一种用于检测硝基还原酶的近红外荧光探针及应用

1.本发明涉及小分子探针技术领域，更具体的说是涉及一种用于检测硝基还原酶的近红外荧光探针及应用。


背景技术：

2.癌症已经成为导致人类死亡的重要原因之一。目前临床上治疗癌症最有效的手段为手术切除，然而如何精确识别肿瘤与正常组织的边界成为困扰临床医生的难题，因此发展用于肿瘤精确识别的方法具有重要意义。
3.缺氧，是肿瘤细胞的重要特点之一。在一些实体瘤中氧气浓度低，局部甚至低至0％。硝基还原酶(一种黄素蛋白酶)是缺氧肿瘤细胞中高表达的内源性还原酶，其表达程度的高低与肿瘤缺氧程度密切相关。硝基还原酶作为一种还原酶，在nadh/nadph作为氢供体存在的情况下，可以将含硝基的芳香衍生物还原为相应的羟胺或氨基衍生物。硝基还原酶水平上调被认为是缺氧的标志，也是肿瘤标志物。发展能够用于检测硝基还原酶在缺氧肿瘤中的表达情况的方法具有重要意义。
4.在硝基还原酶的研究中，荧光探针因其操作简单、灵敏度高和无与伦比的时空分辨率而受到广泛关注。到目前为止，已有许多“关-开”荧光探针用于检测硝基还原酶和肿瘤缺氧程度的报道。不幸的是，大多数探针发射在紫外和可见光谱范围(650nm以下)，受到背景自荧光和组织穿透深度能力弱的困扰。
5.因此，如何开发一种检测更为灵敏，操作简单的荧光探针是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明提供了一种用于检测硝基还原酶的近红外荧光探针及应用。
7.近红外荧光探针对于硝基还原酶的定量检测更有优势，具有穿透深度深、对生物样品损伤小的优点，对实现对硝基还原酶的检测，从而实现肿瘤成像分析，具有重要意义。
8.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
9.一种用于检测硝基还原酶的近红外荧光探针，化学结构式如下：
[0010][0011]
本发明还提供了上述的用于检测硝基还原酶的近红外荧光探针的制备方法，包括
以下步骤：
[0012]
(1)1，4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷的催化作用下、2-羟基-4-硝基苯甲醛和环己烯酮溶于甲醇中，加热回流，除去溶剂，层析得化合物3；
[0013]
(2)在浓硫酸中化合物3与化合物4(4-二乙氨基酮酸，cas:5809-23-4)反应后，倒入碎冰中搅拌，加入高氯酸搅拌，静置后抽滤得粗产物，层析得到近红外荧光探针zy-2；
[0014][0015]
优选的：步骤(1)1，4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷、2-羟基-4-硝基苯甲醛和环己烯酮的摩尔比为1:1～2:1～2；加热回流的时间为15～20h；层析：以体积比为1:2～3的乙酸乙酯和石油醚为洗脱剂，使用硅胶柱层析。
[0016]
优选的：步骤(2)浓硫酸的温度为60～90℃；化合物3、化合物4和硫酸的摩尔比为1：1～2：30～100；化合物3、4反应时间为1～3h；硫酸与碎冰的质量比为1:10～30，搅拌时间为2min；高氯酸的质量分数为70％，高氯酸与化合物3的摩尔比为1:5～10，搅拌时间为10～20min；静置的时间为1～3h；层析：以体积比1:20～30的甲醇和二氯甲烷为洗脱剂，使用硅胶柱层析。
[0017]
本发明还提供了上述的用于检测硝基还原酶的近红外荧光探针在hela细胞和hepg2细胞中硝基还原酶荧光成像中的应用。
[0018]
本发明还提供了上述的用于检测硝基还原酶的近红外荧光探针在小鼠肿瘤成像中的应用。
[0019]
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种用于检测硝基还原酶的近红外荧光探针及应用，取得的技术效果为本发明制备的荧光探针zy-2，在没有硝基还原酶的情况下，由于硝基的猝灭作用，探针本身的背景荧光可以忽略不计；而与硝基还原酶反应时，硝基被特异性还原为氨基，探针在740nm处发射出近红外荧光，从而达到对硝基还原酶的识别。细胞实验发现，探针可以通过检测硝基还原酶的表达情况来评估hela和hepg2细胞的缺氧程度。此外，探针zy-2也可以用于荷瘤小鼠肿瘤的成像分析。
附图说明
[0020]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本
nmr(100mhz，dmso-d6):δ197.2，155.6，149.2，134.6，134.6，130.9，128.3，127.7，117.4，110.9，75.5，38.9，29.4，17.5.hrms m/z:calcd for c13h10no4-[m-h]-m/z:244.0610；found:244.0616。
[0036][0037]
