一种自组装抗菌肽RW-suf及其自组装纳米胶束和应用

一种自组装抗菌肽rw-suf及其自组装纳米胶束和应用
技术领域
1.本发明涉及一种自组装抗菌肽rw-suf及其自组装纳米胶束和应用。


背景技术：

2.抗菌肽是一种基于阳离子特性并能够抑制或杀灭细菌的一种抗菌物质，具有抗菌性强、毒性低、无残留等优点，在体内主要抵抗病原体的入侵，帮助排除体内有害物质和突变细胞。与抗生素抑菌机制不同，大多数抗菌肽含有净正电荷和大量疏水性氨基酸残基，这有助于抗菌肽与细菌膜结合形成两亲性构象，导致细菌膜的膜渗透性增大或形成“孔”通道进而导致细菌细胞内溶物的流出而死亡。
3.然而，抗菌肽的设计方法是半经验的，而且一直受到合成成本的制约，这严重阻碍了抗菌肽的应用。此外，受到合成难度的影响，合成大分子长链多肽的难度要比合成短链多肽困难的多。因此，短链抗菌肽基序的设计正变得愈发重要。受到抗菌肽作用机制的启发，希望寻找一种方法可以在短时间内将抗菌肽迅速聚集以获得足够大的局部浓度，这对于杀菌活性格外重要。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种自组装抗菌肽rw-suf，自组装成胶束后可以提高抗菌活性，用于克服以上缺点。
5.本发明所采用的技术方案如下：一种自组装抗菌肽rw-suf，其序列为rrrrwwww。
6.本发明的另一目的在于提供如上所述的一种自组装抗菌肽rw-suf的自组装纳米胶束，纳米胶束组装方法如下：将菌肽rw-suf均匀溶解在超纯水中，稀释至临界自组装浓度16um，在37℃孵育18-24h以形成自组装纳米胶束。
7.本发明的另一目的是提供如上所述的抗菌肽rw-suf纳米胶束在制备治疗革兰氏阴性菌或/和革兰氏阳性菌感染性疾病的药物中的应用。
8.本发明的有益效果及优点如下：本抗菌肽能够以色氨酸拉链基序为基本单元自组装形成胶束结构并随着时间的推移形成纳米胶束；同时检测了纳米胶束的抑菌活性，溶血活性和细胞毒性，发现不但对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌等六种菌种有高效的抑制作用，而且具有较低的溶血活性和真核细胞毒性，该抗菌肽在64μm的浓度下造成1％的红细胞溶血，未能引起10％的红细胞溶血，小鼠巨噬细胞raw264.7的存活率达97％；此外，通过超声法破坏了纳米胶束的结构，发现降低了抗菌活性，证明纳米胶束的结构对抗菌活性的发挥至关重要。综上所述，该自组装抗菌肽是一种具有较高应用价值的抗菌肽，具备开发作为饲用型抗菌肽的潜力。
附图说明
9.图1为本发明的抗菌肽的高效液相色谱图。
10.图2为本发明的抗菌肽的基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱图。
11.图3为本发明的分子动力学模拟抗菌肽自组装图。
12.图4为本发明的抗菌肽在透射电镜下的表观图，(a)胶束,(b)纳米条带。
13.图5为本发明的抗菌肽在超声后的杀菌活性图。
14.图6为本发明的抗菌肽与蜂毒素me的溶血活性对比图。
15.图7为本发明的抗菌肽蜂毒素me对小鼠巨噬细胞的细胞毒性影响对比图。
具体实施方式
16.下面根据说明书附图举例对本发明做进一步的说明:
17.实施例1
18.抗菌肽的设计
19.抗菌肽rw-suf的氨基酸序列为：rrrrwwww；
20.本实施例以色氨酸拉链为基本基序，以表面活性剂结构为基本单元设计并构建出自组装抗菌肽，命名为rw-suf。抗菌肽的序列如表1所示。
21.表1氨基酸序列
[0022][0023]
利用固相化学合成法合成该抗菌肽，rw-suf的电荷数为为+4，疏水值为-0.15。该方法使抗菌肽满足自组装能力的同时，具有高效抑菌活性和较低的溶血活性，提高抗菌肽在细菌细胞和哺乳动物细胞之间的选择性，具有成为抗生素替代物的发展潜力。
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实施例2
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分子动力学模拟抗菌肽自组装
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自组装肽的pdb信息由pymol预先生成。通过添加六十个氯离子来平衡初始结构肽的表面电荷。将15个肽分子添加到一个5*5*5立方体的盒子中。应用gromacs软件包、opls-aa力场和spc 216水模型进行模拟计算。该过程在等温等距(nvt)中进行，时间步长为2fs。md-vv方法用于求解牛顿运动方程。非键相互作用的截止半径为1.2-1.4nm。pme方法用于处理长程静电相互作用。nose-hoover方法用于将系统温度保持在300k。在50ns的md模拟后进行计算。可以发现在长达50ns的模拟时间里，抗菌肽已经自组装形成了松散的纳米条状物。
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实施例3
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自组装抗菌肽的制备
[0029]
将抗菌肽冻干粉溶解在经0.22μm过滤后的超纯水中，并充分振荡溶解均匀。随后将抗菌肽母液超声5分钟后并迅速分装稀释至临界胶束浓度16um。抗菌肽稀释液在37℃孵育18-24小时以形成自组装纳米胶束。
