一种超纯鲜活外泌体的制备方法与流程

1.本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种超纯鲜活外泌体的制备方法。


背景技术：

2.外泌体是指包含了复杂rna和蛋白质的小膜泡 (30-150nm)，其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。人体内多种细胞及体液均可分泌外泌体，包括内皮细胞、免疫细胞、血小板、平滑肌细胞等。当其由宿主细胞被分泌到受体细胞中时，外泌体可通过其携带的蛋白质、核酸、脂类等来调节受体细胞的生物学活性。
3.外泌体的提取主要包括以下几种方式：超速离心法，这是目前外泌体提取最常用的方法，此种方法得到的外泌体量多，但是纯度不足，电镜鉴定时发现外泌体聚集成块，由于微泡和外泌体没有非常统一的鉴定标准，也有一些研究认为此种方法得到的是微泡不是外泌体。过滤离心法，这种操作简单、省时，不影响外泌体的生物活性，但同样存在纯度不足的问题。密度梯度离心法，此种方法分离到的外泌体纯度高，但是前期准备工作繁杂，耗时，量少。免疫磁珠法，这种方法可以保证外泌体形态的完整，特异性高，操作简单，不需要昂贵的仪器设备，但是非中性ph 和非生理性盐浓度会影响外泌体生物活性。ps亲和法，该方法将ps（磷脂酰丝氨酸）与磁珠结合，利用亲和原理捕获外泌体囊泡外ps。该方法与免疫磁珠法相似，获得的外泌体形态完整，纯度最高。由于不使用变性剂，不影响外泌体的生物活性，外泌体可用于细胞共培养和体内注射。 色谱法，这种方法分离到的外泌体在电镜下大小均一，但是需要特殊的设备，应用不广泛。
4.申请号为cn201910338927.9的专利《含羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉及其制备方法》采用免疫磁珠法分离人羊膜间充质干细胞外泌体脐带进行间充质干细胞的分离，并将外泌体制备成冻干粉。申请号为cn201910532483.2的专利《基于间充质干细胞外泌体的水凝胶及其喷雾剂的制备方法》中外泌体是采用旋转超滤结合低温超速离方法收纯化集所得，制备水凝胶及其喷雾剂所得。上述外泌体是由传统细胞培养下所得，所得外泌体没有靶向性，且保存外泌体的方式如冻干粉及水凝胶会在一定程度上阻碍了外泌体作用的充分发挥。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种超纯鲜活外泌体的制备方法。
6.为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：一种超纯鲜活外泌体的制备方法，包括如下步骤:（1）选取间充质干细胞培养，待融合度长至75%-85%时，用双氧水处理24-48h，收取细胞上清液，离心去沉淀，取细胞上清；（2）将所述细胞上清进行超滤，获取粗提的细胞外泌体；（3）采用密度梯度离心法对所述粗提的细胞外泌体精细分离，获取超纯活外外泌
体。
7.本发明采用双氧水对培养的脐带间充质干细胞进行氧化处理后进行外泌体的获取，双氧水的浓度及作用时间决定了外泌体的成分组成，双氧水浓度过大及氧化时间过长会损伤脐带间充质干细胞，浓度过小无法达到刺激脐带间充质干细胞的目的。本发明筛选最优处理时间，获取氧化处理后的间充质干细胞外泌体，适量的氧化处理后细胞会激活损伤修复机制分泌的外泌体具有更高的抗氧化能力。
8.优选地，所述步骤（1）中间充质干细胞的培养方式为将p5-p10代间充质干细胞接种于10%胎牛血清的a-mem培养液，十字法摇匀后置细胞培养箱中培养，待融合度长至75%-85%时，将细胞转入含双氧水的10%胎牛血清的a-mem培养基中，置于细胞培养箱中培养24-48h。
9.优选地，所述步骤（1）中间充质干细胞选自脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞或脂肪间充质干细胞。
10.优选地，所述步骤（1）中双氧水的浓度为80-200um。
11.优选地，所述步骤（2）中超滤膜孔径为30kd的滤膜。
12.优选地，所述步骤（3）中30%蔗糖垫密度离心法包括如下步骤：配置30g/100ml（w/v）的蔗糖溶液，将上述（3）所获得的培养液加入蔗糖溶液，并进行密度梯度离心，800
×
g离心10分钟。
13.本发明采用超滤离心和密度梯度离心法结合进行外泌体的分离可获得高纯度的外泌体，超滤采用单种孔径30kd的滤膜进行过滤离心，去除细胞培养过程中的容易因此异种反应的蛋白质，密度梯度离心法采用30%蔗糖垫密度离心法，减少前期试剂耗材准备费时的缺点，高效获得高纯度的外泌体。
14.优选地，所述超纯活外外泌体采用保存液进行悬浮后保存。
15.优选地，所述步骤（4）中保存液配制方法为：在离心管中加入5%甘露醇（v/v）、40%乳酸钠林格注射液（v/v）、55%右旋糖苷40葡萄糖（v/v）、0.232ug/ml的褪黑素、50ug/ml维生素c、30ug/ml水蛭素，混匀后采用0.22um滤器过滤，得到保存液。
16.外泌体保存方式决定了外泌体应用的范围及产品的效果，本发明采用高活性的外泌体保存液，包含甘露醇、乳酸钠林格注射液、右旋糖苷40葡萄糖、褪黑素、维生素c和水蛭素，可高效保持外泌体活性，并可将保存的间充质干细胞外泌体应用到其他类型的产品中。
17.本发明提供了一种超纯鲜活外泌体，所述外泌体由上述制备方法制备而成。
