核细胞毒性。
4.本发明所采用的技术方案如下：一种抗菌肽wr，其序列如seq id no.1所示。
5.本发明的另一目的在于提供该抗菌肽wr在制备治疗革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌感染性疾病药物中的应用。
6.本发明的另一目的是提供一种抗菌肽wr的透明质酸包被物，采用如下方法制得：向含有自组装纳米结构的如上所述的抗菌肽wr的溶液中加入阴离子透明质酸，使其发生静电结合，将抗菌肽wr包被，制得一种抗菌肽wr的透明质酸包被物。本发明以在不影响抗菌肽抑菌活性的基础上利用透明质酸的阴离子特性与阳离子抗菌肽残基发生静电结合，达到包被抗菌肽的目的，包被后的抗菌肽可以有效抵抗蛋白酶的水解，并且没有丧失抑菌活性。
7.进一步的，如上所述的一种抗菌肽wr的透明质酸包被物，采用如下方法制得：将抗菌肽wr稀释至自组装临界浓度，在37℃孵育18-24小时以形成自组装纳米结构，将阴离子透明质酸溶液加入到抗菌肽稀释液中，见溶液浑浊后停止滴加，搅拌至溶液澄清后至4℃冷藏备用。
8.进一步的，如上所述的一种抗菌肽wr的透明质酸包被物，采用如下方法制得：将抗菌肽wr冻干粉均匀溶解在超纯水中，随后超声5分钟后并迅速分装稀释至自组装临界浓度，抗菌肽wr稀释液在37℃孵育18-24小时以形成自组装纳米结构，将3.6mg阴离子透明质酸冻干粉溶解在5ml超纯水中，并超声至均一澄清，阴离子透明质酸的浓度为0.72mg/ml；随后将阴离子透明质酸溶液逐滴滴加至自组装纳米结构抗菌肽wr的溶液中，见溶液浑浊后停止滴加，滴加的阴离子透明质酸溶液：自组装纳米结构抗菌肽wr的溶液＝体积比3：1，继续搅拌至溶液均一澄清后置于4℃冷藏备用；最终，阴离子透明质酸终浓度为0.18mg/ml，抗菌肽wr
个/ml)于各孔中。分别设置阳性对照(含有菌液而不含有抗菌肽)和阴性对照(既不含菌液也不含抗菌肽)。37℃恒温培养14-18h，用酶标仪在492nm(od
492nm
)处测定光吸收值，确定最小抑菌浓度。检测结果见表2。
27.表2抗菌肽的抑菌活性
[0028][0029]
通过表2可以看出，wr对于革兰氏阴性和阳性菌表现出较高的抑菌活性。
[0030]
2、溶血活性的测定：采集人的新鲜血液1ml，肝素抗凝后溶解到2ml的pbs溶液中，3000rpm离心10min，收集红细胞；用pbs溶液洗涤3遍，再用10ml pbs溶液重悬；取50μl红细胞悬液与50μl不同浓度的抗菌肽溶液混合均匀，在37℃培养箱内恒温孵育1h；随后在4℃，3000rpm下离心10min；取出上清液用酶标仪在570nm处测定光吸收值。其中50μl红细胞加50μl pbs溶液作为阴性对照，50μl红细胞加50μl的0.1％tritonx-100作为阳性对照。最小溶血浓度是抗菌肽引起10％溶血率时的抗菌肽浓度。
[0031]
检测结果见图3，通过图3可以看出，wr在检测范围内未表现出溶血活性，在64μm浓度下造成1％的红细胞溶血，未能引起10％的红细胞溶血，与对照组蜂毒素呈显著性差异。通过表3可以看出，抗菌肽wr的选择指数高于具有强毒性的蜂毒素，表明抗菌肽wr具备开发成为饲用型抗菌肽的潜力。
[0032]
表3抗菌肽的mhc(μm)、gm(μm)和si值
[0033][0034]
3、真核细胞毒性的测定：采用mtt，并使用小鼠巨噬细胞raw264.7进行细胞毒性检测。
[0035]
(1)培养基的制备及细胞的培养：将dmem(培养基)与胎牛血清按9:1混合配置完全
培养基，并复苏液氮中的小鼠巨噬细胞raw264.7，以细胞长满瓶底(80％-90％)为宜。
[0036]
(2)待用细胞的试验处理：使用无菌pbs溶液清洗并重悬细胞3次，并用胰酶消化液对细胞消化处理，使其在瓶底脱落，随后用完全培养基冲洗，获得单个细胞悬液，同时在96孔板中填入50μl终浓度约为2
×
104的细胞悬液。
[0037]
(3)抗菌肽处理：96孔板第一孔内加10μl抗菌肽，取出50μl抗菌肽加入原96孔板的1-10孔并倍比稀释，11孔加50μl完全培养基，12孔加100μl完全培养基，恒温培养4h；
[0038]
(4)毒性检测：取50μl 5mg/ml mtt溶液加入96孔板，再培养3-4h后，加入150μl dmso(二甲基亚砜)，酶标仪od
570nm
测定吸光度。吸光度值越高，证明毒性越弱，反之亦然。
[0039]
检测结果见图4。通过图4可以看出，wr在检测范围内未表现出对小鼠巨噬细胞的毒性，在64μm浓度下小鼠巨噬细胞raw264.7的存活率达到100％，与对照组蜂毒素呈显著性差异。
[0040]
抗菌肽wr的透明质酸包被物的制备：将抗菌肽wr冻干粉溶解在经0.22μm过滤后的超纯水中，并充分振荡溶解均匀。随后超声5分钟后并迅速分装稀释至自组装临界浓度16μm，稀释液在37℃孵育18-24小时以形成自组装纳米结构。将3.6mg阴离子透明质酸冻干粉溶解在5ml经0.22μm过滤后的超纯水中，并超声至均一澄清，阴离子透明质酸溶液的浓度为0.72mg/ml。随后将阴离子透明质酸溶液逐滴滴加至自组装纳米结构抗菌肽wr的溶液中，见溶液浑浊后停止滴加，滴加的阴离子透明质酸溶液：自组装纳米结构抗菌肽wr的溶液＝体积比3：1，继续在磁力搅拌器下转动至溶液均一澄清后置于或4℃冰箱中备用；阴离子透明质酸终浓度为0.18mg/ml，抗菌肽wr终浓度为640μm。
[0041]
4、酶解稳定性的测定：将0.1％的木瓜蛋白酶与不同浓度的抗菌肽wr的透明质酸包被物在37℃孵育120分钟，30分钟和5分钟，然后按照本实施例步骤1中的抗菌肽的抗菌活性测定方法检测透明质酸包被的抗菌肽wr的抗菌活性。检测结果见表4。
[0042]
表4抗菌肽wr的透明质酸包被物与或不与木瓜蛋白酶孵育后的mic值
[0043][0044]
通过表4可以看出抗菌肽wr的透明质酸包被物的抗酶解能力得到显著增强，在与木瓜蛋白酶孵育2小时的时间内仍然可以保持较高的抗菌活性，证明阴离子透明质酸包被的抗菌肽wr可以进一步在体内开发应用。

