抗PD-L1OX40双特异性抗体制剂及其制备方法和用途与流程

抗pd-l1/ox40双特异性抗体制剂及其制备方法和用途
技术领域
1.本发明涉及抗pd-l1/ox40双特异性抗体制剂领域。更具体而言，本发明涉及包含抗 pd-l1/ox40双特异性抗体的药物制剂，尤其是稳定的液体制剂、冻干制剂和重构的稳定液 体制剂，以及用于制备所述药物制剂的方法，以及所述药物制剂的治疗和/或预防用途。


背景技术：

2.药品稳定性是保证药品有效性和安全性的重要指标之一。获得良好的制剂处方是保证药 品在货架期内保持其有效性和安全性的关键条件。然而，由于抗体本身及其降解途径的复杂 性，目前尚不可能对优化抗体稳定性所需的制剂条件作出预测。尤其是考虑到，不同抗体通 常具有十分不同的cdr序列、不同的抗体结构，而这些序列及结构差异会导致不同抗体在溶 液中具有不同的稳定性性质。因此，基于对人用抗体在安全性和有效性上的严格要求，有必 要针对每个抗体单独进行最佳制剂配方的优化。
3.pd-l1在多数癌症组织中过量表达，pd-l1过表达，可以通过抑制ras及pi3k/akt信 号通路，进而调控细胞周期检查点蛋白和细胞增殖相关蛋白表达，最终导致t细胞增殖的抑 制。ox40(也称为cd134或tnfrsf4)是主要在活化t细胞(主要是cd4+效应t细胞以 及cd8+效应t细胞和调节性t细胞(treg))上表达的tnfr家族成员。ox40在许多实体 瘤(例如黑素瘤，肺癌和肾癌)中的cd4+效应t细胞以及cd8+效应t细胞和调节性t细 胞上过表达。在小鼠模型中，抗pd-l1/ox40双特异性抗体具有较好的抑制肿瘤作用，参见 例如：pct/cn2020/073959。
4.目前迫切需要一种抗pd-l1/ox40双特异性抗体制剂，能够保证药物长期保存过程中药 物质量、制剂工艺安全可靠、配方简单、注射方便。


技术实现要素：

5.发明概述
6.本发明通过提供含有抗pd-l1/ox40双特异性抗体的药物制剂来满足上述需求。本发明 的抗体制剂针对多种稳定性影响因素(诸如温度、反复冻融、振荡)，均表现出了优良的稳定 性。
7.在一个方面，因此，本发明提供了一种液体抗体制剂，其包含(i)抗pd-l1/ox40双特 异性抗体；(ii)缓冲剂，(iii)稳定剂，和(iv)表面活性剂。优选的，进一步包含螯合剂。
8.在一个实施方案中，抗pd-l1/ox40双特异性抗体由以下肽链#1和肽链#2组成：
9.式(i)：
10.肽链#1：vh-ch1-fc-x-vhh；和
11.式(ii)：
12.肽链#2：vl-cl；
13.其中：
14.vh表示重链可变区；
15.ch1表示重链恒定区结构域1；
16.fc包含重链恒定区结构域ch2、ch3，以及任选的ch4；
17.x可以不存在，或者在存在时表示接头；
18.vhh表示单结构域抗原结合位点；
19.vl表示轻链可变区；
20.cl表示轻链恒定区；
21.任选地，ch1和fc之间存在铰链区。
22.在一个实施例中，本发明pd-l1/ox40双特异性抗体包含下表所示序列：
23.抗pd-l1/ox40双特异性抗体肽链#1(示例性式(i)的多肽链)seq id no:1抗ox40抗体adi-20057vh(示例性式(i)的vh)seq id no:2ch1(示例性式(i)的ch1)seq id no:3fc(示例性式(i)的fc)seq id no:4接头(示例性式(i)的x)seq id no:5抗pd-l1单结构域抗体(示例性式(i)的vhh)seq id no:6抗pd-l1/ox40双特异性抗体肽链#2(示例性式(ii)的多肽链)seq id no:7抗ox40抗体adi-20057vl(示例性式(ii)的vl)seq id no:8cl(示例性式(ii)的cl)seq id no:9抗pd-l1单结构域抗体cdr1(示例性式(i)的vhh cdr1)seq id no:10抗pd-l1单结构域抗体cdr2(示例性式(i)的vhh cdr2)seq id no:11抗pd-l1单结构域抗体cdr3(示例性式(i)的vhh cdr3)seq id no:12ox40抗体部分vhcdr1(示例性式(i)的vh的hcdr1)seq id no:13ox40抗体部分vhcdr2(示例性式(i)的vh的hcdr2)seq id no:14ox40抗体部分vhcdr3(示例性式(i)的vh的hcdr3)seq id no:15ox40抗体部分vlcdr1(示例性式(ii)的vl的lcdr1)seq id no:16ox40抗体部分vlcdr2(示例性式(ii)的vl的lcdr2)seq id no:17ox40抗体部分vlcdr3(示例性式(ii)的vl的lcdr3)seq id no:18抗ox40抗体重链(示例性式(i)的vh-ch1-fc)seq id no:19
24.其中：
[0025][0026][0027]
在一个实施方案中，抗pd-l1/ox40双特异性抗体包含至少一条多肽链#1和一条多肽链 #2。优选地，本发明的抗体分子包含两条(例如相同的)多肽链#1和两条(例如相同的)多 肽链#2。
[0028]
在一个实施方案中，抗pd-l1/ox40双特异性抗体多肽链#1的vh-ch1-fc-x-vhh包含 seq id no:1或与其具有至少90％同一性的序列，多肽链#2的vl-cl包含seq id no:7的 氨基酸序列或与其具有至少90％同一性的序列。
[0029]
优选地，所述抗pd-l1/ox40双特异性抗体是pct申请号pct/cn2020/073959(国际
60 mg/ml，例如10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100mg/ml抗体蛋白；
[0042]
(ii)约5-50mm的组氨酸缓冲剂、枸橼酸缓冲剂，优选组氨酸缓冲剂,例如5-30mm， 例如5,10,15,20,25,30mm；
[0043]
(iii)约20-80mg/ml的山梨醇、蔗糖，优选山梨醇，例如，30、40、50、60mg/ml；
[0044]
(iv)约0.1-1mg/ml聚山梨酯80,例如,0.1,0.2.0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0mg/ml； 和
[0045]
(v)任选地，约0.005-0.05mg/ml的依地酸二钠，例如约0.008、0.009、0.010、0.012、 0.014、0.018mg/ml。
[0046]
其中所述液体制剂的ph为约5.0-6.0，例如，约5.5。
[0047]
例如，所述液体抗体制剂可以包含
[0048]
(i)约20-60mg/ml抗pd-l1/ox40双特异性抗体蛋白，例如20,30,40,50,55,60mg/ml；
[0049]
(ii)约10-20mm的组氨酸缓冲剂，例如20mm组氨酸缓冲液；
[0050]
(iii)约20-80mg/ml山梨醇，例如20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80mg/ml 山梨醇；
[0051]
(iv)约0.2-0.8mg/ml，例如0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8mg/ml，例如0.3-0.6mg/ml聚山 梨酯80；和
[0052]
(v)任选地，约0.008-0.018mg/ml的依地酸二钠，例如约0.008、0.009、0.010、0.012、 0.014、0.018mg/ml。
[0053]
其中所述液体制剂的ph为约5.0-6.0，例如，约5.5。
[0054]
在一个优选方案中，所述液体抗体制剂包含：
[0055]
(i)约40mg/ml的抗pd-l1/ox40双特异性抗体蛋白，10mm组氨酸，50mg/ml山梨醇， 0.2mg/ml聚山梨酯80，0.01mg/ml依地酸二钠ph 5.5；或
[0056]
(ii)约40mg/ml的抗pd-l1/ox40双特异性抗体蛋白，10mm组氨酸，50mg/ml山梨 醇，0.5mg/ml聚山梨酯80，0.01mg/ml依地酸二钠ph 5.5；或
[0057]
(iii)约40mg/ml的抗pd-l1/ox40双特异性抗体蛋白，10mm组氨酸，50mg/ml山梨 醇，0.7mg/ml聚山梨酯80，0.01mg/ml依地酸二钠ph 5.5；
[0058]
本发明的液体制剂可以长期稳定储存，例如至少24个月或更长时间。在一个实施方案中， 本发明的液体制剂可以在约-80℃至约45℃，例如-80℃、约-30℃、约-20℃、约0℃、约5℃、 约25℃、约35℃、约38℃、约40℃、约42℃或约45℃的条件下，储存至少10天、至少20 天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少 7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少18个 月、至少24个月，至少36个月，或更长时间，且是稳定的。
[0059]