18.相对于现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供了一种超纯鲜活外泌体的制备方法，采用双氧水刺激脐带间充质干细胞可促进细胞分泌含有抗氧化作用的外泌体，并且采用超滤离心和密度梯度离心，高效获取高纯度的外泌体，并研发了高活性外泌体保存液用以外泌体的长期保存。
附图说明
19.图1为本发明实施例1中脐带间充质干细胞的形态学检测；图2为本发明实施例1中人成纤维细胞的周期检测。
具体实施方式
20.下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
21.实施例1一种超纯鲜活外泌体的制备方法，包括如下步骤:（1）将p5代脐带间充质干细胞接种于10%胎牛血清的a-mem培养液，十字法摇匀后置细胞培养箱中培养，待融合度长至75%时，将细胞转入含80 um双氧水的10%胎牛血清的a-mem培养基中，置于细胞培养箱中培养24h，收取细胞上清液，离心去沉淀，取细胞上清；（2）将所述细胞上清孔径为30kd的超滤膜进行超滤，获取粗提的细胞外泌体；（3）准备30g/100ml（w/v）的蔗糖溶液，将上述获取的粗提的细胞外泌体加入蔗糖溶液，并进行密度梯度离心，800
×
g离心10分钟后，获取脐带间充质干细胞外泌体；（4）配置外泌体保存液，依次在离心管中加入以下比例成分， 5%甘露醇（v/v）、40%乳酸钠林格注射液（v/v）、55%右旋糖苷40葡萄糖（v/v）、1nm的褪黑素、50ug/ml维生素c、30ug/ml水蛭素，混匀后采用0.22um滤器过滤，加入获取的脐带间充质干细胞外泌体中，4度冷藏保存。
22.表1 脐带间充质干细胞的分子表达检测项目cd90cd73cd105cd14cd19cd45cd34hla-dr分子标记98.3%99.1%98.9%1.05%0.62%1.11%0.32%0.35%标准≥95%≥95%≥95%〈2%〈2%〈2%〈2%〈2%表1为脐带间充质干细胞的分子表达检测，结果显示间充质干细胞符合国际细胞治疗协会要求。
23.图1为实施例1中脐带间充质干细胞的形态学检测，由图可知所生长细胞贴壁，成梭形，符合间充质干细胞形态学要求。
24.接种成纤维细胞，采用10%fbs的dmem培养液进行培养，待细胞生长至融合度80%时，加入制备的超纯鲜活外泌体（0.1mg/ml），采用uva紫外线进行照射1小时后，消化细胞进行周期检测，图2为本发明实施例1中人成纤维细胞的周期检测，细胞周期可分为三期、即dna合成前期（g1期）、dna合成期（s期）与dna合成后期（g2期）。s期（synthesis）即dna合成期，在此期，除了合成dna外，同时还要合成组蛋白。dna复制所需要的酶都在这一时期合成。细胞的增殖效率一般s期占比多，说明细胞的增殖效率快，wmt组周期相对于uv组和对照组具有显著性的升高，结果显示外泌体可保护成纤维细胞uva照射的损伤，并可促进成纤维细胞s期的上升。
25.实施例2一种超纯鲜活外泌体的制备方法，包括如下步骤:（1）将p8代脂肪间充质干细胞接种于10%胎牛血清的a-mem培养液，十字法摇匀后置细胞培养箱中培养，待融合度长至80%时，将细胞转入含150um双氧水的10%胎牛血清的a-mem培养基中，置于细胞培养箱中培养36h，收取细胞上清液，离心去沉淀，取细胞上清；（2）将所述细胞上清孔径为30kd的超滤膜进行超滤，获取粗提的细胞外泌体；（3）准备30g/100ml（w/v）的蔗糖溶液，将上述获取的粗提的细胞外泌体加入蔗糖溶液，并进行密度梯度离心，800
×
g离心10分钟后，获取脂肪间充质干细胞外泌体；
（4）配置外泌体保存液，依次在离心管中加入以下比例成分， 5%甘露醇（v/v）、40%乳酸钠林格注射液（v/v）、55%右旋糖苷40葡萄糖（v/v）、1nm的褪黑素、50ug/ml维生素c、30ug/ml水蛭素，混匀后采用0.22um滤器过滤，加入获取的脂肪间充质干细胞外泌体中，4度冷藏保存。
26.实施例3一种超纯鲜活外泌体的制备方法，包括如下步骤:（1）将p10代骨髓间充质干细胞接种于10%胎牛血清的a-mem培养液，十字法摇匀后置细胞培养箱中培养，待融合度长至85%时，将细胞转入含200um双氧水的10%胎牛血清的a-mem培养基中，置于细胞培养箱中培养48h，收取细胞上清液，离心去沉淀，取细胞上清；（2）将所述细胞上清孔径为30kd的超滤膜进行超滤，获取粗提的细胞外泌体；（3）准备30g/100ml（w/v）的蔗糖溶液，将上述获取的粗提的细胞外泌体加入蔗糖溶液，并进行密度梯度离心，800
×
g离心10分钟后，获取骨髓间充质干细胞外泌体；（4）配置外泌体保存液，依次在离心管中加入以下比例成分， 5%甘露醇（v/v）、40%乳酸钠林格注射液（v/v）、55%右旋糖苷40葡萄糖（v/v）、1nm的褪黑素、50ug/ml维生素c、30ug/ml水蛭素，混匀后采用0.22um滤器过滤，加入获取的骨髓间充质干细胞外泌体中，4度冷藏保存。
27.以上所述，仅为本技术的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何在本技术揭露的技术范围内的变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。因此，本技术的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