技术特征：
1.一种抗菌肽wr，其特征在于，序列如seq id no.1所示。2.一种抗菌肽wr的透明质酸包被物，其特征在于，采用如下方法制得：向含有自组装纳米结构的如权利要求1所述的抗菌肽wr的溶液中加入阴离子透明质酸，使其发生静电结合，将抗菌肽wr包被，制得一种抗菌肽wr的透明质酸包被物。3.根据权利要求2所述的一种抗菌肽wr的透明质酸包被物，其特征在于，采用如下方法制得：将抗菌肽wr稀释至自组装临界浓度，在37℃孵育18-24小时以形成自组装纳米结构，将阴离子透明质酸溶液加入到抗菌肽稀释液中，见溶液浑浊后停止滴加，搅拌至溶液澄清后至4℃冷藏备用。4.根据权利要求2所述的一种抗菌肽wr的透明质酸包被物，其特征在于，采用如下方法制得：将抗菌肽wr冻干粉均匀溶解在超纯水中，随后超声5分钟后并迅速分装稀释至自组装临界浓度，抗菌肽wr稀释液在37℃孵育18-24小时以形成自组装纳米结构，将3.6mg阴离子透明质酸冻干粉溶解在5ml超纯水中，并超声至均一澄清，阴离子透明质酸的浓度为0.72mg/ml；随后将阴离子透明质酸溶液逐滴滴加至自组装纳米结构抗菌肽wr的溶液中，见溶液浑浊后停止滴加，滴加的阴离子透明质酸溶液：自组装纳米结构抗菌肽wr的溶液＝体积比3：1，继续搅拌至溶液均一澄清后置于4℃冷藏备用；最终，阴离子透明质酸终浓度为0.18mg/ml，抗菌肽wr终浓度为640μm。5.根据权利要求2-4任一项所述的一种抗菌肽wr的透明质酸包被物在制备治疗在蛋白酶的环境下革兰氏阴性菌或/和革兰氏阳性菌感染性疾病的药物中的应用。6.根据权利要求1所述的一种抗菌肽wr在制备治疗革兰氏阴性菌或/和革兰氏阳性菌感染性疾病的药物中的应用。

技术总结
本发明提供一种抗菌肽WR及其透明质酸包被物和应用，菌肽WR序列如SEQID No.1所示；同时提供了抗菌肽在制备治疗革兰氏阴性菌或/和革兰氏阳性菌感染性疾病的药物中的应用；向含有自组装纳米结构的抗菌肽WR的溶液中加入阴离子透明质酸，使其发生静电结合，制得包被物。同时提供了包被物在制备治疗在蛋白酶的环境下革兰氏阴性菌或/和革兰氏阳性菌感染性疾病的药物中的应用。本抗菌肽具有很低的溶血活性和真核细胞毒性，对包被了阴离子透明质酸的抗菌肽的酶解稳定性进行检测，在0.1mg/ml的木瓜蛋白酶存在下没有完全失活。综上所述，该抗菌肽具有较高的应用价值，具有替代饲用抗生素的前景。前景。前景。


技术研发人员：董娜 马清泉 方禹鑫 朱允惠 李玲
受保护的技术使用者：东北农业大学
技术研发日：2021.11.11
技术公布日：2022/3/8