在一个实施方案中，本发明的液体制剂可以稳定储存至少24个月。在一实施方案中，本 发明的液体制剂在至少40℃是稳定的。在一实施方案中，本发明的液体制剂在约2℃-8℃保 持稳定至少3个月，优选至少12个月，更优选至少24个月。在一个实施方案中，本发明的 液体制剂在室温或例如约25℃保持稳定至少2个月，优选至少3个月，更优选至少6个月。 在一实施方案中，本发明的液体制剂在约40℃保持稳定至少2周、优选至少1个月。
[0060]
在一个实施方案中，可以通过检测制剂的外观、可见异物、蛋白含量、浊度、纯度、
和/ 或电荷变异体的变化，来指示制剂的稳定性。在一个实施方案中，可以在高温胁迫的强制实 验中，例如在40℃
±
2℃储存至少1周、2周或优选地1个月后，或在加速实验中，例如在25℃
±
2℃ 储存至少1个月或2个月后，或在长期实验中，例如在5℃
±
3℃储存至少2个月或3个月后， 或在振荡实验中(例如在室温、避光650r/min条件下振荡5天)，和/或在冻融实验中(例如， 在-20℃/2-8℃反复冻融6次)，检测本发明液体制剂的稳定性。在一个实施方案中，相对于初 始值，例如储存第0天的初始值、或振荡或冻融实验前的初始值，检测本发明液体制剂的稳 定性。
[0061]
在一个实施方案中，在储存后，或在振荡实验后，或在冻融实验后，通过目视检查本发 明液体制剂的稳定性，其中本发明液体制剂在外观上保持为澄明至微乳光，为无色至淡黄色 液体，且无异物。在一个实施方案中，在澄明度检测仪下目视检查，制剂中无可见异物存在。 在一个实施方案中，在储存后，或在振荡实验后，或在冻融实验后，通过测定蛋白含量变化， 检查本发明液体制剂的稳定性，其中例如通过紫外分光光度(uv)法，相对于初始值，蛋白含 量变化率不超过20％，优选不超过10％，例如7-8％，更优选不超过5％，2％或1％。在一个 实施方案中，在储存后，或在振荡实验后，或在冻融实验后，通过测定本发明液体制剂的浊 度变化，检查本发明液体制剂的稳定性，其中例如通过od
350mm
法检测，相对于初始值，变 化值不超过0.06，优选地不超过0.05，更优选地不超过0.04，不超过0.02。在一个实施方案 中，在储存后，或在振荡实验后，或在冻融实验后，通过测定本发明液体制剂的纯度变化， 检查本发明液体制剂的稳定性，其中通过icief法，相对于初始值，单体纯度的变化值(或 主峰变化值)不超过10％，例如不超过5％、4％、3％、例如变化值不超过2％，优选不超过 1％。在一个实施方案中，在储存后，或在振荡实验后，或在冻融实验后，通过测定本发明 液体制剂的纯度变化，检查本发明液体制剂的稳定性，其中通过非还原型十二烷基硫酸钠毛 细管电泳(ce-sds)法，相对于初始值，单体纯度的变化值(或主峰变化值)下降不超过10％， 例如不超过5％、4％、3％,2％或1％。在一个实施方案中，在储存后，或在在振荡实验后， 或在冻融实验后，通过icief法，检测本发明液体制剂的稳定性，其中相对于初始值，抗体 的电荷变异体(主成分、酸性组分和碱性组分)的变化值总和不超过50％，例如不超过40％、 30％、20％、10％、5％，和/或主成分的变化值不超过20％,15％,10％,8％,5％。在一个实施方 案中，在储存后，或在振荡实验后，或在冻融实验后，通过直接elisa法，检测本发明液体 制剂的稳定性，其中相对于初始值，抗体的相对结合活性为70-130％，例如，70,80,90,93,95, 98,100,103,105,108,110,115,120,125,130％,优选90-110％。
[0062]
在一个实施方案中，本发明液体制剂在储存后，例如在25℃储存至少2个月后，或 在40℃
±
2℃储存1个月后，是稳定的，优选地具有如下特征之一或多项：相对于储存第 0天的初始值，
[0063]
(i)通过sec-hplc法测量，主峰变化值小于1％，和/或制剂具有大于96％的纯度， 优选大于97％、98％的纯度；
[0064]
(ii)通过非还原型ce-sds法测量，主峰变化值小于2％，和/或制剂具有大于96％ 的纯度，优选大于97％、98％的纯度；
[0065]
(iii)通过icief法测量，制剂中抗pd-l1/ox40双特异性抗体蛋白的各组分(主 成分、酸性组分和碱性组分)的变化值总和不超过40％和/或主成分的变化值不超过 20％，
[0066]
例如在40℃
±
2℃储存1个月后变化值总和不超过约40％(例如，不超过35％，
30％， 25％,20％,15％,10％)或主成分变化值不超过20％(例如，不超过15％,12％,10％,8％)， 或
[0067]
例如在25℃储存2个月后变化值总和不超过约20％(例如，不超过15％，14％,13％, 12％)或主成分变化值不超过约15％(例如，不超过10％，8％,7％,6％,5％)；
[0068]
(iv)通过elisa法测量，制剂中抗pd-l1/ox40双特异性抗体蛋白的相对结合活 性为70％-130％，例如，90,93,95,98,100,103,105,108,110,115,120％，例如90％
ꢀ‑
110％；
[0069]
在优选的实施方案中，本发明液体制剂在振荡和/或反复冻融下是稳定的。
[0070]
优选地，该制剂在振荡下或在反复冻融下是稳定的，例如，在室温避光650r/min 条件下振荡5天或在-20℃/2-8℃反复冻融6次后，具有如下特征之一或多项：
[0071]
(i)通过sec-hplc法测量，主峰变化值小于1％，和/或制剂具有大于96％的纯度， 优选大于97％、98％、99％的纯度；
[0072]
(ii)通过非还原型ce-sds法测量，主峰变化值小于1％，和/或制剂具有大于96％ 的纯度，优选大于97％、98％的纯度；
[0073]
(iii)通过icief测量，制剂中抗pd-l1/ox40双特异性抗体蛋白的各组分(主成 分、酸性组分和碱性组分)的变化值总和不超过2％；
[0074]
(iv)通过elisa法测量，制剂中抗pd-l1/ox40双特异性抗体蛋白的相对结合活 性为70％-130％，例如，90％-110％；
[0075]
在一个方面中，本发明的液体制剂为药物制剂，优选为注射剂，更优选为皮下注射剂或 静脉内注射剂。在一个实施方案中，所述液体制剂为静脉输注剂。
[0076]
另一方面，本发明提供了
ー
种固体抗体制剂，其是通过将本发明的液体抗体制剂经 固化处理而获得的。所述固化处理是通过例如结晶法、喷雾干燥法或冷冻干燥法实施 的。在一个优选的实施方案中，所述固体抗体制剂例如是冻干粉针剂形式。固体抗体 制剂可在使用前，通过重构于适当的溶媒中，形成本发明的重构制剂。所述重构制剂也是一 种本发明的液体抗体制剂。在一个实施方案中，所述适当的溶媒选自注射用水、注射用有机 溶剂，包括但不限于注射用油、乙醇、丙二醇等，或其组合。
[0077]
在一个方面，本发明提供了一种递送装置，其包含本发明的液体抗体制剂或固体抗体制 剂。在一个实施方案中，本发明的递送装置以包含本发明的液体抗体制剂或固体抗体制剂的 预填装注射器形式提供，例如用于静脉内、皮下、皮内或者肌内注射、静脉内输注。
[0078]
在又一方面，本发明提供向受试者，例如哺乳动物递送抗pd-l1/ox40双特异性抗体蛋 白的方法，包括给予所述受试者本发明的液体抗体制剂或固体抗体制剂的步骤，所述递送是 例如通过使用预填装注射器的递送装置实施的。
[0079]
在又一方面，本发明提供本发明的液体抗体制剂或固体抗体制剂的用途，用于制备在受 试者中治疗或预防疾病的递送装置(如，预填装注射器)或药物，所述疾病包括自身免疫病、 炎性疾病、感染、肿瘤、t细胞功能障碍性疾病，例如，所述肿瘤是癌症，例如具有升高的 表达水平的pd-1、pd-l1或pd-l2和/或具有降低的表达水平或活性的ox40的癌症，例如 结肠癌或直肠癌或结直肠癌或肺癌。
[0080]
本发明还提供了一种通过向受试者施用本发明的液体抗体制剂或固体抗体制剂或包含该 液体抗体制剂或固体抗体制剂的递送装置(如，预填装注射器)或药物,治疗受试
者的疾病， 例如上述肿瘤的方法。
[0081]
本发明的其它实施方案将通过参阅此后的详细说明而清楚明了。
[0082][0083]
发明详述
[0084][0085]
在详细描述本发明之前，应了解，本发明不受限于本说明书中的特定方法及实验条件， 因为所述方法以及条件是可以改变的。另外，本文所用术语仅是供说明特定实施方案之用， 而不意欲为限制性的。
[0086]
定义
[0087]
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域一般技术人员通 常所理解的含义相同的含义。为了本发明的目的，下文定义了以下术语。
[0088]
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数 字数值大5％的上限的范围内的数字数值。
[0089]
术语“和/或”当用于连接两个或多个可选项时，应理解为意指可选项中的任一项或可选项 中的任意两项或多项。
[0090]