将10ml浓硫酸冷却至0℃，然后向浓硫酸中依次加入490mg化合物3(2mmol)和782mg化合物4(4-二乙氨基酮酸，2.5mmol)，反应液升温至70℃保持2小时。随后反应混合物倒进300克冰中搅拌2分钟，然后滴加1ml的高氯酸并不断搅拌，静止1h后，过滤收集沉淀并烘干，然后柱层析得到zy-2(黄色固体，300mg，产率30％)。1hnmr(400mhz，dmso-d6):δ7.96(d，j＝7.6hz，1h)，7.86(d，j＝9.2hz，1h)，7.79(t，j＝7.2hz，1h)，7.69(t，j＝7.6hz，1h)，7.59(d，j＝8.4hz，2h)，7.33(d，j＝7.6hz，2h)，6.38-6.52(m，3h)，5.14-5.24(m，1h)，3.35(t，j＝7.2hz，4h)，2.29-2.35(m，1h)，1.87-2.05(m，1h)，1.78-1.85(m，1h)，1.11(t，j＝7.2hz，6h).13c nmr(100mhz，cdcl3):δ169.6，154.4，152.0，151.7，149.4，147.9，143.4，134.9，129.8，129.7，129.2，128.6，127.4，127.2，125.1，123.3，117.3，117.3，111.2，110.9，109.1，104.2，97.0，85.5，74.1，44.4，28.2，19.9，12.5.hrms m/z:calcd for c31h27n2o6+[m+h]+:m/z 523.1869；found:m/z 523.1870.
[0038][0039]
实施例2
[0040]
探针zy-2的单晶的培养
[0041]
将50mg探针zy-2的溶于50ml体积比为1:1的二氯甲烷与乙酸乙酯的混和溶剂中，超声溶解后静置1小时，过滤取上层清液，将该清液分别置于10个10ml小瓶中，控制其密封程度让溶剂缓慢挥发，后得zy-2单晶。通过分析发现，探针分子以内酯结构存在，如图所示1。
[0042]
实施例3
[0043]
本发明探针zy-2的对硝基还原酶的响应性
[0044]
将探针zy-2用二甲基亚砜配置成1mm的储备液，硝基还原酶用ph 7.4的pbs缓冲溶液配制成200μg/ml的储备液，nadh用ph 7.4的pbs缓冲溶液配置成50mm的储备液。
[0045]
在浓度为10μm的探针zy-2的pbs溶液中，加入硝基还原酶1μg/ml后，探针的最大吸收位置由565nm红移到了605nm，并且吸收强度增加。在加入硝基还原酶之前，探针zy-2几乎不发荧光，而加入1μg/ml的硝基还原酶之后，探针在740nm处发射出强的荧光。
[0046]
实验结果表明，探针可以对硝基还原酶实现高灵敏度响应，如图2所示，其中，图2a为加入硝基还原酶前(a图)和之后(b图)探针的吸收谱图；图2b为加入硝基还原酶前(a图)
和之后(b图)探针的荧光发射谱图。
[0047]
在浓度为10μm的探针zy-2的pbs溶液中，伴随加入的硝基还原酶浓度的增加(浓度分别为0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90、1.00μg/ml)，探针在740nm处荧光强度逐渐增加，如图3a所示。探针在740nm处的荧光强度与硝基还原酶的浓度成良好的线性关系，如图3b所示。
[0048]
实施例4
[0049]
探针zy-2的选择性
[0050]
在浓度为10μm的探针zy-2的pbs溶液中，加入常见的金属离子，活性氧及氨基酸等物质，考察探针对硝基还原酶的选择性。如图4所示，在加入上述物质后，探针在740nm处的荧光几乎没有增强，说明探针对硝基还原酶具有高的选择性。
[0051]
实施例5
[0052]
探针zy-2的选择性
[0053]
使用浓度为10μm的探针zy-2孵育hela细胞和hepg2细胞，在不同含氧量的环境中，探针的荧光强度并不相同。环境含氧量越低，探针在细胞内荧光强度越强。图5为探针在不同含氧量条件下的hela细胞中的共聚焦成像，图6为hela细胞的荧光强度统计数值。图7为探针在不同含氧量条件下的hepg2细胞中的共聚焦成像，图5d为hepg2细胞的荧光强度统计数值。
[0054]
实验结果表明探针可以用于细胞缺氧程度的成像分析。
[0055]
实施例6
[0056]
探针zy-2用于小鼠肿瘤成像
[0057]
在荷瘤鼠的hela肿瘤内注射50μl浓度为200μm的探针zy-2，使用小动物活体成像仪拍照，发现30分钟时，肿瘤区域明显变亮，随着注射后时间延长，肿瘤区域的亮度增强，60分钟时达到最大亮度，而小鼠身体其他区域并没有发光的现象，说明探针zy-2可以应用于小鼠肿瘤的成像分析，如图6所示。
[0058]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0059]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