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实施例4
[0031]
透射电镜观察抗菌肽的外貌
[0032]
将抗菌肽溶解在超纯水中并在室温孵育18-24小时。使用移液器吸取10μl溶液小心地滴加在铜网上并吸附2分钟，取出铜网立刻放置在浓度为0.2％的磷钨酸染料中染色2分钟。小心地取出铜网并在吸水纸上吸干溶液，放置在室温下干燥18小时。样品在透射电镜下观察抗菌肽的形貌特征，现在低倍视野下寻找到被染成黑色的区域，随后调整到高倍视
野并对准焦距，样品呈现白色，比例尺调整到1μm。可以观察到样品呈现白色球状胶束，均一紧实，表明抗菌肽已经成功地自组装形成了纳米胶束，随着孵育时间的延长，样品逐渐纵向延展形成纳米条带。
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实施例5
[0034]
抗菌肽抗菌活性的测定
[0035]
1、抗菌活性的测定：利用微量肉汤稀释法测定抗菌肽rw-suf的最小抑菌浓度。以2mg/ml的bsa(含0.01％乙酸)作为稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液100μl置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液(～105个/ml)于各孔中。分别设置阳性对照(含有菌液而不含有抗菌肽)和阴性对照(既不含菌液也不含抗菌肽)。37℃恒温培养14-18h，用酶标仪在492nm(od
492nm
)处测定光吸收值，确定最小抑菌浓度。检测结果见表2。
[0036]
表2抗菌肽的抑菌活性
[0037][0038][0039]
通过表2可以看出，抗菌肽rw-suf纳米胶束对于革兰氏阴性和阳性菌表现出较高的抑菌活性。
[0040]
2、超声后抗菌活性的测定：取适量冻存在-80℃的大肠杆菌保存液接种在mhb液体培养基中，在37℃，220rpm下复苏12h。将大肠杆菌复苏液接种在新的mhb培养基中并按照上述状态培养至对数生长期。将大肠杆菌溶液在3000rpm下离心5min收集菌体沉淀，并用10mm的pbs溶液洗涤3次，最后用pbs溶液重悬菌体并调整至浓度为od
600nm
＝0.1。将pbs溶液与超声了不同时间的自组装抗菌肽rw-suf纳米胶束混合后铺在96孔板内，倍比稀释至不同浓度后加入稀释后的大肠杆菌悬浊液。未加细菌悬浊液的为阴性对照孔，未加自组装抗菌肽的为阳性对照孔。然后将96孔板在漩涡振荡器下剧烈振荡1min，并放置在37℃下孵育2h。孵育结束后每孔取10μl反应液均匀地涂布在mha固体培养基上，放置在37℃下培养18-24h，通过反应体系计算每毫升内剩余的活菌数。试验三个平行并重复三次。结果见图5，结果表明，rw-suf纳米胶束在超声60s后菌落数显著增加，表明rw-suf纳米胶束的完整性对于其杀菌活性的发挥至关重要。
[0041]
3、溶血活性的测定：：采集人的新鲜血液1ml，肝素抗凝后溶解到2ml的pbs溶液中，3000rpm离心10min，收集红细胞；用pbs溶液洗涤3遍，再用10ml pbs溶液重悬；取50μl红细胞悬液与50μl不同浓度的抗菌肽溶液混合均匀，在37℃培养箱内恒温孵育1h；随后在4℃，
3000rpm下离心10min；取出上清液用酶标仪在570nm处测定光吸收值。其中50μl红细胞加50μl pbs溶液作为阴性对照，50μl红细胞加50μl的0.1％tritonx-100作为阳性对照。最小溶血浓度是抗菌肽引起10％溶血率时的抗菌肽浓度。检测结果见图6。通过图6可以看出，rw-suf在在64μm浓度下造成1％的红细胞溶血，未能引起10％的红细胞溶血，与对照组蜂毒素呈显著性差异。通过表3可以看出，抗菌肽rw-suf的选择指数高于具有强毒性的蜂毒素，表明抗菌肽wr具备开发成为饲用型抗菌肽的潜力。
[0042]
表3抗菌肽的mhc(μm)、gm(μm)和si值
[0043][0044]
4、真核细胞毒性的测定：采用mtt，并使用小鼠巨噬细胞raw264.7进行细胞毒性检测。
[0045]
(1)培养基的制备及细胞的培养：将dmem(培养基)与胎牛血清按9:1混合配置完全培养基，并复苏液氮中的小鼠巨噬细胞raw264.7，以细胞长满瓶底(80％-90％)为宜。
[0046]
(2)待用细胞的试验处理：使用无菌pbs溶液清洗并重悬细胞3次，并用胰酶消化液对细胞消化处理，使其在瓶底脱落，随后用完全培养基冲洗，获得单个细胞悬液，同时在96孔板中填入50μl终浓度约为2
×
104的细胞悬液。
[0047]
(3)抗菌肽处理：96孔板第一孔内加10μl抗菌肽，取出50μl抗菌肽加入原96孔板的1-10孔并倍比稀释，11孔加50μl完全培养基，12孔加100μl完全培养基，恒温培养4h；
[0048]
(4)毒性检测：取50μl 5mg/ml mtt溶液加入96孔板，再培养3-4h后，加入150μldmso(二甲基亚砜)，酶标仪od
570nm
测定吸光度。吸光度值越高，证明毒性越弱，反之亦然。检测结果见图7。
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通过图7可以看出，rw-suf在检测范围内未表现出对小鼠巨噬细胞的毒性，在64μm浓度下小鼠巨噬细胞raw264.7的存活率达到97％，与对照组蜂毒素呈显著性差异。