如本文中所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意 其他要素、整数或步骤。在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也 涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的抗体可 变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。
[0091]
本文所用的术语“抗ox40抗体”、“抗ox40”、“ox40抗体”或“结合ox40的抗体”是指 这样的抗体，所述抗体能够以足够的亲合力结合(人或猴)ox40蛋白或其片段以致所述抗体可 以用作靶向(人或猴)ox40中的诊断剂和/或治疗剂。
[0092]
如本文所用的术语“程序性细胞死亡1配体1”、“pd-l1”、“程序性死亡配体1”、“分化簇 274”、“cd274”或“b7同系物1”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然pd-l1，所述任何脊 椎动物来源包括哺乳动物，诸如灵长类(例如，人)和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。
[0093]
在本文中，术语“抗体”以最广意义使用，指包含抗原结合位点的蛋白质，涵盖各种结构 的天然抗体和人工抗体，包括但不限于完整抗体和抗体的抗原结合片段。
[0094]“双特异性”抗体指具有两个抗原结合位点的抗体，所述的两个抗原结合位点中的每一个 抗原结合位点与相同抗原的不同表位或与不同抗原的不同表位结合。在一个实施方案中，双 特异性抗体，其具有针对第一抗原和第二抗原的结合特异性。
[0095]
术语“抗体制剂”指一种制备物，所述制备物处于允许作为活性成分的抗体的生物活性可 以有效发挥的形式，并且不含有对于待施用该制剂的受试者而言具有不可接受毒性的其它组 分。这类抗体制剂通常是无菌的。通常，抗体制剂中包含可药用赋形剂。“可药用”赋形剂是 可以合理地施用至受试哺乳动物以便制剂中所用活性成分的有效剂量可以递送至受试者的试 剂。赋形剂的浓度与施用模式相适应，例如可以是注射可接受的。
[0096]
术语“抗pd-l1/ox40双特异性抗体制剂”在本文中也简称为“本发明的抗体制剂”，意指包 含抗pd-l1/ox40双特异性抗体蛋白作为活性成分并包含可药用赋形剂的制备物。将抗 pd-l1/ox40双特异性抗体蛋白与可药用赋形剂组合后，作为活性成分的抗pd-l1/ox40双特 异性抗体蛋白适于治疗性或预防性施与人类或非人类动物。本发明的抗体制剂
可以例如制备 成水性形式的液体制剂，例如，即用预填装式注射器，或者制备成冻干制剂，在即将使用前 通过溶解和/或悬浮于生理可接受的溶液中进行重构(即，复溶)。在一些实施方案中，抗 pd-l1/ox40双特异性抗体蛋白制剂是液体制剂形式。
[0097]“稳定的”抗体制剂是指，制剂中的抗体在储存于特定条件下之后、或在振荡后、或在反 复冻融后保有可接受程度的物理稳定性和/或化学稳定性。尽管抗体制剂中所含的抗体在储 存、振荡或反复冻融之后可能不会100％维持其化学结构，但通常如果维持约90％、约95％、 约96％、约97％、约98％或约99％的抗体结构或功能，则认为抗体制剂是“稳定的”。在一些具 体的实施方案中，本发明的抗pd-l1/ox40双特异性抗体蛋白制剂在制造、制备、运输和长期 储存过程中表现出低至检测不到的抗体聚集或降解或化学修饰，从而极少或甚至是没有抗 pd-l1/ox40双特异性抗体蛋白的生物活性损失，表现出高度稳定性。在一些实施方案中，本 发明的抗pd-l1/ox40双特异性抗体蛋白制剂在储存、振荡和/或反复冻融后，基本上保留其 物理和化学稳定性。优选地，本发明液体制剂可以在室温或在40℃稳定至少2周，和/或在25℃ 稳定至少2个月，和/或在2-8℃稳定至少24个月。优选地，本发明液体制剂可以在室温避光 650r/min振荡5天后和/或在-20℃/2-8℃反复冻融1-6次后是稳定的。
[0098]
本领域已知多种分析技术可以用于测定蛋白质的稳定性，参见例如peptide and proteindrug delivery,247-301,vincent lee ed.,marcel dekker,inc.,new york,n.y.,pubs(1991)andjones,a.adv.drug delivery rev.10:29-90(1993)。可以在选定的温度和选定的储存时间测量 稳定性。例如，可以基于预期的制剂货架期来选择储存时间。备选地，可以使用加速稳定性 试验。在一些实施方案中，通过对抗体制剂进行各种胁迫测试来进行稳定性测试。这些测试 可以代表调配的抗体制剂在制造、储存或运输期间可能遭遇到的极端条件，也可以代表在非 制造、储存或运输期间可能使抗体制剂中的抗体的不稳定性加速的条件。例如，可以将经调 配的抗pd-l1/ox40双特异性抗体蛋白制剂充填至玻璃小瓶中以检验在高温胁迫下的抗体稳 定性。再例如，可以将经调配的抗pd-l1/ox40双特异性抗体蛋白制剂充填至玻璃小瓶中并在 室温避光650r/min条件下振荡5天后，检查抗体的稳定性。再例如，将将经调配的抗pd-l1/ox40 双特异性抗体蛋白制剂充填至玻璃小瓶中并在-20℃/2-8℃反复冻融1-6次后，检查抗体的稳定 性。
[0099]
经一段储存时间后、或经振荡一段时间后或经反复冻融多次后，制剂不显示聚集、沉淀、 混浊和/或变性；或显示非常少的聚集、沉淀、混浊和/或变性，则可以认为抗体在制剂中“保 持其物理稳定性”。由于制剂中抗体的聚集可以潜在地导致患者增加的免疫反应，从而导致安 全性问题。因此，需要使在制剂中的抗体聚集最小化或防止聚集。光散射法可以用于测定制 剂中的可见聚集物。sec-hplc可以用于测定制剂中的可溶性聚集物。此外，可以通过目视 检查制剂的外观、颜色和/或澄清度、或者通过od
350
nm法检测制剂的浊度、或者通过非还原 型ce-sds法测定制剂的纯度，来指示制剂的稳定性。在一个实施方案中，通过测定在特定温 度下储存特定时间之后或在振荡后或在反复冻融后制剂中的抗体单体的百分比来测量制剂的 稳定性，其中制剂中的抗体单体的百分比越高，则制剂的稳定性越高。
[0100]“可接受程度的”物理稳定性可以表示，于特定温度下储存特定时间之后，振荡后或反 复冻融后，在制剂中检测到至少约90％的抗pd-l1/ox40双特异性抗体蛋白单体。在一
些实施 方案中，在特定温度储存至少2周、至少28天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4 个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11 个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月或更久后，可接受程度的物理稳定性表示至少 约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的抗pd-l1/ox40双特异 性抗体蛋白单体。当评估物理稳定性时，药物制剂储存的特定温度可为约-80℃至约45℃的任 一温度，例如储存于约-80℃、约-30℃、约-20℃、约0℃、约4℃-8℃、约5℃、约25℃、约35℃、 约37℃、约40℃、约42℃或约45℃。例如，若储存于约40℃
±
2℃1个月或4周之后，检测到至 少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的抗pd-l1/ox40双特 异性抗体蛋白单体，则药物制剂视为是稳定的。若储存于约25℃2个月之后，检测到至少约 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的抗pd-l1/ox40双特异性 抗体蛋白单体，则药物制剂视为是稳定的。若储存于约5℃9个月之后，检测到至少约90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的抗pd-l1/ox40双特异性抗体蛋 白单体，则药物制剂视为是稳定的。
[0101]
经一段储存时间后、或经振荡一段时间后或经反复冻融多次后，如果制剂中的抗体不显 示显著的化学改变，则可以认为抗体在制剂中“保持其化学稳定性”。大多数化学不稳定性源 自于形成了抗体的共价修饰形式(例如，抗体的电荷变异体)。例如由天冬氨酸异构化、n和c 末端修饰，可以形成碱性变异体；由脱酰胺化、唾液酸化和糖化，可以产生酸性变异体。化 学稳定性可以通过检测和/或定量抗体的化学改变形式来评估。例如，可以成像毛细管等电聚 焦电泳(icief)检测制剂中抗体的电荷变异体。在一个实施方案中，通过测定在特定温度下储 存特定时间之后或经振荡后或反复冻融多次后制剂中抗体的电荷变异体百分比变化值来测量 制剂的稳定性，其中该变化值越小，则制剂的稳定性越高。