技术特征：
1.一种用于检测硝基还原酶的近红外荧光探针，其特征在于，化学结构式如下：2.权利要求1所述的用于检测硝基还原酶的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)1，4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷的催化作用下、2-羟基-4-硝基苯甲醛和环己烯酮溶于甲醇中，加热回流，除去溶剂，层析得化合物3；(2)在浓硫酸中化合物3与化合物4反应后，倒入碎冰中搅拌，加入高氯酸搅拌，静置后抽滤得粗产物，层析得到近红外荧光探针zy-2；3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述1，4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷、2-羟基-4-硝基苯甲醛和环己烯酮的摩尔比为1:1～2:1～2；加热回流的时间为15～20h；所述层析：以体积比为1:2～3的乙酸乙酯和石油醚为洗脱剂，使用硅胶柱层析。4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述浓硫酸的温度为60～90℃；所述化合物3、化合物4和硫酸的摩尔比为1：1～2：30～100；所述化合物3、4反应时间为1～3h；所述硫酸与碎冰的质量比为1:10～30，所述搅拌时间为2min；所述高氯酸的质量分数为70％，高氯酸与化合物3的摩尔比为1:5～10，所述搅拌时间为10～20min；所述静置的时间为1～3h；所述层析：以体积比1:20～30的甲醇和二氯甲烷为洗脱剂，使用硅胶柱层析。5.权利要求1所述的用于检测硝基还原酶的近红外荧光探针在hela细胞和hepg2细胞中硝基还原酶荧光成像中的应用。6.权利要求1所述的用于检测硝基还原酶的近红外荧光探针在小鼠肿瘤成像中的应用。

技术总结
本发明公开了一种用于检测硝基还原酶的近红外荧光探针及应用。涉及小分子探针技术领域。提供了近红外荧光探针的化学结构、制备工艺和应用。本发明制备的荧光探针ZY-2，在没有硝基还原酶的情况下，由于硝基的猝灭作用，探针本身的背景荧光可以忽略不计；而与硝基还原酶反应时，硝基被特异性还原为氨基，探针在740nm处发射出近红外荧光，从而达到对硝基还原酶的识别。细胞实验发现，探针可以通过检测硝基还原酶的表达情况来评估HeLa和HepG2细胞的缺氧程度。此外，探针ZY-2也可以用于荷瘤小鼠肿瘤的成像分析。鼠肿瘤的成像分析。鼠肿瘤的成像分析。


技术研发人员：申世立 曹晓群 张瑜
受保护的技术使用者：山东第一医科大学（山东省医学科学院）
技术研发日：2021.11.12
技术公布日：2022/3/8