技术特征：
1.一种自组装抗菌肽rw-suf，其特征在于，其序列为rrrrwwww。2.根据权利要求1所述的一种自组装抗菌肽rw-suf的自组装纳米胶束，其特征在于，纳米胶束组装方法如下：将菌肽rw-suf均匀溶解在超纯水中，稀释至临界自组装浓度16um，在37℃孵育18-24h以形成抗菌肽rw-suf自组装纳米胶束。3.根据权利要求2所述的抗菌肽rw-suf纳米胶束在制备治疗革兰氏阴性菌或/和革兰氏阳性菌感染性疾病的药物中的应用。

技术总结
本发明提供一种自组装抗菌肽RW-suf及其自组装纳米胶束和应用，抗菌肽RW-suf的序列为RRRRWWWW。将菌肽RW-suf均匀溶解在超纯水中，稀释至临界胶束浓度16uM，在4℃孵育7天或37℃孵育18-24小时以形成自组装纳米胶束，通过超声法破坏了纳米胶束的结构，发现降低了抗菌活性，证明纳米胶束的结构对抗菌活性的发挥至关重要。本发明同时提供该自组装抗菌肽RW-suf纳米胶束在制备治疗革兰氏阴性菌或/和革兰氏阳性菌感染性疾病的药物中的应用。该自组装抗菌肽具有较低的溶血活性和真核细胞毒性，综上，该自组装抗菌肽是一种具有较高应用价值的抗菌肽，具备开发作为饲用型抗菌肽的潜力。具备开发作为饲用型抗菌肽的潜力。具备开发作为饲用型抗菌肽的潜力。


技术研发人员：董娜 方禹鑫 李玲 朱允慧
受保护的技术使用者：东北农业大学
技术研发日：2021.11.11
技术公布日：2022/3/8