[0102]“可接受程度”的化学稳定性可以表示于特定温度下储存特定时间之后、或经振荡一段时 间后或经反复冻融多次后，制剂中电荷变异体(例如主成分或酸性组分或碱性组分)的百分 比变化值不超过40％，例如不超过30％、不超过20％；或电荷变异体(主成分、酸性组分和碱 性组分)的百分比变化值总和不超过60％，例如不超过50％、不超过30％。在一些实施方案中， 在特定温度储存至少2周、至少28天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少 5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12 个月、至少18个月、至少24个月或更久后，可接受程度的化学稳定性可以表现为主成分电荷 变异体的百分比变化值不超过约50％、40％、30％、20％、或15％；或电荷变异体的百分比变 化值总和不超过约60％、50％、或30％。当评估化学稳定性时，储存药物制剂的温度可为约-80℃ 至约45℃的任一温度，例如储存于约-80℃、约-30℃、约-20℃、约0℃、约4℃-8℃、约5℃、 约25℃或约45℃。例如，若在储存于5℃24个月之后，主成分电荷变异体的百分比变化值少 于约25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、 10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％，则药物制剂可被视为是 稳定的。若在储存于25℃2个月后，主成分电荷变异体的百分比变化值少于约20％、19％、18％、 17％、16％、15％、14％、13％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、 0.5％或0.1％，则药物制剂亦可被视为是稳定的。若在储存于40℃1个月之后，主成分电荷变 异体的百分比变化值少于约50％、40％、30％、20％、16％、15％、14％、13％、12％、10％、 5％或4％，则药物制剂亦可被视为是稳定的。
[0103]
术语“冻干制剂”是指通过液体制剂的冷冻干燥处理得到或能够得到的组合物。优选地， 其为具有少于5％、优选少于3％水含量的固体组合物。
[0104]
术语“重构制剂”是指将固体制剂(例如冻干制剂)溶解和/或悬浮于生理可接受的溶液中 得到的液体制剂。
[0105]
文中使用的术语“室温”是指15℃至30℃、优选20℃至27℃、更优选25℃的温度。
[0106]“胁迫条件”是指在化学和/或物理上不利于抗体蛋白的环境，所述环境可以导致不可接受 的抗体蛋白失稳定，例如，高温、振荡、冻融。“高温胁迫”是指，将抗体制剂置于室温或甚 至于更高温度(例如40℃
±
2℃)储存一段时间。通过高温胁迫加速试验，可以检查抗体制剂的 稳定性。
[0107]
如本文所使用，术语“肠胃外施用”意指肠内和局部给药以外的给药方式，通常通过注射 或输注方式，并且包括但不限于，静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、 腹膜内、经气管、皮下、表皮下(subcuticular)、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和 胸骨内注射以及输注。在一些实施方案中，本发明稳定的抗pd-l1/ox40双特异性抗体蛋白 制剂肠胃外施用于受试者。在一个实施方案中，本发明的抗pd-l1/ox40双特异性抗体蛋白 制剂以皮下、皮内、肌内或静脉内注射方式施用于受试者。
[0108]
i.抗体制剂
[0109]
本发明提供稳定的液体抗体制剂，其包含(i)抗pd-l1/ox40双特异性抗体，(ii)缓冲 剂，(iii)稳定剂，和(iv)表面活性剂，所述抗体制剂的ph为约5.0-6.0。在一个优选方案 中，本发明的液体抗体制剂是注射制剂形式。
[0110]
(i)抗pd-l1/ox40双特异性抗体
[0111]“抗pd-l1/ox40双特异性抗体”是指这样的抗体，所述抗体能特异性结合pd-l1和特异 性结合ox40的分子。
[0112]
在一个实施方案中，抗pd-l1/ox40双特异性抗体由以下肽链#1和肽链#2组成：
[0113]
肽链#1：
[0114]
vh-ch1-fc-x-vhh；和
[0115]
肽链#2：
[0116]
vl-cl；
[0117]
其中：
[0118]
vh表示重链可变区；
[0119]
ch1表示重链恒定区结构域1；
[0120]
fc包含重链恒定区结构域ch2、ch3，以及任选的ch4；
[0121]
x可以不存在，或者在存在时表示接头；
[0122]
vhh表示单结构域抗原结合位点；
[0123]
vl表示轻链可变区；
[0124]
cl表示轻链恒定区；
[0125]
任选地，ch1和fc之间存在铰链区。
[0126]
在一个实施方案中，抗pd-l1/ox40双特异性抗体包含至少一条多肽链#1和一条多肽链 #2。优选地，本发明的抗体分子包含两条(例如相同的)多肽链#1和两条(例如相同的)多 肽链#2。
[0127]
在一个实施方案中，抗pd-l1/ox40双特异性抗体多肽链#1的vh-ch1-fc-x-vhh包含 seq id no:1或与其具有至少90％同一性的序列，多肽链#2的vl-cl包含与seq id no:7 的氨基酸序列或与其具有至少90％同一性的序列。
[0128]
在一些实施方案中，本发明抗体制剂中的抗pd-l1/ox40双特异性抗体是igg形式的抗 体。“igg形式的抗体”是指抗体的重链恒定区所属于的igg形式。相同igg形式的所有抗体 的重链恒定区都是相同的，不同igg形式的抗体之间的重链恒定区不同。例如，igg2形式的 抗体是指其重链恒定区ig结构域为igg2的ig结构域。
[0129]
在一个优选的实施方案中，本发明抗体制剂中的抗pd-l1/ox40双特异性抗体是pct申 请号pct/cn2020/073959(国际申请日：2020年1月23日)中公开的。
[0130]
在一个实施方案中，该抗pd-l1/ox40双特异性抗体是由cho细胞重组表达产生并经纯 化的igg2型抗体。优选地，在本发明液体制剂中的所述抗体表现出显著的抗肿瘤活性。
[0131]
本发明的抗体制剂中所包含的抗体或其抗原结合片段的量可随着制剂的特定目的特性、 特定环境、和使用制剂的特定目的而改变。在一些实施方案中，抗体制剂为液体制剂，其可 含有约1-150mg/ml，优选地约10-100mg/ml，例如约10、15、20、25、30、35、40、50、 60、70、80、90或100mg/ml抗pd-l1/ox40双特异性抗体。
[0132]
(ii)缓冲剂
[0133]
缓冲剂是可以将溶液的ph维持在可接受范围的试剂。在一些实施方案中，用于本发明制 剂中的缓冲剂可以将本发明制剂的ph控制在大约5.0-6.0的ph范围，例如约5.0-5.5的ph。 在一些具体的实施方案中，本发明的抗体制剂具有约5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、 或5.8的ph。例如，本发明的抗体制剂具有ph为5.0-6.02，优选地ph为5.5。
[0134]
在一些实施方案中，本发明制剂包含选自以下的缓冲体系：组氨酸-盐酸组氨酸缓冲体系， 枸橼酸-枸橼酸钠缓冲体系，醋酸-醋酸钠缓冲体系，磷酸盐缓冲体系，优选组氨酸-盐酸组氨 酸缓冲体系。
[0135]
在一些实施方案中，用于本发明制剂中的缓冲剂为组氨酸缓冲剂，尤其是由组氨酸和盐 酸组氨酸组成的缓冲体系。在一些实施方案中，本发明的组氨酸缓冲剂中组氨酸的浓度为约 5-50mm，尤其是约5-30mm，例如，约5、10、15、20、25、30mm。在一个实施方案中， 本发明制剂包含约10mm组氨酸。
[0136]
(iii)稳定剂
[0137]
用于本发明的合适的稳定剂可以选自糖、多元醇和氨基酸及其组合。对于作为稳定剂的 糖包括但不限于蔗糖，海藻糖、麦芽糖及组合。对于作为稳定剂的多元醇包括但不限于山梨 醇、甘露醇、或其组合。对于作为稳定剂的氨基酸包括但不限于精氨酸、盐酸精氨酸、甲硫 氨酸、甘氨酸、脯氨酸及组合。
[0138]
在一个实施方案中，所述稳定剂选自多元醇(例如，山梨醇、甘露醇、或其组合)、糖类 (例如，蔗糖、海藻糖、麦芽糖、或其组合)、氨基酸(例如盐酸精氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、 脯氨酸及组合或其盐)、和它们的任意组合。在一个实施方案中，所述稳定剂包含约20-80mg/ml 的山梨醇，例如20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80mg/ml山梨醇。在一个实施 方案中，本发明制剂包含约50mg/ml山梨醇。
[0139]
(iv)表面活性剂
partitioning chromatography for anion exchange purification ofmonoclonal antibodies,biotechnology and bioengineering 101(2008)553
–
566)描述了两柱纯化 法，其中在蛋白a亲和色谱后使用弱分配阴离子交换树脂。
[0153]