技术特征：
1.一种超纯鲜活外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤:（1）选取间充质干细胞培养，待融合度长至75%-85%时，用双氧水处理24-48h，收取细胞上清液，离心去沉淀，取细胞上清；（2）将所述细胞上清进行超滤，获取粗提的细胞外泌体；（3）采用30%蔗糖垫密度离心法对所述粗提的细胞外泌体精细分离，获取超纯鲜活外泌体。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中间充质干细胞的培养方式为将p5-p10代间充质干细胞接种于10%胎牛血清的a-mem培养液，十字法摇匀后置细胞培养箱中培养，待融合度长至75%-85%时，将细胞转入含双氧水的10%胎牛血清的a-mem培养基中，置于细胞培养箱中培养24-48h。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中间充质干细胞选自脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞或脂肪间充质干细胞。4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中双氧水的浓度为80-200um。5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中超滤膜孔径为30kd。6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中30%蔗糖垫密度离心法包括如下步骤：配置30g/100ml（w/v）的蔗糖溶液，将粗提的细胞外泌体加入蔗糖溶液，并进行密度梯度离心，800
×
g离心10分钟。7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述超纯鲜活外泌体采用保存液进行悬浮后保存。8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述保存液配制方法为：在离心管中加入5%甘露醇（v/v）、40%乳酸钠林格注射液（v/v）、55%右旋糖苷40葡萄糖（v/v）、0.232ug/ml的褪黑素、50ug/ml维生素c、30ug/ml水蛭素，混匀后采用0.22um滤器过滤，得到保存液。9.一种超纯鲜活外泌体，其特征在于，所述外泌体由权利要求1-8任一所述的制备方法制备而成。

技术总结
本发明提供了一种超纯鲜活外泌体的制备方法，通过采用双氧水刺激间充质干细胞促进细胞分泌含有抗氧化作用的外泌体，并且采用超滤离心和密度梯度离心，高效获取高纯度的外泌体，并研发了高活性外泌体保存液用以外泌体的长期保存。长期保存。长期保存。


技术研发人员：程蕊苹
受保护的技术使用者：陕西佰傲干细胞再生医学有限公司
技术研发日：2021.11.12
技术公布日：2022/3/8