一般，重组产生的单克隆抗体可以利用常规的纯化方法纯化，以提供具有足够的可重复 性和适度纯度的药物物质用于抗体制剂的配制。例如，在抗体从重组表达细胞分泌至培养基 中后，可以使用商业可得的蛋白浓缩过滤器例如amicon的超滤装置，浓缩来自该表达系统 的上清液。之后，可以使用例如色谱、透析和亲和纯化等方式进行抗体的纯化。蛋白a适应 于作为亲和配体用于纯化igg1、igg2和igg4型抗体。也可以使用其它抗体纯化方法，例如 离子交换色谱。在获得足够纯度的抗体后，可以按照本领域已知的方法，制备包含抗体的制 剂。
[0154]
例如，可以采用如下步骤进行制备：(1)在发酵结束后将发酵液离心澄清去除细胞等杂质 以获得上清；(2)使用亲和层析(例如对igg1、igg2和igg4型抗体具有特异亲和力的蛋白a 柱)捕获抗体；(3)进行病毒灭活；(4)精制纯化(一般可以采用cex阳离子交换层析)，以去除蛋 白中的杂质；(5)病毒过滤(使病毒滴度降低例如4log10以上)；(6)超滤/渗滤(可以用于将蛋 白置换于利于其稳定的制剂缓冲液中并浓缩至合适的浓度供注射用)。参见例如，b.minow,p. rogge,k.thompson,bioprocess international,vol.10,no.6,2012,pp.48
–
57。
[0155]
iii.制剂的分析方法
[0156]
生物制品稳定性研究一般包括实际贮存条件下的实时稳定性研究(长期稳定性研究)、 加速稳定性研究和强制条件试验研究。稳定性研究应根据研究目的和产品自身特性对研究条 件进行摸索和优化；针对各种影响因素(如温度、反复冻融、振动等)，制定长期、加速和/ 或强制条件试验等稳定性研究方案。加速和强制条件试验有利于了解产品在短期偏离保存条 件和极端情况下产品的稳定性情况，并为有效期和保存条件的确定提供支持性数据。
[0157]
在抗体制剂的储存、振荡或反复冻融过程中，抗体可能会发生聚集、降解或化学修饰， 导致抗体异质性(包括大小异质性和电荷异质性)以及聚集物和片段等，从而影响抗体制剂 的质量。因此，有必要进行抗体制剂稳定性的监测。
[0158]
在本领域中已知多种方法可以用于检测抗体制剂的稳定性。例如，可以通过还原型 ce-sds、非还原型ce-sds和sec-hplc等方法，分析抗体制剂的纯度和评估抗体的聚集水 平；可以通过毛细管等电聚焦电泳(cief)、成像毛细管等电聚焦电泳(icief)和离子交换色谱 (iex)等，分析抗体制剂中的电荷变异体。此外，可以通过目视检测制剂外观，快速地判 断制剂的稳定性。也可以使用od
350nm
法检测制剂的浊度改变，该方法可以给出有关可溶性 和不溶性聚集物量的信息。此外，可以使用紫外分光光度法(uv法)检测制剂中的蛋白质含量 变化。
[0159]
非还原型ce-sds法是一种以毛细管为分离通道进行的抗体纯度测定方法。在ce-sds 中，蛋白迁移由sds结合引起的表面电荷来驱动，而该表面电荷与蛋白质的分子量成正比。 由于所有的sds-蛋白质复合物都具有相似的质量-电荷比，故可以在毛细管的分子筛凝胶基 质中，实现基于分子的大小或流体动力学半径的电泳分离。该方法已经被广泛地用于监测变 性的完整抗体的纯度。一般，在非还原型ce-sds法中，供试样品与sds样品缓冲液
和碘乙 酰胺混合。之后，混合物可以于68-72℃孵育约10-15分钟，冷却至室温后离心的上清液用于 分析。采用紫外检测器检测蛋白的迁移，获得电泳谱图。抗体制剂纯度可以计算为igg主峰 的峰面积占所有峰面积之和的百分比。关于ce-sds法的进一步描述，可以参见例如richardr.等,application of ce sds gel in development of biopharmaceutical antibody-based products, electrophoresis,2008,29,3612-3620。
[0160]
体积排阻高效液相色谱法，即sec-hplc法，是用于抗体标准和质控的另一重要方法。 该方法主要依据分子的尺寸大小或流体动力学半径差异来进行分子的分离。通过sec-hplc， 抗体可以分离出三种主要形式：高分子量形式(hmms)、主峰(主要是抗体单体)、和低分子量 形式(lmms)。抗体纯度可以计算为色谱图上主峰面积占所有峰面积之和的百分比。通过 sec-hplc法，可以测量制剂产品中抗体单体的百分数，给出可溶性聚集物和剪切物的含量 信息。关于sec-hplc法的进一步描述，可以参见例如，j.pharm.scien.,83:1645-1650,(1994)； pharm.res.,11:485(1994)；j.pharm.bio.anal.,15:1928(1997)；j.pharm.bio.anal., 14:1133-1140(1986)。此外，也可以参见例如，r.yang等，high resolution separation ofrecombinant monoclonal antibodies by size exclusion ultra-high performance liquidchromatography(se-uhplc),journal of pharmaceutical and biomedical analysis(2015), http://dx.doi.org/10.1016/j.jpba.2015.02.032；和alexandre goyon等,protocols for the analyticalcharacterization of therapeutic monoclonal antibodies.i
–
non-denaturing chromatographictechniques,journal of chromatography，http://dx.doi.org/10.1016/j.jchromb.2017.05.010。
[0161]
可以通过icief测定抗体制剂中抗体的电荷变异体。在该测定法中，以比主峰(或主成 分)的保留时间更早从icief柱洗脱出的峰被标记为“酸性峰”(或酸性组分)，而那些以比主 峰的保留时间更晚从iciefc柱洗脱出的峰被标记为“碱性峰”(或碱性组分)。
[0162]
加速稳定性研究可以用于检查产品的稳定性性质，有利于筛选稳定药物制剂形式。例如， 可以将制剂样品放置于升高的温度，例如约40℃
±
2℃、25℃
±
2℃条件下进行加速稳定性研究。 此外，可以进行振荡实验或反复冻融实验来检测产品的稳定性性质。例如，在室温避光 650r/min振荡1-5天，进行振荡实验。例如，可以将在-30℃以下冻存产品一天后室温融化作 为一个冻融循环，进行反复冻融实验，其中可以实施1-6次反复冻融循环。产品稳定性的检 测指标可以包括外观、可见异物、蛋白含量、浊度、纯度(sec-hplc法、非还原型ce-sds 法)和电荷变异体(icief法、cex-hplc法)。此外，可以检测抗体的功效或生物活性。例 如，可以检测制剂中抗体与其抗原分子的结合能力。本领域技术人员已知多种方法可以用于 定量抗体与抗原的特异性结合，例如免疫测定试验，elisa等。
[0163]
iv.制剂的用途
[0164]
本发明的包含抗pd-l1/ox40双特异性抗体蛋白的本发明抗体制剂具有预防或治疗自身 免疫病、炎性疾病、感染、肿瘤、t细胞功能障碍性疾病，例如，所述肿瘤是癌症，例如具 有升高的表达水平的pd-1、pd-l1或pd-l2和/或具有降低的表达水平或活性的ox40的癌 症，例如结肠癌或直肠癌或结直肠癌或肺癌。
[0165]
本发明也提供了本发明的制剂在制备药物中的用途，其中所述药物用于向哺乳动物递送 抗pd-l1/ox40双特异性抗体蛋白。本发明还提供了本发明的制剂用于治疗或预防
一种或多 种上述疾病和病症的方法。优选地，哺乳动物是人。
[0166]
可以以多种途径将本发明的抗体制剂施用于受试者或患者。例如，施用可以通过输注或 通过注射器进行。因此，在一个方面，本发明提供了一种递送装置(例如注射器)，其包含本 发明的抗体制剂(例如，预填装注射器)。患者将接受有效量的抗pd-l1/ox40双特异性抗体 蛋白作为主要活性成分，即足以治疗、改善或预防目的疾病或病症的量。
[0167]
治疗效果可包括减少生理症状。用于任何特定受试者的抗体的最佳有效量和浓度将取决 于多种因素，包括患者的年龄、体重、健康状况和/或性别、疾病的性质和程度、特定抗体的 活性，身体对其清除率，并且也包括与所述抗体制剂组合施用的任何可能的其它治疗。对于 具体的情况，所递送的有效量可以在临床医师的判断范围内来确定。
[0168]
描述以下实施例以辅助对本发明的理解。不意在且不应当以任何方式将实施例解释成限 制本发明的保护范围。
[0169]
缩略词描述
[0170]
缩略词全称elisa酶联免疫吸附测定icief成像毛细管等电聚焦电泳nrce-sds非还原型十二烷基硫酸钠毛细管凝胶电泳sec-hplc体积排阻高效液相色谱hplc-fld高效液相色谱-荧光检测
实施例
[0171]
抗pd-l1/ox40双特异性抗体，是信达生物制药(苏州)有限公司自主研发的抗体，在 pct申请号pct/cn2020/073959中公开。
[0172]
为了开发出适用于该全人源抗体的长期稳定储存且简单易用的注射剂制剂处方，通过40℃ 强制稳定性实验，考察了不同ph值、不同稳定剂及表面活性剂的含量对于该抗体蛋白质量 的影响，最终筛选出有利于其稳定的制剂处方。整个研究过程中所用的材料和方法如下： 材料和方法
[0173]
1.1.本发明的制剂研究中使用的材料
[0174][0175]
注：n/a表示不适用。
[0176]
1.2.本发明的制剂研究中使用的仪器设备
[0177]
[0178][0179]
1.3.制剂稳定性的检测项目和检测方法
[0180]
整个研究过程中检测项目主要包括：(1)检测外观以及是否存在可见异物；(2)通过紫 外法(uv法)测定制剂中的蛋白质含量；(3)通过od
350
nm法检测制剂的浊度；(4)通过体积 排阻高效液相色谱法(sec-hplc)测定抗体制剂的纯度，表示为主峰的面积占所有峰面积 之和的百分数；(5)通过非还原型十二烷基硫酸钠毛细管电泳(非还原型ce-sds)测定抗体制 剂的纯度，表示为主峰的面积占所有峰面积之和的百分数；(6)通过icief法测定抗体制剂 中电荷变异体，表示为主成分、酸性组分和碱性组分的百分数；(7)通过直接elisa法测定 抗体制剂中抗pd-l1/ox40双特异性抗体对抗pd-l1/ox40双特异性抗体抗原的相对结合活 性；(8)通过hplc-fld测定抗体制剂中聚山梨酯80含量。
[0181]
可见异物检测
[0182]
按照国家药典委员会，中华人民共和国药典(2015年版，三部通则0904“可见异物检查 法”，北京：中国医药科技出版社.2015)中所记载的方法，采用澄明度检测仪(天津天大天发 生产，型号yb-2)和不溶性微粒检测仪(天津天大天发生产，型号gwj-8)，检查样品中的可见 异物。
[0183]
蛋白含量测定
[0184]
使用紫外分光光度计(日本岛津生产，型号uv-1800)或多通道微量分光光度计(美国thermo生产，型号nanodrop 8000)，测定样品中的蛋白质含量。
[0185]
浊度测定
[0186]
使用紫外分光光度计(日本岛津生产，型号uv-1800)，测定样品在350nm的吸光度，确 定样品浊度。
[0187]
纯度(sec-hplc法)
[0188]
使用体积排阻色谱柱分离，流动相为磷酸盐缓冲液(称取3.12g二水合磷酸二氢钠，8.77 g氯化钠和34.84g精氨酸，超纯水溶解后用盐酸调节ph至6.8并定容至1000ml)，色谱柱 保护液为0.05％(w/v)nan3，进样量50μl，流速0.5ml/分钟，采集时间30分钟，柱温25℃， 检测波长280nm。取待测样品用超纯水稀释至2mg/ml，作为供试品溶液。取制剂缓冲液用上 述相同处理方式稀释后做为空白溶液。取空白溶液、供试品溶液各50μl注入液相色谱仪，开 始检测。
[0189]
纯度(非还原型ce-sds法)
[0190]
采用毛细管凝胶电泳法检测。毛细管为无涂层毛细管，内径50μm，总长30.2cm，有效 长度20.2cm。电泳前分别使用0.1mol/l氢氧化钠、0.1mol/l盐酸、超纯水、电泳胶70psi 冲洗毛细管柱。将待测样品用适量超纯水稀释至2.0mg/ml，取以上稀释后的样品50μl于1.5 ml离心管中，分别向其中加入45μl ph 6.5的样品缓冲液(称取一水柠檬酸0.32g，十二水合 磷酸氢二钠2.45g，溶于45ml超纯水中，定容至50ml，制得柠檬酸-磷酸盐缓冲液，精密量 取该缓冲液200μl，加10％(w/v)十二烷基硫酸钠溶液80μl，加水至1ml，混匀，即得)、1μl 内标(10kda蛋白质，5mg/ml)(beckman coulter，货号：390953)和5μl 250mmol/l nem 溶液(称取n-乙基顺丁稀二酰亚胺62mg，溶于2ml超纯水中)，充分混匀后70
±
2℃加热10
±
2 分钟，冷却至室温后转移至样品瓶作为供试品溶液。取与供试品相同体积的制剂缓冲液，按 上述方法同样操作，制得空白溶液。样品进样条件：-5kv 20秒；分离电压：-15kv 35分钟。 毛细管柱温控制在25℃，检测波长为220nm。
[0191]
电荷变异体(icief法)
[0192]
采用等电点及电荷变异体(icief法)检测。利用770μl 3m尿素-0.5％mc溶液，44μl 两性电解质(ph 3-10)，55μl 5m ndsb溶液，22μl 0.5m taurine溶液，2.2μl pi marker 6.14， 2.2μl pi marker 9.46条件比例下配置预混液，在uv检测波长280nm检测。根据面积归一化 法，计算主成分、酸性组分、碱性组分的含量。
[0193]
聚山梨酯80含量(hplc-fld法)
[0194]
采用荧光检测色谱法(hplc-fld法)检测。使用0.15mol/l氯化钠，0.05mol/l三羟 甲基氨基甲烷，ph 8.0，5％乙腈，5.0μmol/l n-苯基-1-萘胺，15ppm 23聚氧乙烯脂肪醇醚， 等度洗脱，流速：1.5ml/min；采集时间：3分钟；压力上限：100bar；进样量：10μl；柱温： 30℃；检测波长：激发光350nm、发射光420nm。根据标准曲线法，计算聚山梨酯80含量。
[0195]
相对结合活性(直接elisa法)
[0196]
用人ox40抗原(购自sino)及人pd-l1抗原(购自promega)分别以0.5μg/ml，100μl/ 孔，4℃过夜包被96孔酶标板。洗板后加封闭液(2％bsa-pbst，300μl/孔)37℃封闭2h。 将梯度稀释的供试品以100μl/孔加入到弃去封闭液的酶标板中，设置阴性对照每孔只加100μl 稀释液(2％bsa-pbst)，37℃恒温培养箱中孵育60min。洗板后加入以2％bsa-pbst稀释 的hrp缀合山羊抗人igg-fc片段(美国bethyl，货号a80-104p)作为二抗(100000倍 稀释，100μl/孔)，37℃反应30min。洗板后每孔加入100μl tmb显色液，显色10min后， 每孔加入100μl的1mol/l h2so4终止反应。以620nm为参比波长，测450nm处的od值。 以各浓度梯度样品的浓度值作为横坐标，各梯度样品的od450 nm-od620 nm值为纵坐标， 应用prism四参数拟合计算ec
50
反映抗体与各抗原的结合活性。相对结合活性(％)＝(供 试品的ec
50
/参比品的
ec
50
)＊100％，其中所述参比品为未经任何胁迫处理的稳定的抗 pd-l1/ox40双特异性抗体。
[0197]
实施例1.制备和纯化抗pd-l1/ox40双特异性抗体
[0198]
根据pct申请号pct/cn2020/073959所述，获得抗pd-l1/ox40双特异性抗体。该抗体 具有seq id no：1的肽链#1序列和seq id no：7的肽链#2序列，为双特异性抗体。pct 申请号pct/cn2020/073959在此整体并入本文作为参考。
[0199]
简言之，抗体在cho细胞中重组表达并通过过滤、层析、病毒灭活、过滤等工艺进行纯 化。
[0200]
实施例2.ph筛选试验
[0201]
2.1实验步骤
[0202]
本实施例考察了ph(5.0～7.0)对实施例1的经纯化的抗pd-l1/ox40双特异性抗体稳定 性的影响，共设计了5个ph值，分别为5.0、5.5、6.0、6.5和7.0。
[0203]
配制10mm组氨酸，5％(w/v)山梨醇缓冲液，分别用盐酸将ph调节至5.0、5.5、6.0、 6.5和7.0，将抗pd-l1/ox40双特异性抗体超滤置换至上述不同ph值的缓冲液中，调节样 品蛋白含量至约30mg/ml；并加入聚山梨酯80，使其终浓度约为0.2mg/ml；过滤分装至2r 西林瓶中，加塞和轧盖。将上述样品置于40℃
±
2℃条件下进行稳定性考察，具体方案见表。
[0204]
表1.处方前研究实验方案
[0205][0206]
注：(1)√表示该点取样。(2)上述时间点取样后均先放入超低温冰箱中冻存待检，按需要化 冻送检。
[0207]
2.2判断标准
[0208]
根据对产品的认识以及仪器和方法的精密度，设定了样品检测指标数值与初始值相比质 量未发生变化的判断标准，用以判断样品是否发生了变化，具体见表2。
[0209]
表2.质量未发生变化的判断标准
[0210]
检测项目未发生变化的判断标准外观澄明至微乳光，无色至淡黄色液体，无异物可见异物符合《中华人民共和国药典》(2015年版，三部)通则0904蛋白含量(uv法)变化率≤10％浊度(od350nm法)变化值≤0.02纯度(sec-hplc法)主峰变化值≤1％纯度(nrce-sds法)主峰变化值≤2％电荷变异体(icief法)主成分及酸碱各组分变化值≤2％相对结合活性(直接elisa法)70～130％
聚山梨酯80含量(hplc-fld法)应为0.1～0.3mg/ml
[0211]
2.3实验结果
[0212]
处方前研究结果详见表。结果表明，40℃
±
2℃条件下放置1个月，各ph条件下的样品 外观、可见异物均合格；蛋白含量、聚山梨酯80、纯度(sec-hplc法和nrce-sds法)和 相对结合活性均未发生明显变化。所有样品浊度均超出判断标准。各样品电荷变异体-酸性组 分均明显上升，主成分均明显下降；除ph 5.0和ph 5.5条件外，其他条件下样品的碱性组分 均未发生明显变化；ph 5.5条件下样品电荷变异体-主成分的变化幅度相对较小。最终，确定 ph 5.5展开处方筛选实验。
[0213]
表3.处方前研究结果
[0214]
[0215]
[0216][0217]
实施例3.处方筛选实验
[0218]
3.1实验步骤
[0219]
本实施例主要考察不同缓冲体系(组氨酸缓冲体系和枸橼酸缓冲体系)和辅料(山梨醇、 蔗糖、盐酸精氨酸和依地酸二钠)对抗pd-l1/ox40双特异性抗体蛋白稳定性的影响，共设 计了6个处方，详细处方信息见表4。
[0220]
按照表4配制各个处方缓冲液，将抗pd-l1/ox40双特异性抗体蛋白超滤置换至对应处 方缓冲液中。置换完成后，调节各处方蛋白含量至约40mg/ml，加入聚山梨酯80，使其终浓 度约为0.2mg/ml；过滤分装至西林瓶，加塞、轧盖。上述样品于40℃
±
2℃条件下进行稳定 性考察，详细实验条件及取样计划见表5。
[0221]
表4.处方信息表
[0222][0223]
注：处方1～6均用盐酸调节ph。
[0224]
表5.稳定性考察方案
[0225][0226]
注：(1)*表示只对0天和1个月样品进行检测。(2)√表示该点取样。(3)上述时间点取样 后均先放入超低温冰箱中冻存待检，按需要化冻送检。
[0227]
3.2判断标准
[0228]
判断标准具体参见表2。
[0229]
3.3实验结果
[0230]
处方确定实验结果详见
[0231]
表。结果表明，40℃
±
2℃条件下放置1个月，除处方6因外观不合格未作检测，其余处 方样品外观、可见异物均合格；蛋白含量、聚山梨酯80和相对结合活性均未发生明显变化。 除处方2外，其余处方浊度均超出判断标准。处方3、处方4和处方5的纯度(sec-hplc 法)均下降，主要表现为蛋白聚合体和片段增多，其余处方未发生明显变化。处方2、处方3、 处方4的纯度(nrce-sds法)均下降，主要表现为蛋白聚合体和片段增多，其余处方未发生 明显变化。各处方电荷变异体-酸性组分均明显上升，主成分均明显下降，但处方2电荷变异 体-酸性组分、主成分的变化幅度相对较小。
[0232]
处方确定实验结果表明，处方2在浊度、纯度(sec-hplc法)和电荷变异体(icief 法)较优于其他处方。最终选定处方2展开后续实验。
[0233]
表5.处方确定实验结果
[0234]
[0235][0236]
实施例4.聚山梨酯80浓度研究
[0237]
4.1实验步骤
[0238]
本实施例主要考察不同聚山梨酯80浓度对抗pd-l1/ox40双特异性抗体蛋白稳定性的影 响，共设计了3个处方，详细处方信息见表。
[0239]
按照表配制处方缓冲液，将抗pd-l1/ox40双特异性抗体蛋白超滤置换至处方缓冲
液中。 置换完成后，调节各处方蛋白含量至约40mg/ml，加入不同终浓度的聚山梨酯80；过滤分装 至西林瓶，加塞、轧盖。上述样品于40℃
±
2℃条件下进行稳定性考察，详细实验条件及取样 计划见表。
[0240]
表6.处方信息表
[0241]
序号处方信息处方210mm组氨酸，50mg/ml山梨醇，0.2mg/ml聚山梨酯80，0.01mg/ml依地酸二钠ph 5.5处方710mm组氨酸，50mg/ml山梨醇，0.5mg/ml聚山梨酯80，0.01mg/ml依地酸二钠ph 5.5处方810mm组氨酸，50mg/ml山梨醇，0.7mg/ml聚山梨酯80，0.01mg/ml依地酸二钠ph 5.5
[0242]
表7.稳定性考察方案
[0243][0244]
注：仅检测最后一个点，中间点样品取样后冻存，暂不检测。
[0245]
4.2判断标准
[0246]
判断标准具体参见表。
[0247]
4.3实验结果
[0248]
聚山梨酯80浓度研究结果见表。结果表明，各条件下所有处方的外观、可见异物均合格； 蛋白含量、纯度(sec-hplc法和nrce-sds法)和电荷变异体均未发生明显变化，且处方 间无明显差异。
[0249]
表8.聚山梨酯80浓度研究结果
[0250]
[0251][0252]
综合上述实验结果及制剂处方开发平台经验，最终选定处方7为抗pd-l1/ox40双特异 性抗体制剂处方。确定抗pd-l1/ox40双特异性抗体制剂处方组成为：40.0mg/ml重组抗肿 瘤坏死因子受体超家族成员4(ox40)和抗程序性死亡配体1(pd-l1)双特异性抗体、10mm 组氨酸、50.00mg/ml山梨醇、0.01mg/ml依地酸二钠、0.5mg/ml聚山梨酯80，ph 5.5。
[0253]
实施例5.制剂稳定性考察实验
[0254]
5.1稳定性考察样品和方案
[0255]
参照nmpa(原cfda)《生物制品稳定性研究技术指导原则(试行)》、ich q5c《生物 技术/生物制品的稳定性试验》等有关指导原则，对重组抗肿瘤坏死因子受体超家族成员4 (ox40)和抗程序性死亡配体1(pd-l1)双特异性抗体的三批工艺和质量代表性成品均分 别进行了加速稳定性研究和强制条件试验研究。
[0256]
稳定性研究用样品信息如表9所示。抗pd-l1/ox40双特异性抗体成品的实际储存温度 为5℃
±
3℃，包装容器为西林瓶，包装规格为200mg(5ml)/瓶；抗pd-l1/ox40双特异性 抗体成品稳定性研究的包装容器与密闭系统与成品实际贮存的包装材料及装量完全一致。稳 定性考察条件、考察时间点、考察指标及质量标准如表10和表11。
[0257]
表9.样品信息
[0258]
成品批号生产工艺规模蛋白含量hh20200101中试工艺300l41.1mg/mlhh20200102中试工艺300 l41.5mg/mlhh20200103中试工艺300 l40.7mg/ml
[0259]
表10.制剂稳定性考察方案
[0260]
研究项目考察条件考察时间点加速稳定性研究25℃
±
2℃/60％rh
±
5％rh第0、1、2月强制条件试验40℃
±
2℃/75％rh
±
5％rh第0、2、4周
[0261]
表11.抗pd-l1/ox40双特异性抗体成品质量标准
[0262][0263]
5.2稳定性考察结果
[0264]
加速和强制条件下的稳定性结果分别见表12和13。稳定性数据和处方筛选结果，各项 检测结果趋势一致，表明既定的处方能够满足抗pd-l1/ox40双特异性抗体的贮存稳定性。
[0265]
表12.加速稳定性研究结果(25℃
±
2℃)
[0266]
[0267]
[0268][0269]
注：n/a表示该时间点无此检项。
[0270]
表13.强制稳定性研究结果(40℃
±
2℃)
[0271]
[0272][0273]
注：n/a表示该时间点无此检项
[0274]
以上描述了本发明的示例性实施方案，本领域技术人员应当理解的是，这些公开内容仅 是示例性的，在本发明的范围内可以进行各种其它替换、适应和修改。因此，本发明不限于 文中列举的具体实施方案。

技术特征：
1.一种液体抗体制剂，包含（i）抗pd-l1/ox40双特异性抗体蛋白；（ii）缓冲剂，（iii）稳定剂，和（iv）表面活性剂，其中所述抗pd-l1/ox40双特异性抗体蛋白由以下多肽链#1和多肽链#2组成：多肽链#1：vh-ch1-fc-x-vhh；和多肽链#2：vl-cl；其中：vh表示重链可变区；ch1表示重链恒定区结构域1；fc包含重链恒定区结构域ch2、ch3，以及任选的ch4；x可以不存在，或者在存在时表示接头；vhh表示单结构域抗原结合位点；vl表示轻链可变区；cl表示轻链恒定区；任选地，ch1和fc之间存在铰链区；或抗pd-l1/ox40双特异性抗体包含至少一条多肽链#1和一条多肽链#2，优选地，包含两条多肽链#1和两条多肽链#2；或vhh包含互补决定区域（cdr）vhh cdr1、vhh cdr2和vhh cdr3；其中所述vhh cdr1包含seq id no:10的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；所述vhh cdr2包含seq id no:11的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；所述vhh cdr3包含seq id no:12的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；和/或，所述vh包含互补决定区域（cdr）hcdr1、hcdr2和hcdr3，其中hcdr1包含seq id no:13的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；hcdr2包含seq id no:14的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；hcdr3包含seq id no:15的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；和/或，所述vl包含互补决定区域（cdr）lcdr1、lcdr2和lcdr3，其中lcdr1包含seq id no:16的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；lcdr2包含seq id no:17的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；lcdr3包含seq id no:18的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；优选地，所述液体抗体制剂的ph约为5.0-6.0，例如，ph为5.5
±
0.2，优选地ph为5.5。2.根据权利要求1所述的液体抗体制剂，特征在于所述液体抗体制剂中的抗pd-l1/ox40双特异性抗体蛋白的浓度为约1-100 mg/ml，优选地为约10-70 mg/ml，例如约10、15、20、25、30、35、40、50、55、60、70 mg/ml。3.根据权利要求1或2所述的液体抗体制剂，特征在于，所述液体抗体制剂包含选自组氨酸-盐酸组氨酸缓冲体系，枸橼酸-枸橼酸钠缓冲体
系，醋酸-醋酸钠缓冲体系，和磷酸盐缓冲体系的缓冲剂，优选地，所述液体抗体制剂中的缓冲剂选自组氨酸、盐酸组氨酸和它们的组合；优选地，所述缓冲剂的浓度为约5-50 mm，优选地为约5-30 mm，例如，约5、10、15、20、25、30 mm。4.根据权利要求1-3 中任何一项所述的液体抗体制剂，特征在于所述稳定剂选自多元醇（例如，山梨醇、甘露醇及其组合）、糖类（例如，蔗糖、海藻糖、麦芽糖及其组合）、氨基酸(例如精氨酸、盐酸精氨酸甲硫氨酸甘氨酸脯氨酸及组合)、和它们的任意组合，优选地，所述稳定剂为山梨醇；优选地，所述稳定剂为约20-80 mg/ml，例如，约20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80 mg/ml山梨醇。5.根据权利要求1-4中任何一项所述的液体抗体制剂，特征在于所述表面活性剂选自聚山梨酯类表面活性剂、泊洛沙姆、聚乙二醇或其组合，优选为聚山梨酯-80，优选地，所述表面活性剂的浓度为约0.1-1 mg/ml，优选地为约0.2-0.8 mg/ml，例如约0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mg/ml。6.根据权利要求1-4中任何一项所述的液体抗体制剂，特征在于进一步包含螯合剂，所述螯合剂选自依地酸二钠、氨基三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、柠檬酸、酒石酸、葡萄糖酸、羟乙基乙二胺三乙酸、二羟乙基甘氨酸，优选地，所述螯合剂选自依地酸二钠；优选地，螯合剂为约0.005-0.05 mg/ml，例如，约约0.008、0.009、0.010、0.012、0.014、0.018 mg/ml依地酸二钠。7.根据权利要求1-6中任何一项所述的液体抗体制剂，特征在于所述抗pd-l1/ox40双特异性抗体包含多肽链#1和多肽链#2，其中多肽链#1的vh-ch1-fc-x-vhh包含seq id no:1或与其具有至少90%同一性的序列，多肽链#2的vl-cl包含与seq id no:7的氨基酸序列或与其具有至少90%同一性的序列。8.根据权利要求1-7中任何一项所述的液体抗体制剂，特征在于所述抗pd-l1/ox40双特异性抗体在293细胞或cho细胞中重组表达。9.根据权利要求1-8中任何一项所述的液体抗体制剂，特征在于所述液体制剂为注射剂，优选用于皮下注射或静脉内注射，或者为输注剂，例如用于静脉内输注。10.根据权利要求1-9中任何一项所述的液体抗体制剂，其包含：（i）约1-150 mg/ml的抗pd-l1/ox40双特异性抗体蛋白，例如10-100 mg/ml，优选20-60 mg/ml，例如10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100 mg/ml抗体蛋白；（ii）约5-50 mm的组氨酸缓冲剂、枸橼酸缓冲剂，优选组氨酸缓冲剂, 例如5-30 mm，例如5, 10, 15, 20, 25, 30 mm；（iii）约20-80 mg/ml的山梨醇、蔗糖，优选山梨醇，例如， 30、40、50、60 mg/ml；（iv）约0.1-1 mg/ml聚山梨酯80, 例如, 0.1, 0.2. 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0 mg/ml；和（v）任选地，约0.005-0.05mg/ml的依地酸二钠，例如约0.008、0.009、0.010、0.012、0.014、0.018 mg/ml；其中所述液体制剂的ph为约5.0-6.0，例如，约5.5；例如，所述液体抗体制剂可以包含
（i）约20-60 mg/ml抗pd-l1/ox40双特异性抗体蛋白，例如20, 30, 40, 50, 55, 60 mg/ml；（ii）约10 mm的组氨酸缓冲剂；（iii）约20-80 mg/ml山梨醇，例如20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80 mg/ml山梨醇；（iv）约0.2-0.8 mg/ml，例如0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8 mg/ml，例如0.3-0.6 mg/ml聚山梨酯80；和（v）任选地，约0.008-0.018 mg/ml的依地酸二钠，例如约0.008、0.009、0.010、0.012、0.014、0.018 mg/ml；其中所述液体制剂的ph为约5.0-6.0，例如，约5.5；在一个优选方案中，所述液体抗体制剂包含：（i）约40mg/ml的抗pd-l1/ox40双特异性抗体蛋白，10 mm组氨酸，50 mg/ml山梨醇，0.2 mg/ml聚山梨酯80，0.01 mg/ml依地酸二钠，ph 5.5；或（ii）约40mg/ml的抗pd-l1/ox40双特异性抗体蛋白，10 mm组氨酸，50 mg/ml山梨醇，0.5 mg/ml聚山梨酯80，0.01 mg/ml依地酸二钠，ph 5.5；或（iii）约40mg/ml的抗pd-l1/ox40双特异性抗体蛋白，10 mm组氨酸，50 mg/ml山梨醇，0.7 mg/ml聚山梨酯80，0.01 mg/ml依地酸二钠，ph 5.5。11.根据权利要求1-10中任何一项所述的液体抗体制剂，其特征在于，该制剂在储存后，例如在25℃储存至少2个月后，或在40℃
±
2℃储存1个月后，是稳定的，优选地具有如下特征之一或多项：(i) 通过sec-hplc法测量，主峰变化值小于1%，和/或制剂具有大于96%的纯度，优选大于97%、98%的纯度；(ii) 通过非还原型ce-sds法测量，主峰变化值小于2%，和/或制剂具有大于96%的纯度，优选大于97%、98%的纯度；(iii) 通过icief法测量，相对于储存第0天的初始值，制剂中抗pd-l1/ox40双特异性抗体蛋白的各组分（主成分、酸性组分和碱性组分）的变化值总和不超过40%和/或主成分的变化值不超过20%，例如在40℃
±
2℃储存1个月后变化值总和不超过约40%(例如不超过30%)或主成分变化值不超过约20%(例如不超过15%)，或在25℃储存2个月后变化值总和不超过约20%(例如约15%)或主成分变化值不超过约15%(例如不超过约10%)；(iv) 通过elisa法测量，相对于储存第0天的初始值，制剂中抗pd-l1/ox40双特异性抗体蛋白的相对结合活性为70％-130％，例如，90％-110％；更优选地，该制剂在振荡和/或反复冻融下是稳定的。12.一种固体抗体制剂，其通过固化权利要求1-11中任何一项所述的液体抗体制剂而获得，所述固体抗体制剂例如是冻干粉针剂形式。13.递送装置，其包含权利要求1-12中任何一项的液体抗体制剂或权利要求13的固体抗体制剂。14.预填装注射器，其包含权利要求1-12中任何一项的液体抗体制剂或权利要求13的固体抗体制剂，用于静脉内注射或者肌内注射。15.根据权利要求1-12中任何一项的液体抗体制剂或权利要求13的固体抗体制剂的用
途，用于制备在受试者中升高pd-1、pd-l1或pd-l2表达水平和/或具有降低ox40表达水平的递送装置或预填装注射器或药物。16.根据权利要求1-12中任何一项的液体抗体制剂或权利要求13的固体抗体制剂的用途，用于制备在受试者中治疗或预防自身免疫病、炎性疾病、感染、肿瘤、t细胞功能障碍性疾病的递送装置或预填装注射器或药物，例如，所述肿瘤是胃肠道癌症，例如结肠癌。

技术总结
本发明涉及包含抗PD-L1/OX40双特异性抗体的制剂，尤其涉及包含抗PD-L1/OX40双特异性抗体、缓冲剂、稳定剂和表面活性剂的药物制剂。此外，本发明还涉及这些制剂的疾病治疗或预防用途。用途。


技术研发人员：朱兴贵 马一冬 汪音爵
受保护的技术使用者：信达生物制药（苏州）有限公司
技术研发日：2021.07.23
技术公布日：2022/3/8